磺基甜菜碱表面活性剂在提高菠萝蛋白酶活性中的应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物酶技术领域，涉及一种磺基甜菜碱表面活性剂在提高菠萝蛋白酶活性中的应用。


背景技术：

[0002]
菠萝蛋白酶(bm)是一种糖蛋白，是从菠萝中提取的蛋白水解酶的总称。菠萝蛋白酶在医药方面具有重要的应用价值，如抑制血小板聚集，治疗鼻窦炎、手术创伤、血栓性静脉炎、肾盂肾炎、支气管炎等，还可与抗生素连用以增强机体对药物的吸收；对于肿瘤细胞的生长也能起到很好的抑制作用。在食品方面，菠萝蛋白酶可用于水解蛋白质，制备营养口服液。然而菠萝蛋白酶含有一种不稳定的游离疏基，极易被氧化形成自行降解的醌-硫醇复合物，导致酶失去活性，并且极易受到环境因素变化的影响。因此，如何提高菠萝蛋白酶的活性引起了研究人员的广泛关注。
[0003]
两性离子表面活性剂是指在同一个分子中同时拥有阳离子亲水基和阴离子亲水基的表面活性剂。两性离子表面活性剂具有良好的生物降解性、抗静电性和防腐能力。磺基甜菜碱表面活性剂是一种两性表面活性剂，它同时拥有季铵基和磺酸基，具有良好的化学稳定性、较低的毒性、优良的乳化性、良好的环境友好性和生物相容性，可与其他表面活性剂配伍，在纺织、皮革、印染、医药及洗护用品等方面具有良好的应用前景。
[0004]
中国专利申请cn107099515a公开了一种菠萝蛋白酶稳定剂，该菠萝蛋白酶稳定剂按重量份数计包括还原剂0.015-0.13份、金属离子螯合剂0.002-0.07份、有机羧酸盐0.01-0.09份、防腐剂0.05-0.15份和维生素0.001-0.02份。该稳定剂可以明显的保护菠萝蛋白酶的活性，减少酶活的损失，有效的延长酶的半衰期然而，该稳定剂仅仅只能起到保持菠萝蛋白酶自身活性的作用，并不能提高菠萝蛋白酶的活性。而实际应用中，提高菠萝蛋白酶的活性对提高其效率具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的在于提供磺基甜菜碱表面活性剂在提高菠萝蛋白酶活性中的应用。
[0006]
本发明中，所述的磺基甜菜碱表面活性剂的结构式如式ⅰ所示：
[0007]
n＝10或14。
[0008]
具体地，n＝10时，所述的磺基甜菜碱表面活性剂为3-磺丙基十二烷基二甲基甜菜碱(sddab)；n＝14时，所述的磺基甜菜碱表面活性剂为3-磺丙基十六烷基二甲基甜菜碱(shdab)。
[0009]
进一步地，本发明提供磺基甜菜碱表面活性剂在提高菠萝蛋白酶活性中的应用，具体应用方法为：在含有菠萝蛋白酶的溶液中加入磺基甜菜碱表面活性剂。
[0010]
进一步地，上述具体应用方法中，还加入底物。本发明的具体实施方式中，底物为
酪蛋白。
[0011]
本发明中，为进一步提高菠萝蛋白酶活性，调节含有菠萝蛋白酶的溶液的ph至菠萝蛋白酶的适宜ph，即ph为6～10，更优选为菠萝蛋白酶的最适ph，即ph为8.0；调节含有菠萝蛋白酶的溶液的温度至菠萝蛋白酶的适宜温度，即温度为20℃以上，优选为40℃～60℃，更优选为菠萝蛋白酶的最适温度，即50℃。
[0012]
本发明中，为进一步提高菠萝蛋白酶活性，sddab的加入量为0.1mm以上，优选为0.5mm以上；shdab的加入量为0.05mm以上，优选为10～15mm。
[0013]
本发明中，所述的含有菠萝蛋白酶的溶液通过将菠萝蛋白酶溶于ph 8.0，0.1mna2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制。
[0014]
本发明中，磺基甜菜碱表面活性剂的加入方式可以是先将磺基甜菜碱表面活性剂与菠萝蛋白酶混合后再加入底物，或先将磺基甜菜碱表面活性剂与底物混合后再加入菠萝蛋白酶。加入顺序对sddab对菠萝蛋白酶的活性的影响不大，而shdab先与菠萝蛋白酶混合比先与底物混合时对酶的活性提高更大。
[0015]
磺基甜菜碱表面活性剂sddab和shdab具有生物相容性、低毒性和良好的环境友好性。本发明首次发现磺基甜菜碱表面活性剂sddab和shdab可以提高菠萝蛋白酶的活性，未改变环境因素对菠萝蛋白酶的活性的影响。磺基甜菜碱表面活性剂sddab和shdab的加入并未改变菠萝蛋白酶的最适ph值、温度、离子强度。改变加样顺序，sddab对酶的活性的影响不大，shdab先与酶混合比先与底物混合时对酶的活性提高更大。
附图说明
[0016]
图1为不同浓度的sddab和shdab对bm活性的影响结果图；
[0017]
图2为ph＝8条件下，不同温度对sddab和shdab对bm活性的影响结果图；
[0018]
图3为t＝30℃，ph＝8条件下，不同nacl浓度对sddab和shdab对bm活性的影响结果图；
[0019]
图4为t＝30℃条件下，不同ph值对sddab和shdab对bm活性的影响结果图；
[0020]
图5为t＝30℃，ph＝8条件下，不同加样顺序对sddab和shdab对bm活性的影响结果图。
