一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法与流程

[0001]
本发明涉及基因测序领域，本发明涉及适用于一种降低单细胞扩增偏倚性的离体组织细胞核分离方法。


背景技术：

[0002]
单细胞测序是指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等多组学进行高通量测序分析的新技术。改技术的应用使得解释单个细胞的基因结构和基因表达状态，解读细胞间的异质性成为了可能。单细胞测序以备广泛可应用于发育生物学、免疫、肿瘤等方向的研究，并且涌现出大量高质量的研究和科研成果。其中单细胞全基因组测序通过对肿瘤组织中解离后得到的单个细胞的dna进行全基因组扩增，再进行文库构建及测序，分析每个细胞中的基因情况，研究肿瘤发生发展机制、分子分型等，为肿瘤分型、肿瘤治疗策略、新药研发等提供新的方向。
[0003]
单细胞测序对样本活性要求较高。人肿瘤组织多坏死病灶，不易获得高活率单细胞悬液，而且单细胞悬液运输过程中无法保证细胞活率。目前的实现方法是携带单细胞分离设备至医院，手术切下的新鲜离体组织立即进行消化及后续的分离处理，使该实验在成本、时间、地点等方面受到较大限制。因此有必要开发一种新的样本处理方法，更便捷地获得合适的样本进行单细胞全基因组测序。
[0004]
将新鲜的离体肿瘤组织用液氮冷冻为冰冻组织后可用干冰运输及保存，但解冻后难以消化获得高活率的单细胞悬液。在新鲜组织快速冷冻及冷冻保存的过程中会对细胞造成较大的损伤，细胞内rna游离损失，导致无法进行单细胞rna测序，而核膜在冻融的过程中可以保持完整。有研究证明细胞核中包含足够量的基因组dna，可用于测序，且与用完整细胞进行基因组测序具有较高的相关性。由于核膜比细胞膜更易保持完整，与获得单细胞悬液相比，从冰冻组织中获得细胞核悬液的可操作性更强。目前从冰冻组织中获得单核悬液还没有成熟稳定的方法，目前仅有通过昂贵的辅助设备针对冰冻脑组织的单核悬液分离方法，且没有质控结果的展示说明。
[0005]
同时医院样本库有大量的特色病例、珍稀冷冻标本，这些冰冻样本的利用可以为研究稀有病种、缩短研究周期有很大的帮助。
[0006]
因而，开发一种简单、方便的分离人离体冰冻肿瘤组织细胞核，获得高活率的单细胞核悬液的方法迫在眉睫。


技术实现要素：

[0007]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题：如何利用简单、方便的方法分离离体冰冻肿瘤组织细胞核。为此，发明人开发了一种简便的方法，可以从离体冰冻肿瘤组织样本中获得适用于单细胞测序的单核悬液，解除新鲜离体肿瘤组织单细胞测序对时间地点的限制，使单细胞测序技术可以更广泛地应用于离体肿瘤组织微环境的研究。
[0008]
本发明第一方面是一种提取细胞核的方法，该方法的步骤包括：
[0009]
1)在二号缓冲液(lb)中进行样品机械裂解处理，经过冰置处理和吹打处理后获得裂解产物；
[0010]
2)将裂解产物进行第一过滤处理及第一离心处理，获得第一离心细胞核沉淀；
[0011]
3)将第一离心细胞核沉淀在第一缓冲液(wb)中进行冲洗及第一重悬处理和第二过滤处理，然后进行第二次离心处理，获得第二离心细胞核沉淀；
[0012]
4)将第二离心细胞核沉淀在三号(nb)缓冲液中进行第二重悬混匀处理后进行第三过滤处理，获得的细胞核悬液；
[0013]
进一步地，样品为离体样本。
[0014]
优选地，离体样本为离体冰冻肿瘤组织或体外培养的贴壁细胞。
[0015]
进一步地，一号缓冲液(wb)包括：10-20mm tris-hcl(ph 7.5-7.8)，10-20mm nacl，50-100mm kcl，2-10mm mgcl2，5-15mm cacl2，0.04％bsa，1mg/ml pi以及0.2u/μl rnase抑制剂；
