一株植物内生真菌拟茎点霉D2G7及其应用的制作方法

columnaris，其于2020年11月9日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmcc no.21044，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0007]
本发明另一目的是提供上述植物内生真菌拟茎点霉d2g7的新用途，即将其应用在重金属铅、锌、镉污染的生物修复中，本发明提供的拟茎点霉d2g7有较强的重金属耐受性，且接种该内生真菌可以显著促进土荆芥在重金属胁迫条件下的生长，并增强植物对铅、锌、镉的积累。
[0008]
为了实现以上目的，本发明采取以下技术措施：a、采集重金属污染地矿渣区优势植物土荆芥的植物样品，于自来水下冲洗干净；b、将植物样品分为根、茎、叶三部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3~5min，无菌水冲洗3~5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2~3min，无菌水冲洗3~5次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；将根、茎、叶组织块剪成片段并贴于含有0.5g/l硫酸链霉素和0.5g/l青霉素的pda培养基上培养，24~26℃培养40~50天，隔天观察，见组织块周围有菌落长出则挑取，分离纯化后获得内生真菌菌株，并将内生真菌菌株制成菌悬液；c、将分离得到的内生菌株接种到pda平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含pb
2+
、zn
2+
或cd
2+
的pda培养基上及不含重金属的pda平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，mti），并将第6天的mti值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株；d、经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于pda斜面上备用，通过上述方法，将分离获得的真菌菌株命名为d2g7；e、菌株d2g7的鉴定d2g7形态学特征：pda培养基上产生灰白色菌丝，形成褐色至暗褐色菌落，菌丝具隔，大小差别较大，有时形成黑色扁平不规则形菌核；分生孢子有2种类型：a型孢子卵圆形至纺锤形，无色，单胞，通常含2个油球，是主要的一种；b型孢子线型，一端弯曲呈钩状，无色，单胞，不含油球，常不萌发。
[0009]
分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与ncbi上序列进行比对；结合形态学特征和分子鉴定结果，最终将该菌株鉴定为拟茎点霉（phomopsis columnaris）；该菌株保存和活化所用培养基均为pda培养基。
[0010]
本发明从重金属污染地植物中分离得到的重金属耐受菌株内生真菌拟茎点霉d2g7，同时进行盆栽实验，探讨其对重金属铅、锌、镉污染土壤植物修复的影响，即进行了拟茎点霉d2g7接种对盆栽土荆芥生长及对重金属累积能力的影响研究，为环境重金属污染提供真菌菌种和理论研究依据，具有重要的理论和实际研究价值。
[0011]
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：（1）菌种拟茎点霉d2g7来源于重金属污染地区，对重金属铅、锌、镉有极强的耐受性，且通过简单液体发酵即可获得大量的菌丝体，菌体易获取，成本低廉，拥有商业化应用的潜能；
（2）菌株d2g7接种植物后，能够定植于植物体内，并且能对植物的生长产生影响，增强植物对重金属铅、锌、镉的累积量，尤其是对重金属镉的修复效果较为明显。
附图说明
[0012]
图1为拟茎点霉d2g7在pda培养基上的菌落形态；图2为在低浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥谷胱甘肽含量的影响；图中t-gsh为总谷胱甘肽，gsh为谷胱甘肽，gssh为氧化型谷胱甘肽；图3为在低浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥生长的影响结果；图4为在低浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥mda、叶绿素含量的影响结果；图5为在高浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥谷胱甘肽含量的影响；图中t-gsh为总谷胱甘肽，gsh为谷胱甘肽，gssh为氧化型谷胱甘肽；图6为在高浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥生长的影响结果；图7为在高浓度重金属胁迫下接种拟茎点霉d2g7后对土荆芥mda、叶绿素含量的影响结果。
具体实施方式
[0013]