具体实施方式
[0021]
下面结合实施例和附图对本发明作进一步详述。下述实施例中采用的菠萝蛋白酶为商品化的菠萝蛋白酶。
[0022]
实施例1
[0023]
不同浓度的sddab和shdab对bm活性的影响实验：
[0024]
(1)底物溶液配制
[0025]
称取0.6g干酪素，加入20ml 0.2m磷酸氢二钠溶液以及150ml 0.2m氢氧化钠溶液，于70℃下水浴并不停搅拌至完全溶解，再调节ph至8.0，定容至100ml，得到底物酪蛋白溶液。
[0026]
(2)菠萝蛋白酶溶液的配制
[0027]
在ph 8.0，0.1m na2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制1mg/ml菠萝蛋白酶溶液。
[0028]
(3)三氯乙酸溶液的配制
[0029]
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89ml冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100ml。
[0030]
(4)l-半胱氨酸溶液的配置
[0031]
称取0.26g l-半胱氨酸及0.22g乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，加入适量去离子水，于60℃下水浴至完全溶解，再调节ph至6.0，定容至100ml。
[0032]
(5)表面活性剂溶液的配制
[0033]
以去离子水为溶剂，配制20mm的sddab和shdab溶液。
[0034]
(6)酶活性测定
[0035]
将不同体积的表面活性剂加入bm溶液中，配成不同浓度的表面活性剂与bm(0.075mg/ml)的混合溶液。将混合溶液置于30℃水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加入120μlbm溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于30℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白溶液和500μl三氯乙酸溶液。在30℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0036]
图1为不同浓度的sddab和shdab对bm活性的影响结果图。sddab的临界胶束浓度(cmc)为3mm，shdab的临界胶束浓度为0.2mm，加入bm对于cmc值影响较小。sddab与shdab的浓度远低于cmc值时，即可对bm的活性起到提高作用。由图1可知当sddab的浓度达到0.5mm时，bm的活性提高到150％左右；当shdab的浓度大于0.05mm时，bm的活性提高到140％左右。
[0037]
实施例2
[0038]
不同温度对sddab和shdab对bm活性的影响实验：
[0039]
(1)底物溶液配制
[0040]
称取0.6g干酪素，加入20ml 0.2m磷酸氢二钠溶液以及150ml 0.2m氢氧化钠溶液，于70℃下水浴并不停搅拌至完全溶解，再调节ph至8.0，定容至100ml，得到底物酪蛋白溶液。
[0041]
(2)菠萝蛋白酶溶液的配制
[0042]
在ph 8.0，0.1m na2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制1mg/ml菠萝蛋白酶溶液。
[0043]
(3)三氯乙酸溶液的配制
[0044]
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89ml冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100ml。
[0045]
(4)l-半胱氨酸溶液的配置
[0046]
称取0.26g l-半胱氨酸及0.22g乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，加入适量去离子水，于60℃下水浴至完全溶解，再调节ph至6.0，定容至100ml。
[0047]
(5)表面活性剂溶液的配制
[0048]
以去离子水为溶剂，配制20mm的sddab和shdab溶液。
[0049]
(6)酶活性测定
[0050]
将bm(0.075mg/ml)溶液置于不同温度的水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加
入120μlbm溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于不同温度的水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白溶液和500μl三氯乙酸溶液。在不同温度下的水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将30℃下不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0051]