[0016]
进一步地，样品与一号缓冲液(wb)的质量体积比为5mg:0.5ml。
[0017]
进一步地，二号缓冲液(lb)包括：一号缓冲液(wb)含0.2％np-40(质量体积比)。
[0018]
进一步地，三号缓冲液(nb)包括：含1％fbs，1mm dtt的d-hanks缓冲液。
[0019]
进一步地，使用前，一号缓冲液(wb)，二号缓冲液(lb)以及三号缓冲液(nb)预先经过4℃预冷处理。
[0020]
进一步地，步骤1)中使用研磨杵进行机械研磨破碎处理。
[0021]
进一步地，步骤1)中破碎处理后的样品体积≤0.2mm3。
[0022]
进一步地，步骤1)中冰置处理时间为8-10min，利用移液枪混匀。
[0023]
进一步地，步骤1)中吹打处理为10-15次。
[0024]
进一步地，步骤2)中第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行。
[0025]
进一步地，步骤2)中第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min。
[0026]
进一步地，步骤3)中第一重悬处理中一号缓冲液(wb)的用量为0.5ml。
[0027]
进一步地，步骤3)中第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行。
[0028]
进一步地，步骤3)中将第二过滤处理获得的滤液收集在新的离心管中，进行第二离心处理，第二离心处理是在4℃、300g的条件下进行5min。
[0029]
进一步地，步骤4)中第三过滤处理是通过直径为40m的细胞过滤器进行。
[0030]
进一步地，步骤4)中第二离心细胞核沉淀在0.2ml的三号缓冲液(nb)进行第二重悬混匀处理。
[0031]
进一步地，对细胞核悬液中的细胞核进行单细胞全基因扩增及扩增均一性检测。
[0032]
进一步地，单细胞全基因组测序前，进一步将细胞核进行重悬处理，所述重悬处理后，细胞核的浓度为1000核/μl。
[0033]
本发明第二方面提供了一种基于本发明第一方面细胞核提取方法的一种提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法，该方法包括：
[0034]
步骤a1，第二缓冲液预先经过4℃预冷处理，将离体冰冻肿瘤组织在第二缓冲液(lb)中进行机械破碎处理，离体冰冻肿瘤组织与第二缓冲液的质量体积比为不超过5mg:0.5ml，破碎处理后的离体冰冻肿瘤组织体积≤0.2mm3，将机械破碎处理产物冰置处理5～10min，利用移液枪混匀；然后将冰置处理产物进行10～15次吹打处理，获得吹打处理产物；
[0035]
步骤a2，将步骤a1获得的吹打处理产物进行第一过滤处理，第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行的，经第一过滤处理后的滤液构成裂解产物，将裂解产物在4℃、500g的条件下进行5min的第一离心处理，获得细胞核沉淀；
[0036]
步骤a3，将细胞核沉淀在一号缓冲液(wb)中进行重悬处理，一号缓冲液(wb)的用量为0.5ml，一号缓冲液(wb)重悬后的构成第一重悬后的细胞核悬液；
[0037]
步骤a4，将第一重悬后的细胞核悬液进行第二过滤处理，第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行的，第二过滤处理后的滤液构成第二细胞核滤液；
[0038]
步骤a5，将第二细胞核滤液进行4℃、300g的条件下进行5min的第二离心处理，获得第二离心处理后的细胞核沉淀；
[0039]
步骤a6，将第二离心处理后的细胞核沉淀用0.2ml经4℃预冷的三号缓冲液(nb)重悬进行重悬混匀后进行第三过滤处理得到离体冰冻肿瘤组织的细胞核悬液。
