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您当前的位置： Hsp16-3过表达的结核分枝杆菌H37Ra菌株的构建及其应用的制作方法
2021-02-02 02:02:06|
335|
起点商标网 hsp16-3过表达的结核分枝杆菌h37ra菌株的构建及其应用
技术领域
[0001]
本发明涉及基因工程研究领域，以及结核杆菌小分子热休克蛋白hsp16-3（以下简称hsp16-3）过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株h37ra菌株（以下简称h37ra菌）的构建及其应用。
背景技术：
[0002]
结核病是世界上严重威胁人类健康的传染性疾病。世界卫生组织(who)所发布的2019年全球结核病报告中显示，2018年，全球范围内据估约有1000万结核病新发病例，89%的患者为成年患者（≥15岁）。据估计，2018年hiv阴性患者因结核病死亡约120万例，hiv阳性患者因结核病死亡约25.1万例。卡介苗（bcg）是目前世界范围内唯一广泛使用的抗结核疫苗。虽然卡介苗控制儿童结核病十分有效，但对成人结核病的预防效果在不同地区表现出极大差异（0-80%）。随着耐药和耐多药结核病的出现与流行，迫切需要研发安全高效的结核病疫苗。
[0003]
全球约有1/3人口被结核杆菌潜伏感染，该人群在免疫力下降，尤其是免疫系统受到损害时，则会发展成为结核病，潜伏性感染者已成为结核病患者的一个重要来源。潜伏性结核感染以皮肤结核菌素试验阳性，及(或) γ干扰素释放试验阳性，而无活动性结核的临床表现为特点。结核杆菌hsp16-3与结核杆菌潜伏感染之间密切相关。结核杆菌在低氧或缺氧状态时会大量合成hsp16-3，当结核杆菌感染小鼠巨噬细胞后期，hsp16-3的表达量明显增多，t细胞可以特异性的识别hsp16-3，并将其从被感染的巨噬细胞中分离出来，这种反应在结核杆菌潜伏期则更为明显，这说明hsp16-3在结核杆菌潜伏性感染阶段扮演着重要的角色。
[0004]
hsp16-3对研发新型结核病疫苗有重要的科学价值。hsp16-3能够诱导特异性免疫反应，具有鼠和人的t淋巴细胞表位，是有效的亚单位疫苗的靶抗原。宿主对结核杆菌等细胞内寄生菌的防御主要依赖于有效的细胞免疫，其机制为被感染的巨噬细胞被细胞免疫因子所激活，尤其是由自然杀伤细胞和抗原特异性t细胞产生的γ干扰素。hsp16-3抗原能够部分活化结核菌素纯蛋白衍生物(ppd)试验阳性机体的外周血单核细胞和cd4+t淋巴细胞，诱导thl型细胞免疫反应，并分泌干扰素，有效清除结核杆菌；同时cd8+t淋巴细胞可以识别hsp16-3的多肽表位，活化的cd8+t淋巴细胞可以诱导产生γ干扰素和α干扰素，从而通过粒细胞溶解素和表位穿孔素溶解被结核杆菌感染的巨噬细胞，因此，对hsp16-3的研究可以为安全高效的新型结核病疫苗研究提供理论依据，尤其是对潜伏感染者可能起到有效预防作用。
[0005]
基于此，我们提出构建hsp16-3过表达的h37ra菌株，具有以下的优势：第一，hsp16-3过表达的h37ra菌株，可增强其免疫原性，可产生更好的免疫应答，提高对机体的免疫保护作用，有可能单独作为结核病疫苗使用；第二，为探索结核杆菌的致病机制及控制结核病的传播提供依据，同时为寻找抗结核药物靶标提供新的方向。
技术实现要素：
[0006]
发明的目的在于提供hsp16-3过表达的h37ra菌株的构建方法，并在hsp16-3基因功能研究的基础上，探讨对结核病的有效防治。
[0007]
本发明目的，一是构建hsp16-3过表达的h37ra菌株，用于结核病预防和新型结核病疫苗研发。
[0008]
本发明目的，二是提供构建hsp16-3过表达的h37ra菌株的方法，为深入探讨结核病的发病机制，以及hsp16-3基因功能的研究奠定基础。
[0009]
本发明目的，三是为hsp16-3过表达的h37ra菌株的生物特性、免疫保护性、毒性及安全性等研究奠定基础。
[0010]
其技术方案如下：hsp16-3过表达的h37ra菌株的制备，包括以下步骤：步骤1、结核分枝杆菌国际标准强毒株h37rv菌株(以下简称h37rv菌) 的培养及其悬液的制备分别取对数生长期h37rv菌液10ml，调整细菌浓度为3.5
×
107个/ml，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min 离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。
[0011]
步骤2、引物的设计与合成由genbank数据库中，查出h37rv菌hsp16-3基因序列，根据质粒pmv361图谱选择合适的酶切位点，并设计引物上游引物：5
’-ꢀ
cgc gga tcc atg gcc acc acc ctt c-3
’
含bamhⅰ酶切位点（gga tcc）下游引物：5
’-ꢀ
ccc aag ctt tca gtt ggt gga ccg g-3
’
含hindⅲ酶切位点(aag ctt)步骤3、目的基因的pcr扩增及鉴定以h37rv菌基因组dna为模版，扩增目的基因。扩增产物利用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）回收pcr扩增产物。在紫外灯下迅速从凝胶上切下相应的目的条带，使凝胶块充分溶解，分离出所需要的dna溶液。
[0012]