下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。本领域的普通技术人员可以参照本发明申请日之前的各种常用工具书、科技文献或相关的说明书、手册等加以实施。
[0014]
实施例1：拟茎点霉d2g7的分离、筛选与鉴定a、采集重金属污染地矿渣区优势植物土荆芥的植物样品，于自来水下冲洗干净；b、将植物样品分为根、茎、叶三部分分别进行表面消毒，首先用体积浓度75%的乙醇溶液浸泡3~5min，无菌水冲洗3~5次，再用有效氯浓度为5%的次氯酸钠溶液浸泡2~3min，无菌水冲洗3~5次，冲洗完后将其置于无菌滤纸上吸干水分；将根、茎、叶组织块剪成片段并贴于含有0.5g/l硫酸链霉素和0.5g/l青霉素的pda培养基上培养，24~26℃培养40~50天，隔天观察，见组织块周围有菌落长出则挑取，分离纯化后获得内生真菌菌株，并将内生真菌菌株制成菌悬液；c、将分离得到的内生菌株接种到pda平板上，用无菌打孔器沿菌落边缘打下直径为4.4mm的菌块，再将该菌块接种到含pb
2+
（9.66mmol/l）、zn
2+
（46.20mmol/l）或cd
2+
（1mmol/l）的pda培养基上（以pb（no3）2、znso4·
7h2o和cdso4·
8h2o分别配置得到）及不含重金属的pda平板上，25℃培养，隔天测量菌落直径，每个样品3个重复；用菌株在重金属平板上的菌落直径除以该菌株在不含重金属平板上的菌落直径所得值来反应菌株对重金属的耐受性（耐受性指数，mti），并将第6天的mti值超过50%的菌株定义为重金属耐受菌株；d、经过分离筛选后，将对重金属具有较强抗性的菌株保存于pda斜面上备用；通过上述方法，筛选得到一株耐铅、锌、镉的内生真菌，并将其命名为d2g7；e、菌株d2g7的鉴定 d2g7形态学特征：pda培养基上产生灰白色菌丝，形成褐色至暗褐色菌落，菌丝具
隔，大小差别较大，有时形成黑色扁平不规则形菌核；分生孢子有2种类型：a型孢子卵圆形至纺锤形，无色，单胞，通常含2个油球，是主要的一种；b型孢子线型，一端弯曲呈钩状，无色，单胞，不含油球，常不萌发（图1）； 分子鉴定：采用试剂盒提取该菌株总dna，经检测后送测序公司进行序列测定，将测序结果与ncbi上序列进行blast比对，其序列与拟茎点霉（phomopsis columnaris）同源性达99%，并结合该菌的形态学特征确定该菌株为拟茎点霉（phomopsis columnaris）。
[0015]
实施例2：拟茎点霉d2g7对低浓度重金属累积的影响研究 本实施例旨证明本发明提供的丝状真菌d2g7在重金属污染中对植物生长及植物重金属污染修复中的促进作用；以土荆芥（dysphania ambrosioides）为供试植物，实验过程如下：a、土荆芥无菌苗的准备：土荆芥种子样品于2018年8月10日采于会泽县者海镇三多多村旁废弃矿渣堆（北纬26
°
28
′
17
″
，东经103
°
37
′
34
″
，海拔2273 m），4℃保存备用，随机挑选若干粒土荆芥种子，按下列程序进行表面消毒：首先在体积浓度75%的乙醇溶液中浸泡3 min、无菌水冲洗4次；然后在有效氯浓度为5%的naclo溶液浸泡1min、用无菌水冲5次，将其置于无菌滤纸上吸干水分，备用。按加拿大水藓泥炭（canadian sphagnum peat）: v珠岩（perlite）体积比为7:3的比例制备混合土壤，于121℃高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，室温下冷却，均匀平铺于无菌平皿中（150
×ꢀ
20mm）。将表面消毒后的种子均匀播撒于其中，置于光照培养箱中，25℃光照10h与18℃避光14h下交替培养。培养期间注意观察种子萌发情况，在萌发期间，每2天浇一次无菌水，以浇透土壤但无积水为准；待种子萌发后，每3天浇一次无菌水，每7天浇等量混合营养液，种子萌发45d后，选取长势一致的幼苗备用。
[0016]
b、内生真菌接种剂和灭活剂的制备与接种：挑选之前保藏的纯净无污染的d2g7菌株接种到pda培养基中活化，置于28℃隔水式恒温培养箱中培养7天，挑选长势良好且无污染的平板，挑取菌丝体接种到pdb培养基中，于28℃、130rpm 的恒温摇床中培养3-5天，在无菌条件下，将等量菌丝体滤出，用无菌水冲洗2-3遍，避免菌丝体上沾有培养基，然后无菌剪刀剪碎，将剪碎后的菌丝转移至无菌水中制成菌悬液，加入无菌水定容至150ml，作为接种剂，对照组采用等量的无菌水。
[0017]
c、盆栽实验：
①
制备重金属土壤将加拿大泥炭藓（canadian sphagnum peat）按照体积比7:3的比例与珍珠岩（perlite）混合并充分搅拌均匀，作为培养基质，以每盆100g分装，分别按600mg/kg pb、800mg/kg zn和10mg/kg cd将pbcl2、zncl2、cdcl2·
2.5h2o加入到其中两组的每盆混合土壤中，最终制成含691.96mg/kg pb、1028.08mg/kg zn和11.696mg/kg cd混合重金属土壤，平衡15天后，用于复合重金属胁迫盆栽实验。所有土壤经121℃下高压蒸汽灭菌15min，间歇灭菌三次，每次间隔24h，而后放在室温下充分冷却，备用；将上述处理好的低浓度和高浓度组土壤，选取若干长势一致的土荆芥幼苗，移栽至各组土壤中，每盆移栽一株，将移栽好的低浓度和高浓度组盆栽植物各随机分成2组（group 1和group 2），每组20个重复；