[0040]
进一步地，离体冰冻肿瘤组织的细胞核悬液中的细胞核进行单细胞全基因扩增和扩增均一性检测前，再次进行重悬处理，重悬处理后的细胞核的浓度为1000个/μl。
[0041]
本发明第三方面提供了一种基于本发明第一方面细胞核提取方法的一种提取培养的贴壁细胞的细胞核的方法，该方法包括：
[0042]
步骤b1，第二缓冲液预先经过4℃预冷处理，将培养的贴壁细胞在第二缓冲液(lb)中进行机械破碎处理，培养的贴壁细胞与第二缓冲液的质量体积比为不超过5mg:0.5ml，将机械破碎处理产物冰置处理5～10min，利用移液枪混匀；然后将冰置处理产物进行10～15次吹打处理，获得吹打处理产物；
[0043]
步骤b2，将步骤a1获得的吹打处理产物进行第一过滤处理，第一过滤处理是通过直径为70μm的细胞过滤器进行的，经第一过滤处理后的滤液构成裂解产物，将裂解产物在4℃、500g的条件下进行5min的第一离心处理，获得细胞核沉淀；
[0044]
步骤b3，将细胞核沉淀在一号缓冲液(wb)中进行重悬处理，一号缓冲液(wb)的用量为0.5ml，一号缓冲液(wb)重悬后的构成第一重悬后的细胞核悬液；
[0045]
步骤b4，将第一重悬后的细胞核悬液进行第二过滤处理，第二过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行的，第二过滤处理后的滤液构成第二细胞核滤液；
[0046]
步骤b5，将第二细胞核滤液进行4℃、300g的条件下进行5min的第二离心处理，获得第二离心处理后的细胞核沉淀；
[0047]
步骤b6，将第二离心处理后的细胞核沉淀用0.2ml经4℃预冷的三号缓冲液(nb)重悬进行重悬混匀后进行第三过滤处理得到培养的贴壁细胞的细胞核悬液。
[0048]
进一步地，培养的贴壁细胞的细胞核悬液中的细胞核进行单细胞全基因扩增和扩增均一性检测前，再次进行重悬处理，重悬处理后的细胞核的浓度为1000个/μl。
[0049]
本发明的第四方面，提供了一种基于本发明第一方面细胞核提取方法的单细胞测序的方法，步骤包括：
[0050]
步骤c1，利用前述本发明第一方面细胞核提取方法提取待测样品中的细胞核；
[0051]
步骤c2，对细胞核进行单细胞全基因组测序，以便获得测序结果。
[0052]
本发明的第五方面，提供了一种基于本发明第二方面提取离体冰冻肿瘤组织的细胞核的方法获得的细胞核进行单细胞全基因组测序后在肿瘤进化机制研究、.癌症精准分型和肿瘤耐药机制、疗效预测研究中的应用。
[0053]
有益效果：
[0054]
1、破碎处理后的样品体积≤0.2mm3，使得样品充分裂解，提高细胞核核回收率。
[0055]
2、二号缓冲液中的bsa的存在，能保护核膜的完整性以及离散性，防止聚集结块。
[0056]
3、第一离心处理是在4℃、500g的条件下进行5min，实现在不影响核膜完整性的条件下，提高裂解产物的回收率。
[0057]
4、第一过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器，除去未裂解的组织及细胞团块同时收集尽可能多的细胞悬液；第二过滤处理、第三过滤处理是通过直径为40μm的细胞过滤器进行过滤，滤掉细胞碎片和组织团后减少最终检测受到的背景影响。
[0058]
5、预混pi在二号缓冲液(lb)中，节省实验时间。
[0059]
6、在三号缓冲液(nb)加入1％fbs在不影响后续实验结果的情况下，有助于保持细胞活性。
[0060]
7、细胞核进行单细胞全基因组测序前，进一步将细胞核进行重悬处理，使得细胞核的浓度为1000核/μl，进一步增加测序结果的准确率；
[0061]
8、本发明提供的细胞核提取方法提取效率高：细胞核完整性好；基因组损伤小；扩增均一性好。应用次方法可从较少的冰冻肿瘤组织中获得足量的单核用于单细胞全基因组测序。
[0062]