步骤4、pcr回收产物与t载体的连接 为了让扩增的目的片段，正确插入到pmv361质粒的预定酶切位点，先将回收后的pcr产物（hsp16-3基因片段）与t载体连接，连接反应条件为16℃反应过夜，以及25℃反应20min。
[0013]
步骤5、阳性转化子的pcr鉴定在超净台中，挑取lb平板中的若干个单菌落，至于ep管中，向其中加入lb液体培养基，摇床37℃震荡培养3h，做菌液pcr反应，反应完成后，对pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析筛选出阳性克隆，命名为t
-ꢀ
hsp16-3。
[0014]
步骤6、大肠杆菌e.coli dh5α感受态的制备取出实验室保存的大肠杆菌e.coli dh5α菌种，在lb平板（不含抗生素）上划线接种，37℃倒置培养过夜；在超净台中挑取单菌落接种到5ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜；吸取1000μl培养过夜的菌液，加入到100ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养至od600值为0.4-0.6（约3h）；吸取1.5ml菌液
至提前预冷的2ml离心管，冰上放置10min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清，向ep管中加入750μl预冷的0.1mol/l cacl2溶液，冰上放置15min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清，向ep管中加入100μl预冷的含20%甘油的0.1mol/l cacl2混合物，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，置于-80℃超低温冰箱，保存备用。
[0015]
步骤7、目的质粒的提取和测序、鉴定，由上海生工生物有限公司测序。
[0016]
步骤8、构建及鉴定重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3利用限制性内切酶muni/hindiii，酶切t
-ꢀ
hsp16-3和pmv361质粒。将酶切产物，经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳，检测后回收目的条带。回收后的t
-ꢀ
hsp16-3及pmv361质粒于4℃连接过夜，发生连接反应。然后，转入e.coli dh5α感受态细胞，利用pcr筛选阳性克隆，并命名为pmv361
-ꢀ
hsp16-3。
[0017]
步骤9、利用电穿孔技术将重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3电转化至h37ra菌将10μl重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3，与100μl新鲜的h37ra菌株感受态细胞混匀，冰上放置30min后，转移到预冷的1mm电击杯中，于2.1-2.5kv/cm条件下脉冲后，迅速转至含5ml 7h9液体培养基（无kana）的试管中，37℃培养48h，离心收集菌体后，用100μl上清悬浮菌体，涂至含0.03mg/lkana的l-j培养基，37℃培养3-4周，进行抗性筛选，并命名为h37ra：hsp16-3菌株。
具体实施方式
[0018]
下面对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0019]
实施例1 hsp16-3过表达的h37ra菌株的制备1.材料与方法1.1 主要试剂材料：h37ra菌，h37rv菌由中国药物生物制品检定所提供，本实验室保存；大肠杆菌e.coli dh5α由本实验室提供。大肠杆菌-结核杆菌穿梭表达载体pmv361由本实验室保存。限制性内切酶ecori 购自美国neb生物公司；限制性内切酶hind iii 美国neb生物公司；t4 dna连接酶 美国neb生物公司；2
×
pfu master mix 购自北京康为世纪公司；dna marker 购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司；质粒小提试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司；核酸染料gelview 购自北京百泰克生物技术有限公司；loading buffer购自日本takara公司；西班牙原装琼脂糖购自上海艾研生物科技有限公司；50
×
tae购自上海生工生物有限公司；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限公司；oxoid胰蛋白胨 购自英国tryptone 公司；oxoid酵母提取物购自英国tryptone 公司；去离子水购自北京康为世纪公司；nacl购自上海生物工程有限公司；蛋白酶k购自上海生物工程有限公司；溶菌酶购自上海生物工程有限公司； rnase 购自上海凯博生物有限公司；sds购自美国sigma公司；酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）购自索莱宝科技有限公司；1
×
te购自上海生物工程有限公司； rneasy plus universal mini kit购自德国qiagen公司；quantitect reverse transcription购自德国qiagen公司；revertaid first strand cdna synthesis ki购自美国thermo公司；5