②
将上述的菌悬液及无菌水分别接种到group 1（实验组）和group 2（对照组）茎、叶及根部，每株接种3ml，每个部位1ml，分别在移栽后的第10天、第17天、第27天、第37天进行接
种处理，共接种4次，将苗放在室温下（18-25℃）自然光照培养，培养期间每3天浇一次无菌水或混合营养液（交替进行），每盆浇灌100ml（以水浇透土壤而又不溢出盆底部为宜），实验过程中密切观察各组土荆芥苗的生长状况，46d后收获，并测定植物和土壤中的总镉、总铅、总锌的含量，并计算：（1）生物累积系数（baf）根据wilkins所描述的公式进行计算：；（2）转运系数（tf）：根据khan所描述的公式进行计算：；结果如表1、表2所示，在重金属累积方面，接种d2g7，实验组土壤中pb、zn、cd含量显著低于对照组（p<0.05, t检验），且实验证明了本发明所提供的菌株d2g7可促进植物对重金属镉的富集，达到对镉污染土壤进行修复的目的；实验组中重金属pb、zn和cd的转运系数均高于对照组，不同重金属的tf值表现为：zn>cd>pb。此外，实验组中植物地上部分重金属zn和cd的生物累积系数高于对照组，但重金属pb却发生降低，具体的baf表现为：cd>zn>pb；无论是地上部分还是地下部分，重金属累积系数的表现均为：cd>zn>pb。
[0018]
表1 低浓度重金属胁迫下接种d2g7菌株对土荆芥重金属富集的影响注：以a为标准，b表示与a产生显著性差异，c表示与a与b均产生显著性差异（p<0.05，t检验）；表2低浓度重金属胁迫下接种d2g7菌株的重金属转移系数和累积系数。
[0019]
实施例3：拟茎点霉d2g7在低浓度重金属胁迫下对土荆芥生长的影响实验过程和技术方法同实施例2，所不同的是在土荆芥生长期间，增加了土荆芥苗生物量的测定；于土荆芥苗移栽第46天收割土荆芥苗，测定株高、根长、干重、mda、叶绿素、谷胱甘肽gsh等；gsh=t-gsh-2gssg计算gsh含量； 盆栽实验结果如图2、3、4所示，接种拟茎点霉d2g7的处理组分别提高了土荆芥的根
长、干重和叶绿素含量，提高量分别为6.02%、4.34%和4.37%。然而，处理组的株高、t-gsh、gsh 和gssg 含量却分别降低了9.93%、38.41%,、52.48% 和14.71%。其中株高、叶绿素、t-gsh和gsh在实验组和对照组间产生了显著性差异（p<0.05, t检验）。
[0020]
实施列4：拟茎点霉d2g7对高浓度重金属累积的影响研究实验过程和技术方法同实施例2，所不同的是土壤中加入重金属的浓度，即将含800 mg/kg pb、1000 mg/kg zn和15mg/kg cd的重金属加入到该浓度组的每盆混合土壤中，最终制成含891.96mg/kg pb、1228.08mg/kg zn和15.696mg/kg cd混合重金属土壤；重金属累积结果见表3、4，实验组中土壤中pb、cd含量均低于对照组，zn有所提高，但差异均却不显著（p＞0.05, t检验）。相反，相比于对照组，重金属zn和cd在植物地上部分和地下部分的含量均有提高；重金属pb含量却呈现降低状态。此外，相比于对照组，实验组的转移系数在重金属pb水平上发生了提高，但在重金属zn和cd水平上却发生了降低，不同重金属间呈现的状态为：zn>cd>pb；实验组的地上和地下部分重金属累积系数在zn和cd水平上发生了提高，但在重金属pb水平上却发生了降低，不同重金属间地上部分和地下部分baf值得呈现状态均为：cd>zn>pb。
[0021]
表3：高浓度重金属胁迫下接种d2g7菌株对土荆芥重金属富集的影响注：以a为标准，b表示与a产生显著性差异，c表示与a与b均产生显著性差异（p<0.05，t检验）；表4：高浓度重金属胁迫下接种d2g7菌株的重金属转移系数和累积系数。
[0022]
实施例5：拟茎点霉d2g7在高浓度重金属胁迫下对土荆芥生长的影响实验过程和技术方法同实施例4，所不同的是在土荆芥生长期间，增加了土荆芥苗生物量的测定；于土荆芥苗移栽第46天收割土荆芥苗，测定株高、根长、干重、mda、gsh、叶绿素等生物量；盆栽实验结果图5、6、7所示，土荆芥的株高、叶绿素、t-gsh和gssg含量分别提高了0.37%、1.64%、1.11% 和 95.00%；然而根长、干重和gsh含量却分别降低了7.03%、11.76%和20.34%；处理组的mda含量相比于对照组降低了16.67%。其中，只有gssg和mda含量在处理组
和对照组间有显著性差异（p<0.05, t检验）。
[0023]
上述实施案例的结果说明本发明中分离获取的拟茎点霉菌株d2g7能对土荆芥在复合重金属土壤中的生长产生一定影响；同时，接种该内生真菌后，能降低土壤中的重金属浓度，影响植物重金属富集累积能力，对修复复合重金属土壤污染产生一定促进作用，是一株非常有开发潜力的菌株。

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