9、本发明提供的细胞核提取方法简便性高，只需简单的试剂耗材，不需要昂贵的分离设备；
附图说明
[0063]
图1是根据本发明实施例的细胞核及对照例获取的细胞核的光镜及pi染色后的照片示意图；
[0064]
图2是根据本发明实施例的细胞核基因组dna文库构建质检结果示意图；
[0065]
图3是根据本发明实施例的细胞核基因组dna文库构建质检结果示意图；
[0066]
图4是a549单个细胞基因组dna文库构建质检结果示意图；
[0067]
图5是根据本发明实施例和未优化的方法所得到的细胞核基因组dna用于下游文库构建的电子胶图结果示意图。
具体实施方式
[0068]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0069]
根据本发明的一个实施例，本发明提出了一种简便、高效地从冰冻肿瘤组织和培养细胞中分离细胞核的方法，所得单核悬液适用于单细胞全基因组扩增及下游测序，可应用于难以获得新鲜组织、可用冰冻组织替代的样本进行单细胞层面的肿瘤异质性等研究。
[0070]
根据本发明的一个具体实施例，本发明适用于冰冻肿瘤组织的细胞核分离，所涉及的内容主要包括4大部分：试剂配制、组织细胞裂解、细胞核清洗、核悬液检测。
[0071]
(一)试剂配制
[0072]
1.一号缓冲液(wb)：10-20mm tris-hcl(ph 7.5-7.8)，10-20mm nacl，50-100mm kcl，2-10mm mgcl2，5-15mm cacl2，0.04％bsa，1mg/ml pi以及0.2u/μl rnase抑制剂；
[0073]
2.二号缓冲液(lb)：1ml的wb加入2ul np-40。
[0074]
3.三号缓冲液(nb)：含1％fbs，1mm dtt的d-hanks缓冲液。
[0075]
(二)组织细胞裂解
[0076]
1.4℃预冷：pbs缓冲液，上述wb，lb和nb
[0077]
2.将6cm塑料培养皿放在冰上预冷，加入4ml预冷pbs对组织进行清洗，如果是培养的细胞将细胞去除培养液，用预冷pbs清洗，胰酶消化200g离心三分钟，去除上清液，再用预冷的pbs清洗后，离心弃上清备用；
[0078]
3.如果是肿瘤组织，将1～3mg组织放入预冷的离心管中，用预冷的研磨杵在冰上研磨至0.2mm3的碎块，冰上放置8～10min；
[0079]
4.吹吸10～15次将组织打散，用70μm细胞过滤器过滤到流式管中。
[0080]
(三)细胞核清洗
[0081]
1.将核悬液4℃500g离心5min；
[0082]
2.小心去上清，不要碰到核沉淀；
[0083]
3.加入0.3ml预冷的一号缓冲液(wb)，轻柔吹吸10次；
[0084]
4.用40μm细胞过滤器过滤到新离心管中；
[0085]
5.4℃300g离心5min；
[0086]
6.加入0.2ml预冷的三号缓冲液(nb)，轻柔吹吸10次重悬并用40μm细胞过滤器过滤。
[0087]
(四)核悬液检测
[0088]
用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。
[0089]
实施例1
[0090]
(一)试剂配制
[0091]
1.wb：10-20mm tris-hcl(ph 7.5-7.8)，10-20mm nacl，50-100mm kcl，2-10mm mgcl2，5-15mm cacl2，0.04％bsa，1mg/ml pi以及0.2u/μl rnase抑制剂；
[0092]
2.lb：1ml的wb加入2ul np-40；
[0093]
3.含1％fbs，1mm dtt的d-hanks缓冲液。
[0094]
(二)组织细胞裂解
[0095]
1.将pbs以及配制好的wb，lb和nb预冷；
[0096]
2.将塑料培养皿离心管等放在冰上预冷，在培养皿中加入4ml预冷pbs对组织进行清洗，组织块不超过3mg；