图2为ph＝8条件下，不同温度对sddab和shdab对bm活性的影响结果图。由图2可知改变反应的温度，在20～60℃时，表面活性剂对bm的活性有促进作用；在50℃时，sddab将bm的活性提高到540％左右，shdab将bm的活性提高到570％左右，此时bm活性最高，与不加入表面活性剂的bm的活性最高时的温度相同。
[0052]
实施例3
[0053]
不同nacl浓度对sddab和shdab对bm活性的影响实验：
[0054]
(1)底物溶液配制
[0055]
称取0.6g干酪素，加入20ml 0.2m磷酸氢二钠溶液以及150ml 0.2m氢氧化钠溶液，于70℃下水浴并不停搅拌至完全溶解，再调节ph至8.0，定容至100ml，得到底物酪蛋白溶液。
[0056]
(2)菠萝蛋白酶溶液的配制
[0057]
在ph 8.0，0.1m na2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制1mg/ml菠萝蛋白酶溶液。在去离子水中配制5mm的nacl溶液，向bm的溶液中加入不同体积的nacl溶液，配成为nacl与bm的混合溶液，bm的浓度为0.075mg/ml。
[0058]
(3)三氯乙酸溶液的配制
[0059]
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89ml冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100ml。
[0060]
(4)l-半胱氨酸溶液的配置
[0061]
称取0.26g l-半胱氨酸及0.22g乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，加入适量去离子水，于60℃下水浴至完全溶解，再调节ph至6.0，定容至100ml。
[0062]
(5)表面活性剂溶液的配制
[0063]
以去离子水为溶剂，配制20mm的sddab和shdab溶液。
[0064]
(6)酶活性测定
[0065]
将不同浓度的nacl与bm的混合溶液置于30℃水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加入120μlnacl与bm的混合溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于30℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白溶液和500μl三氯乙酸溶液。在30℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将不加入nacl、不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0066]
图3为t＝30℃，ph＝8条件下，不同nacl浓度对sddab和shdab对bm活性的影响结果
图。由图3可知随着nacl浓度的增加，bm的活性随着nacl浓度的增大而增大。当nacl浓度为2m、sddab的浓度为5mm时，bm的活性提高到140％左右；当nacl浓度为2m、shdab的浓度为1mm时，bm的活性提高到170％左右。
[0067]
实施例4
[0068]
不同ph值对sddab和shdab对bm活性的影响实验：
[0069]
(1)底物溶液配制
[0070]
称取0.6g干酪素，加入20ml 0.2m磷酸氢二钠溶液以及150ml 0.2m氢氧化钠溶液，于70℃下水浴并不停搅拌至完全溶解，再调节底物ph值，定容至100ml，得到不同ph值的底物酪蛋白溶液。
[0071]
(2)菠萝蛋白酶溶液的配制
[0072]
在ph 8.0，0.1m na2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制1mg/ml菠萝蛋白酶溶液。
[0073]
(3)三氯乙酸溶液的配制
[0074]
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89ml冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100ml。
[0075]
(4)l-半胱氨酸溶液的配置
[0076]
称取0.26g l-半胱氨酸及0.22g乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，加入适量去离子水，于60℃下水浴至完全溶解，再调节ph至6.0，定容至100ml。