×
tbe购自上海生工生物有限公司；1.2 主要实验仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室提供
research可调式单道移液器购自德国eppendorf公司；mls3750型高压灭菌器购自日本三洋公司；普通离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；电转仪购自德国eppendorf公司；scs-24摇床购自上海市离心机械研究所；dyy-4型电泳仪购自北京六一厂；bio-rad梯度pcr仪、bio-rad 凝胶成像仪购自美国伯乐公司；170s型co2培养箱购自英国galaxy公司；2-16k高速冷冻离心机购自德国sigma公司；millipore超纯水装置来源于美国millipore公司；synyo低温冰箱购自日本 synyo 公司；thermo scientific1300型二级生物安全柜、nanodrop 2000型紫外分光光度计购自美国thermo fisher scientific公司。
[0020]
2. 实验方法2.1培养h37rv菌将h37rv菌复苏并别接种于改良罗氏固体培养基中，在隔水式37℃恒温培养箱中培养3-4周，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长，对生长状况不良、污染菌株进行及时的清除。以上实验操作均需在二级生物安全柜内进行操作，并严格遵守结核病实验室操作的基本规程。
[0021]
2.2构建及鉴定重组穿梭质粒2.2.1 h37rv菌的培养及其菌悬液的制备 分别挑取适量h37rv菌至无菌ep管中，加入400μl 1
×
te buffer，充分震荡混匀后，放于80℃水浴箱内灭活30min；加入25%蔗糖溶液50μl，10%sds 500μl，125g/l溶菌酶80μl及20g/l蛋白酶k 20μl，充分混匀后37℃水浴过夜；第二日取出ep管，12000rpm，4℃，离心10min，移上清至一新无菌ep管内；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1）约700μl，常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入10g/l rnase 50μl，37℃温育1h；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1），常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入等体积酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1），充分混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入等体积预冷无水乙醇（约700μl）混匀10min后，置于-20℃冰箱沉淀过夜；从冰箱中取出ep管，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加70%乙醇洗涤沉淀，上下混匀10min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，室温干燥30min使乙醇挥发完全；加入1
×
te buffer 50-100μl，吹打混匀，4℃放置3h后置于-20℃贮存备用。并从各样本dna中取2ul，利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定及紫外分光光度计检测分析dna浓度及纯度。
[0022]
2.2.2引物的设计由genbank数据库中查出h37rv菌hsp16-3基因序列，根据质粒pmv361图谱选择合适的酶切位点，并设计引物。
[0023]
上游引物：5
’-ꢀ
cgc gga tcc atg gcc acc acc ctt c-3
’
含bamhⅰ酶切位点（gga tcc）下游引物：5
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ccc aag ctt tca gtt ggt gga ccg g-3
’
含hindⅲ酶切位点(aag ctt)2.2.3 目的基因的pcr扩增及纯化以h37rv菌为模版，扩增hsp16-3。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；64℃退火45s；72℃延伸2min 45s；共35个循环；最后延伸72℃10min。扩增产物利用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）回收pcr扩增产物。在紫
外灯下迅速从凝胶上切下相应的目的条带，使凝胶块充分溶解，分离出所需要的dna溶液。
[0024]
2.2.4 pcr回收产物与t载体的连接为了让扩增的目的片段正确插入到pmv361质粒的预定位点，先将回收后的pcr产物与t载体连接，连接反应条件为16℃反应过夜以及25℃反应20min。
[0025]
2.2.5阳性转化子的pcr鉴定在超净台中挑取lb平板中的若干个单菌落，至于10ml ep管中，向其中加入5ml lb液体培养基（含0.1g/l amp），250rpm/min摇床37℃震荡培养3h，做菌液pcr，反应总体积为25μl：包括1μl菌液模版，1.5μl上下游引物，10μl ddh2o，12.5μl 2