[0097]
3.将～3mg组织放入预冷的离心管中，用预冷的研磨杵在冰上研磨至0.2mm3的碎块，冰上放置5～10min；
[0098]
4.吹吸10～15次将组织打散，用70μm细胞过滤器过滤到流式管中；
[0099]
(三)细胞核清洗
[0100]
1.将核悬液4℃500g离心5min；
[0101]
2.小心去上清，不要碰到核沉淀；
[0102]
3.加入0.3ml预冷的一号缓冲液(wb)，轻柔吹吸10次；
[0103]
4.用40μm细胞过滤器过滤到新离心管中；
[0104]
5.4℃300g离心5min；
[0105]
6.加入0.2ml预冷的三号缓冲液(nb)，轻柔吹吸10次重悬并用40μm细胞过滤器过滤。
[0106]
(五)核悬液检测
[0107]
取10μl核悬液用用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。可知，细胞总浓度为2.46*106/ml，其中活细胞浓度为6.5*104/ml，占3％，死细胞浓度为2.39*106/ml，占97％，表明得到了单个悬浮的细胞核，无细胞碎片，裂解率97％；重复取样测试细胞总浓度为2.42*106/ml，其中活细胞浓度为4.69*104/ml，占2％，死细胞浓度为2.38*106/ml占98％，表明得到了单个悬浮的细胞核，无细胞碎片，裂解率98％。通过pi染色检测发现，在细胞总浓度为1*105/ml的条件下，有9.37*104/ml是细胞被染色，即染色率为93.7％。
[0108]
(六)基因组扩增均一性检测
[0109]
取1000个细胞核提取基因组dna进行mda扩增，并通过荧光定量pcr方法检测扩增均一性，其中人基因组扩增均一性实验的八个位点的引物序列如表1所示。未扩增的基因组dna的ruv值应为1，ruv值约接近1表示该位点的扩增均一性越好。一个样本的至少有6个位点的ruv值在0.25-4之间才可以进行下游文库构建。结果如表2所示，检测结果中人基因组上的八个位点扩增均一，符合标准，适用于下游基因组测序。
[0110]
表1人基因组扩增均一性实验的八个位点的引物
[0111][0112]
表2实施例和对比例以及通过实施例获取的单个细胞核人基因组扩增相对均一值
[0113][0114][0115]
(注：未扩增的基因组dna的ruv值应为1，ruv值约接近1表示该位点的扩增均一性越好；一个样本的至少有6个位点的ruv值在0.25-4之间才可以进行下游文库构建)
[0116]
对比例1(使用商品化的细胞分离试剂盒cat#52009-10)
[0117]
1.准备buffer，4℃预冷：
[0118]
实验开始前想lb溶液中加入bsa，使其终浓度为1％
[0119]
2.将离心管插在冰上预冷，加入1ml lb；
[0120]
将体积不超过3mm3冷冻组织样本加入lb中，用研磨杵充分研磨；
[0121]
3.冰上静置1～10min充分裂解；
[0122]
4.用70μm细胞过滤器过滤得到核悬液；将悬液转移到新的预冷离心管中；
[0123]
5.将滤液4℃500g离心5min；
[0124]
6.吸弃上清，保留沉淀；
[0125]
7.加入300ul pb1，充分吹打混匀；
[0126]
8.用将移液器吸头插至离心管底部，缓慢加入600ul pb2；
[0127]
9.用将移液器吸头插至离心管底部，缓慢加入600ul pb3；
[0128]
10.4℃、500g离心5min，从上到下为lb+pb1层，pb2层和pb3层；
[0129]
11.用移液枪缓慢吸弃上层1100ul液体；
[0130]
12.用p200的移液器吸取150ul左右的pb2层和pb3层交界处液体，即为细胞核层；
[0131]
13.向抽取出的细胞核层中加入0.5ml 4℃预冷处理的nb，通过直径为40μm的细胞过滤器；
[0132]