[0077]
(5)表面活性剂溶液的配制
[0078]
以去离子水为溶剂，配制20mm的sddab和shdab溶液。
[0079]
(6)酶活性测定
[0080]
将bm溶液(0.075mg/ml)置于30℃水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加入120μlbm溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于30℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白溶液和500μl三氯乙酸溶液。在30℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将ph＝8下不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0081]
图4为t＝30℃条件下，不同ph值对sddab和shdab对bm活性的影响结果图。由图4可知加入sddab和shdab后，ph值对bm活性的影响并未改变，ph值在6-10时表面活性剂提高bm的活性，在ph为8时bm的活性达到了最大，sddab和shdab未改变bm的最适ph值。
[0082]
实施例5
[0083]
不同加样顺序对sddab和shdab对bm活性的影响实验：
[0084]
(1)底物溶液配制
[0085]
称取0.6g干酪素，加入20ml 0.2m磷酸氢二钠溶液以及150ml 0.2m氢氧化钠溶液，于70℃下水浴并不停搅拌至完全溶解，再调节ph至8.0，定容至100ml，得到底物酪蛋白溶液。
[0086]
(2)菠萝蛋白酶溶液的配制
[0087]
在ph 8.0，0.1m na2hpo
4-nah2po4缓冲溶液中配制1mg/ml菠萝蛋白酶溶液。
[0088]
(3)三氯乙酸溶液的配制
[0089]
称取1.799g三氯乙酸，加入2.994g无水乙酸钠、1.89ml冰醋酸及适量去离子水，用玻璃棒搅拌，定容至100ml。
[0090]
(4)l-半胱氨酸溶液的配置
[0091]
称取0.26g l-半胱氨酸及0.22g乙二胺四乙酸二钠(edta-2na)，加入适量去离子水，于60℃下水浴至完全溶解，再调节ph至6.0，定容至100ml。
[0092]
(5)表面活性剂溶液的配制
[0093]
以去离子水为溶剂，配制20mm的sddab和shdab溶液。
[0094]
(6)酶活性测定
[0095]
a.表面活性剂先与酶混合
[0096]
将bm溶液与表面活性剂溶液相混合，将混合溶液置于30℃水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加入120μlbm和表面活性剂的混合溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于30℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白溶液和500μl三氯乙酸溶液。在30℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0097]
b.表面活性剂先与底物混合
[0098]
将表面活性剂溶液与底物酪蛋白溶液相混合，备用。将bm(0.075mg/ml)置于30℃水浴锅中恒温1h。在一支2ml离心管中加入120μlbm溶液及等量的l-半胱氨酸溶液，充分混匀后，分别取100μl该混合液加入两支2ml离心管中，于30℃水浴锅中恒温10min(一支作为对照管、另一支作为样品管)。恒温结束后，于对照管和样品管中分别加入500μl三氯乙酸溶液和500μl酪蛋白与表面活性剂混合溶液，准确反应10min，再分别于对照管和样品管中加入500μl酪蛋白与表面活性剂混合溶液和500μl三氯乙酸溶液。在30℃水浴锅中恒温30min之后于高速冷冻离心机中离心(离心条件：10000rpm、4℃、25min)，取上层清液，用于紫外测定，记录275nm处的吸光度值。将不加磺基甜菜碱表面活性剂的酶活性定义为100％。
[0099]
图5为t＝30℃，ph＝8条件下，不同加样顺序对sddab和shdab对bm活性的影响结果图。由图5可知改变加样顺序，sddab对bm的活性影响不大，shdab先于酶混合比先于底物混合时对bm的活性提高更大。
[0100]
综上所述，磺基甜菜碱表面活性剂对菠萝蛋白酶的活性起提高作用，且随着疏水链的增长，对其活性的提高作用增强。sddab与shdab的浓度远低于cmc值时，即可对bm的活性起到提高作用。加入磺基甜菜碱表面活性剂没有改变ph值、温度、离子强度对菠萝蛋白酶的活性的影响，最适温度为50℃，最适离子强度为0m，最适ph值为8。

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