×
taq pcrmastermix。反应完成后，对pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出阳性克隆，吸取100μl菌液，加入到10ml lb液体培养基（含0.1g/l amp）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜，吸取800μl菌液，到含200μl灭菌甘油的1.5ml ep中，-80℃超低温冰箱保菌，并命名为t
-ꢀ
hsp16-3。
[0026]
2.2.6大肠杆菌e.coli dh5α感受态的制备取出实验室保存的大肠杆菌e.coli dh5α菌种，在lb平板（不含抗生素）上划线接种，37℃倒置培养过夜；在超净台中挑取单菌落，接种到5ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜；吸取1000μl培养过夜的菌液，加入到100ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养至od600值为0.4-0.6（约3h）；吸取1.5ml菌液至提前预冷的2ml离心管，冰上放置10min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清并吸尽其中残液，向ep管中加入750μl预冷的0.1mol/l cacl2溶液，冰上放置15min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清并吸尽其中残液，向ep管中加入100μl预冷的含20%甘油的0.1mol/l cacl2混合物，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，置于-80℃超低温冰箱保存备用。
[0027]
2.2.7 重组穿梭质粒的构建利用限制性内切酶mun i / hind iii，酶切hsp16-3及pmv361质粒，酶切体系酶切，反应pcr管短暂离心后，37℃酶切2.5h，将酶切产物经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带。回收后的t
-ꢀ
hsp16-3及pmv361质粒于4℃连接过夜，连接反应如下（10μl体系）：连接体系；转入e.coli dh5α感受态细胞，利用pcr筛选阳性单克隆，并命名为pmv361
-ꢀ
hsp16-3。
[0028]
2.2.8、目的质粒的提取和测序鉴定吸取4ml培养过夜的阳性克隆菌液，分次加入2ml ep管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清；为平衡吸附柱，向吸附柱cp3中加平衡液bl 500μl，12,000rpm离心1min；加入p1溶液250μl至含菌体沉淀的2ml ep管中，使用涡旋振荡器剧烈震荡，使菌体沉淀充分悬浮；再向其中加入p2溶液250μl，即刻温和上下翻转数次以充分裂解菌体；向其中加入p3溶液350μl，即刻温和地上下翻转数次，ep管底部会出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；将收集的上清液转移到吸附柱中（注意避免吸到白色絮状沉淀），12,000rpm离心45s，弃废液；加入漂洗液pw 600μl至吸附柱中，12,000rpm离心1min；重复漂洗一次；将吸附柱12,000rpm空离2min使漂洗液尽量除尽；为防止含乙醇的漂洗液残留可能影响后续实验，将吸附柱ca2开盖放至一个灭菌ep中，超净台放置15min；向吸附柱ca2的吸附膜中央位置悬空滴加洗脱缓冲液eb 50μl，静置2min后，12,000rpm离心2min；将ep管中的溶液重新加入吸附柱中，静置
2min后，12,000rpm离心2min，ep管中即为目的质粒，吸取抽提的目的质粒800μl到含200μl灭菌丙三醇的1.5ml ep管中，保菌并送至上海生工生物有限公司测序。
[0029]
2.3 h37ra菌感受态的制备。
[0030]
将h37ra菌接种到补加血清白蛋白、0.5% tween 80、0.5%甘油和0.3%过氧化氢酶的 middlebrook 7h9培养基中，200rpm/min摇床37℃震荡培养至对数生长期（od600达到0.5左右）。用提前预冷的50ml离心管收集菌液，冰浴1.5h后4℃离心机4,000rpm离心10 min；弃上清，加入10% 预冷丙三醇20ml洗涤沉淀，再次4℃离心机4,000rpm离心10 min；重复洗涤1次。加入10%预冷丙三醇重悬沉淀，-20℃保存用于电穿孔。
[0031]
2.4利用电穿孔技术将重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3电转化至h37ra菌将10μl重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3与100μl新鲜制备的 h37ra菌感受态细胞混匀，冰上放置30min后转移到预冷的1mm电击杯中，于2.1-2.5kv/cm条件下脉冲后迅速转至含5ml 7h9液体培养基（无kana）的试管中37℃培养48h，离心收集菌体后余100μl上清悬浮菌体，涂至含0.03mg/lkana的l-j培养基，37℃培养3-4周，进行抗性筛选，并命名为h37ra：hsp16-3菌。
[0032]