14.将悬液4℃500g离心5min；
[0133]
15.将细胞核沉淀用0.2ml预冷4℃的nb重悬进行重悬。得到所需的细胞核悬液。
[0134]
(五)核悬液检测
[0135]
取10μl核悬液用用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测核浓度和裂解效果。可知，细胞总浓度为3.1*106/ml，其中活细胞浓度为8.45*104/ml，占97.6％，死细胞浓度为3.02*106/ml，占2.4％，通过pi染色检测发现，在细胞总浓度为1*105/ml的条件下，仅有1.37*104/ml是细胞被染色，即染色率为13.7％，不符合进行下游扩增和测序的标准。
[0136]
(六)基因组扩增均一性检测
[0137]
1.取1000个细胞核提取基因组dna进行mda扩增，并通过荧光定量pcr方法检测扩增均一性。结果如表2所示，人基因组上的八个位点扩增不均一，无法进行下游基因组测序。
[0138]
对比例2(完整的单个人肿瘤细胞)
[0139]
(一)试剂配制
[0140]
1.细胞培养液、pbs、胰酶预温，2％fbs-pbs预冷；
[0141]
(二)培养细胞酶解消化
[0142]
1.吸弃培养皿中的细胞培养液，向培养皿中加入5ml预温的pbs对细胞进行清洗两次；
[0143]
3.吸弃pbs，向培养皿中加入1ml预温胰酶，消化至细胞松散；
[0144]
3.加8ml含血清的培养液终止消化，吹吸10～15次并将悬液用70μm细胞过滤器过滤至15ml离心管中；
[0145]
(三)培养细胞单细胞悬液制备清洗
[0146]
1.将细胞悬液常温200g离心5min；
[0147]
2.小心去上清，不要碰到细胞沉淀；
[0148]
3.将细胞离心沉淀用含1％fbs的pbs重悬，轻柔吹吸10次(五)单细胞悬液检测
[0149]
取10μl单细胞悬液用countess ii fl automated cell counter自动计数仪及台盼蓝光镜下检测细胞浓度和活细胞比例。可知，细胞总浓度为9.26*106/ml，其中活细胞浓度为8.98*106/ml，占96.9％，活细胞比例高，细胞活性好。
[0150]
(六)基因组扩增均一性检测
[0151]
1.用cellraft挑取48个单个细胞核进行mda扩增，随机选取一个并通过荧光定量pcr方法检测扩增均一性。结果如表2所示，人基因组上的八个位点扩增均一，适合进行下游基因组测序。
[0152]
本发明实施例的细胞核及对照例获取的细胞核的光镜及pi染色后的照片如图1所示，通过本发明实施例的细胞核(a、b)完整度高、均可被染色，质量优于对比例(c、d)。
[0153]
本发明实施例1的细胞核基因组dna文库构建质检结果如图2所示，文库片段主要集中于350-550bp之间，峰值在514bp，符合上机测序标准。本发明实施例1下游的文库质量优于优化前的方法下游构建出的文库。
[0154]
本发明对比例1的细胞核基因组dna文库构建质检结果如图3所示，文库片段主要集中于350-700bp之间，出现双峰，分别在470bp和625bp，不符合上机测序标准。
[0155]
本发明a549单个细胞基因组dna文库构建质检结果如图4所示，文库片段主要集中于400-550bp之间，峰值在530bp，符合上机测序标准。本发明下游的文库质量优于优化前的方法下游构建出的文库。
[0156]
如图5所示，本发明实施例1的细胞核(lane 1)及对比例1(lane 2)获取的细胞核的全基因组构建的文库的电子电泳图中本发明实施例1的细胞核(lane 1)片段较集中，表明基因组dna完整性较好，质量优于优化前，对比例1的产物基因组dna降解严重，可看出明显的弥散，无法进行dna测序。
[0157]
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除