2.5利用realtime-pcr技术检测及鉴定构建成功的hsp16-3过表达的h37ra菌株。
[0033]
以上所述，为本发明优化的最佳具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
技术领域
[0001]
本发明涉及基因工程研究领域，以及结核杆菌小分子热休克蛋白hsp16-3（以下简称hsp16-3）过表达的结核分枝杆菌国际标准无毒株h37ra菌株（以下简称h37ra菌）的构建及其应用。
背景技术：
[0002]
结核病是世界上严重威胁人类健康的传染性疾病。世界卫生组织(who)所发布的2019年全球结核病报告中显示，2018年，全球范围内据估约有1000万结核病新发病例，89%的患者为成年患者（≥15岁）。据估计，2018年hiv阴性患者因结核病死亡约120万例，hiv阳性患者因结核病死亡约25.1万例。卡介苗（bcg）是目前世界范围内唯一广泛使用的抗结核疫苗。虽然卡介苗控制儿童结核病十分有效，但对成人结核病的预防效果在不同地区表现出极大差异（0-80%）。随着耐药和耐多药结核病的出现与流行，迫切需要研发安全高效的结核病疫苗。
[0003]
全球约有1/3人口被结核杆菌潜伏感染，该人群在免疫力下降，尤其是免疫系统受到损害时，则会发展成为结核病，潜伏性感染者已成为结核病患者的一个重要来源。潜伏性结核感染以皮肤结核菌素试验阳性，及(或) γ干扰素释放试验阳性，而无活动性结核的临床表现为特点。结核杆菌hsp16-3与结核杆菌潜伏感染之间密切相关。结核杆菌在低氧或缺氧状态时会大量合成hsp16-3，当结核杆菌感染小鼠巨噬细胞后期，hsp16-3的表达量明显增多，t细胞可以特异性的识别hsp16-3，并将其从被感染的巨噬细胞中分离出来，这种反应在结核杆菌潜伏期则更为明显，这说明hsp16-3在结核杆菌潜伏性感染阶段扮演着重要的角色。
[0004]
hsp16-3对研发新型结核病疫苗有重要的科学价值。hsp16-3能够诱导特异性免疫反应，具有鼠和人的t淋巴细胞表位，是有效的亚单位疫苗的靶抗原。宿主对结核杆菌等细胞内寄生菌的防御主要依赖于有效的细胞免疫，其机制为被感染的巨噬细胞被细胞免疫因子所激活，尤其是由自然杀伤细胞和抗原特异性t细胞产生的γ干扰素。hsp16-3抗原能够部分活化结核菌素纯蛋白衍生物(ppd)试验阳性机体的外周血单核细胞和cd4+t淋巴细胞，诱导thl型细胞免疫反应，并分泌干扰素，有效清除结核杆菌；同时cd8+t淋巴细胞可以识别hsp16-3的多肽表位，活化的cd8+t淋巴细胞可以诱导产生γ干扰素和α干扰素，从而通过粒细胞溶解素和表位穿孔素溶解被结核杆菌感染的巨噬细胞，因此，对hsp16-3的研究可以为安全高效的新型结核病疫苗研究提供理论依据，尤其是对潜伏感染者可能起到有效预防作用。
[0005]
基于此，我们提出构建hsp16-3过表达的h37ra菌株，具有以下的优势：第一，hsp16-3过表达的h37ra菌株，可增强其免疫原性，可产生更好的免疫应答，提高对机体的免疫保护作用，有可能单独作为结核病疫苗使用；第二，为探索结核杆菌的致病机制及控制结核病的传播提供依据，同时为寻找抗结核药物靶标提供新的方向。
技术实现要素：
[0006]
发明的目的在于提供hsp16-3过表达的h37ra菌株的构建方法，并在hsp16-3基因功能研究的基础上，探讨对结核病的有效防治。
[0007]
本发明目的，一是构建hsp16-3过表达的h37ra菌株，用于结核病预防和新型结核病疫苗研发。
[0008]
本发明目的，二是提供构建hsp16-3过表达的h37ra菌株的方法，为深入探讨结核病的发病机制，以及hsp16-3基因功能的研究奠定基础。
[0009]
本发明目的，三是为hsp16-3过表达的h37ra菌株的生物特性、免疫保护性、毒性及安全性等研究奠定基础。
[0010]
其技术方案如下：hsp16-3过表达的h37ra菌株的制备，包括以下步骤：步骤1、结核分枝杆菌国际标准强毒株h37rv菌株(以下简称h37rv菌) 的培养及其悬液的制备分别取对数生长期h37rv菌液10ml，调整细菌浓度为3.5
×
107个/ml，3500r/min离心5min，弃上清收集菌体,用pbs洗涤两次，加入1ml37℃预热的预处理剂至终浓度为0.01mol/l，37℃水浴保温20min，3500r/min 离心5min，再用pbs洗涤两次后，使菌体悬浮于原生质体稳定液中，加入预热的溶菌酶，37℃水浴酶解。
[0011]
步骤2、引物的设计与合成由genbank数据库中，查出h37rv菌hsp16-3基因序列，根据质粒pmv361图谱选择合适的酶切位点，并设计引物上游引物：5
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cgc gga tcc atg gcc acc acc ctt c-3
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含bamhⅰ酶切位点（gga tcc）下游引物：5
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’
含hindⅲ酶切位点(aag ctt)步骤3、目的基因的pcr扩增及鉴定以h37rv菌基因组dna为模版，扩增目的基因。扩增产物利用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）回收pcr扩增产物。在紫外灯下迅速从凝胶上切下相应的目的条带，使凝胶块充分溶解，分离出所需要的dna溶液。
[0012]
步骤4、pcr回收产物与t载体的连接 为了让扩增的目的片段，正确插入到pmv361质粒的预定酶切位点，先将回收后的pcr产物（hsp16-3基因片段）与t载体连接，连接反应条件为16℃反应过夜，以及25℃反应20min。
[0013]
步骤5、阳性转化子的pcr鉴定在超净台中，挑取lb平板中的若干个单菌落，至于ep管中，向其中加入lb液体培养基，摇床37℃震荡培养3h，做菌液pcr反应，反应完成后，对pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析筛选出阳性克隆，命名为t
-ꢀ
hsp16-3。
[0014]
步骤6、大肠杆菌e.coli dh5α感受态的制备取出实验室保存的大肠杆菌e.coli dh5α菌种，在lb平板（不含抗生素）上划线接种，37℃倒置培养过夜；在超净台中挑取单菌落接种到5ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜；吸取1000μl培养过夜的菌液，加入到100ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养至od600值为0.4-0.6（约3h）；吸取1.5ml菌液
至提前预冷的2ml离心管，冰上放置10min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清，向ep管中加入750μl预冷的0.1mol/l cacl2溶液，冰上放置15min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清，向ep管中加入100μl预冷的含20%甘油的0.1mol/l cacl2混合物，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，置于-80℃超低温冰箱，保存备用。
[0015]
步骤7、目的质粒的提取和测序、鉴定，由上海生工生物有限公司测序。
[0016]
步骤8、构建及鉴定重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3利用限制性内切酶muni/hindiii，酶切t
-ꢀ
hsp16-3和pmv361质粒。将酶切产物，经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳，检测后回收目的条带。回收后的t
-ꢀ
hsp16-3及pmv361质粒于4℃连接过夜，发生连接反应。然后，转入e.coli dh5α感受态细胞，利用pcr筛选阳性克隆，并命名为pmv361
-ꢀ
hsp16-3。
[0017]
步骤9、利用电穿孔技术将重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3电转化至h37ra菌将10μl重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3，与100μl新鲜的h37ra菌株感受态细胞混匀，冰上放置30min后，转移到预冷的1mm电击杯中，于2.1-2.5kv/cm条件下脉冲后，迅速转至含5ml 7h9液体培养基（无kana）的试管中，37℃培养48h，离心收集菌体后，用100μl上清悬浮菌体，涂至含0.03mg/lkana的l-j培养基，37℃培养3-4周，进行抗性筛选，并命名为h37ra：hsp16-3菌株。
具体实施方式
[0018]
下面对本发明的技术方案作进一步详细地说明。
[0019]
实施例1 hsp16-3过表达的h37ra菌株的制备1.材料与方法1.1 主要试剂材料：h37ra菌，h37rv菌由中国药物生物制品检定所提供，本实验室保存；大肠杆菌e.coli dh5α由本实验室提供。大肠杆菌-结核杆菌穿梭表达载体pmv361由本实验室保存。限制性内切酶ecori 购自美国neb生物公司；限制性内切酶hind iii 美国neb生物公司；t4 dna连接酶 美国neb生物公司；2
×
pfu master mix 购自北京康为世纪公司；dna marker 购自北京天根生化科技有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司；质粒小提试剂盒（离心柱型）购自北京天根生化科技有限公司；核酸染料gelview 购自北京百泰克生物技术有限公司；loading buffer购自日本takara公司；西班牙原装琼脂糖购自上海艾研生物科技有限公司；50
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tae购自上海生工生物有限公司；琼脂粉购自北京奥博星生物技术有限公司；oxoid胰蛋白胨 购自英国tryptone 公司；oxoid酵母提取物购自英国tryptone 公司；去离子水购自北京康为世纪公司；nacl购自上海生物工程有限公司；蛋白酶k购自上海生物工程有限公司；溶菌酶购自上海生物工程有限公司； rnase 购自上海凯博生物有限公司；sds购自美国sigma公司；酚、氯仿、异戊醇（25:24:1）购自索莱宝科技有限公司；1
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te购自上海生物工程有限公司； rneasy plus universal mini kit购自德国qiagen公司；quantitect reverse transcription购自德国qiagen公司；revertaid first strand cdna synthesis ki购自美国thermo公司；5
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tbe购自上海生工生物有限公司；1.2 主要实验仪器设备：由新疆石河子大学医学院《新疆地方与民族高发病》教育部重点实验室提供
research可调式单道移液器购自德国eppendorf公司；mls3750型高压灭菌器购自日本三洋公司；普通离心机产自长沙湘仪离心机仪器有限公司；电转仪购自德国eppendorf公司；scs-24摇床购自上海市离心机械研究所；dyy-4型电泳仪购自北京六一厂；bio-rad梯度pcr仪、bio-rad 凝胶成像仪购自美国伯乐公司；170s型co2培养箱购自英国galaxy公司；2-16k高速冷冻离心机购自德国sigma公司；millipore超纯水装置来源于美国millipore公司；synyo低温冰箱购自日本 synyo 公司；thermo scientific1300型二级生物安全柜、nanodrop 2000型紫外分光光度计购自美国thermo fisher scientific公司。
[0020]
2. 实验方法2.1培养h37rv菌将h37rv菌复苏并别接种于改良罗氏固体培养基中，在隔水式37℃恒温培养箱中培养3-4周，每7天观察一次，菌落为淡黄色菌落呈颗粒或菜花样生长，对生长状况不良、污染菌株进行及时的清除。以上实验操作均需在二级生物安全柜内进行操作，并严格遵守结核病实验室操作的基本规程。
[0021]
2.2构建及鉴定重组穿梭质粒2.2.1 h37rv菌的培养及其菌悬液的制备 分别挑取适量h37rv菌至无菌ep管中，加入400μl 1
×
te buffer，充分震荡混匀后，放于80℃水浴箱内灭活30min；加入25%蔗糖溶液50μl，10%sds 500μl，125g/l溶菌酶80μl及20g/l蛋白酶k 20μl，充分混匀后37℃水浴过夜；第二日取出ep管，12000rpm，4℃，离心10min，移上清至一新无菌ep管内；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1）约700μl，常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入10g/l rnase 50μl，37℃温育1h；加入酚︰氯仿：异戊醇（25:24:1），常温上下温和混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入等体积酚︰氯仿︰异戊醇(25︰24︰1），充分混匀10min后，12000rpm，4℃离心10min；移上清至一新ep管，加入等体积预冷无水乙醇（约700μl）混匀10min后，置于-20℃冰箱沉淀过夜；从冰箱中取出ep管，12000rpm，4℃离心10min；弃上清，加70%乙醇洗涤沉淀，上下混匀10min；12000rpm，4℃离心10min；弃上清，室温干燥30min使乙醇挥发完全；加入1
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te buffer 50-100μl，吹打混匀，4℃放置3h后置于-20℃贮存备用。并从各样本dna中取2ul，利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳鉴定及紫外分光光度计检测分析dna浓度及纯度。
[0022]
2.2.2引物的设计由genbank数据库中查出h37rv菌hsp16-3基因序列，根据质粒pmv361图谱选择合适的酶切位点，并设计引物。
[0023]
上游引物：5
’-ꢀ
cgc gga tcc atg gcc acc acc ctt c-3
’
含bamhⅰ酶切位点（gga tcc）下游引物：5
’-ꢀ
ccc aag ctt tca gtt ggt gga ccg g-3
’
含hindⅲ酶切位点(aag ctt)2.2.3 目的基因的pcr扩增及纯化以h37rv菌为模版，扩增hsp16-3。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s；64℃退火45s；72℃延伸2min 45s；共35个循环；最后延伸72℃10min。扩增产物利用1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳进行检测，利用琼脂糖凝胶回收试剂盒（离心柱型）回收pcr扩增产物。在紫
外灯下迅速从凝胶上切下相应的目的条带，使凝胶块充分溶解，分离出所需要的dna溶液。
[0024]
2.2.4 pcr回收产物与t载体的连接为了让扩增的目的片段正确插入到pmv361质粒的预定位点，先将回收后的pcr产物与t载体连接，连接反应条件为16℃反应过夜以及25℃反应20min。
[0025]
2.2.5阳性转化子的pcr鉴定在超净台中挑取lb平板中的若干个单菌落，至于10ml ep管中，向其中加入5ml lb液体培养基（含0.1g/l amp），250rpm/min摇床37℃震荡培养3h，做菌液pcr，反应总体积为25μl：包括1μl菌液模版，1.5μl上下游引物，10μl ddh2o，12.5μl 2
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taq pcrmastermix。反应完成后，对pcr产物进行1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，筛选出阳性克隆，吸取100μl菌液，加入到10ml lb液体培养基（含0.1g/l amp）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜，吸取800μl菌液，到含200μl灭菌甘油的1.5ml ep中，-80℃超低温冰箱保菌，并命名为t
-ꢀ
hsp16-3。
[0026]
2.2.6大肠杆菌e.coli dh5α感受态的制备取出实验室保存的大肠杆菌e.coli dh5α菌种，在lb平板（不含抗生素）上划线接种，37℃倒置培养过夜；在超净台中挑取单菌落，接种到5ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养过夜；吸取1000μl培养过夜的菌液，加入到100ml lb液体培养基（不含抗生素）中，180rpm/min，37℃震荡培养至od600值为0.4-0.6（约3h）；吸取1.5ml菌液至提前预冷的2ml离心管，冰上放置10min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清并吸尽其中残液，向ep管中加入750μl预冷的0.1mol/l cacl2溶液，冰上放置15min，置于4℃离心机中，3,000rpm离心10min；弃去上清并吸尽其中残液，向ep管中加入100μl预冷的含20%甘油的0.1mol/l cacl2混合物，轻轻悬浮细胞，冰上放置5min，置于-80℃超低温冰箱保存备用。
[0027]
2.2.7 重组穿梭质粒的构建利用限制性内切酶mun i / hind iii，酶切hsp16-3及pmv361质粒，酶切体系酶切，反应pcr管短暂离心后，37℃酶切2.5h，将酶切产物经1.5%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测后，回收目的条带。回收后的t
-ꢀ
hsp16-3及pmv361质粒于4℃连接过夜，连接反应如下（10μl体系）：连接体系；转入e.coli dh5α感受态细胞，利用pcr筛选阳性单克隆，并命名为pmv361
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hsp16-3。
[0028]
2.2.8、目的质粒的提取和测序鉴定吸取4ml培养过夜的阳性克隆菌液，分次加入2ml ep管中，12,000rpm离心1min，尽量吸除上清；为平衡吸附柱，向吸附柱cp3中加平衡液bl 500μl，12,000rpm离心1min；加入p1溶液250μl至含菌体沉淀的2ml ep管中，使用涡旋振荡器剧烈震荡，使菌体沉淀充分悬浮；再向其中加入p2溶液250μl，即刻温和上下翻转数次以充分裂解菌体；向其中加入p3溶液350μl，即刻温和地上下翻转数次，ep管底部会出现白色絮状沉淀，12,000rpm离心10min；将收集的上清液转移到吸附柱中（注意避免吸到白色絮状沉淀），12,000rpm离心45s，弃废液；加入漂洗液pw 600μl至吸附柱中，12,000rpm离心1min；重复漂洗一次；将吸附柱12,000rpm空离2min使漂洗液尽量除尽；为防止含乙醇的漂洗液残留可能影响后续实验，将吸附柱ca2开盖放至一个灭菌ep中，超净台放置15min；向吸附柱ca2的吸附膜中央位置悬空滴加洗脱缓冲液eb 50μl，静置2min后，12,000rpm离心2min；将ep管中的溶液重新加入吸附柱中，静置
2min后，12,000rpm离心2min，ep管中即为目的质粒，吸取抽提的目的质粒800μl到含200μl灭菌丙三醇的1.5ml ep管中，保菌并送至上海生工生物有限公司测序。
[0029]
2.3 h37ra菌感受态的制备。
[0030]
将h37ra菌接种到补加血清白蛋白、0.5% tween 80、0.5%甘油和0.3%过氧化氢酶的 middlebrook 7h9培养基中，200rpm/min摇床37℃震荡培养至对数生长期（od600达到0.5左右）。用提前预冷的50ml离心管收集菌液，冰浴1.5h后4℃离心机4,000rpm离心10 min；弃上清，加入10% 预冷丙三醇20ml洗涤沉淀，再次4℃离心机4,000rpm离心10 min；重复洗涤1次。加入10%预冷丙三醇重悬沉淀，-20℃保存用于电穿孔。
[0031]
2.4利用电穿孔技术将重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3电转化至h37ra菌将10μl重组穿梭质粒pmv361
-ꢀ
hsp16-3与100μl新鲜制备的 h37ra菌感受态细胞混匀，冰上放置30min后转移到预冷的1mm电击杯中，于2.1-2.5kv/cm条件下脉冲后迅速转至含5ml 7h9液体培养基（无kana）的试管中37℃培养48h，离心收集菌体后余100μl上清悬浮菌体，涂至含0.03mg/lkana的l-j培养基，37℃培养3-4周，进行抗性筛选，并命名为h37ra：hsp16-3菌。
[0032]
2.5利用realtime-pcr技术检测及鉴定构建成功的hsp16-3过表达的h37ra菌株。
[0033]
以上所述，为本发明优化的最佳具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。
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