大黄鱼抗菌肽piscidin5liketype4及其制备方法与应用与流程

大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like type 4及其制备方法与应用
技术领域
[0001]
本发明涉及大黄鱼抗菌肽，尤其是涉及大黄鱼抗菌肽piscidin 5 liketype 4及其制备方法与应用。


背景技术：

[0002]
piscidins是一类两亲性的阳离子抗菌肽家族。piscidins首次被从杂交斑纹鲈(moronechrysops
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m.saxatilis)的肥大细胞中分离出来(silphaduang u.,noga e.j.antimicrobials-peptide antibiotics in mast cells of fish[j].nature,2001,414(6861):268-269)。诸多研究发现piscidins具有广谱抗菌、抗病毒、抗寄生虫和抗肿瘤活性(pan y,zheng lb,mao y,et al..the antibacterial activity and mechanism analysis of piscidin 5like from larimichthyscrocea[j].developmental&comparative immunology,2019(92):43-49.；niu sf.study on the antiparasitic characterization of piscidin-like in two sciaenoid fishes[d].xiamen:xiamen university,2013,1-163；[4]zhou hm,li dc,wang yy,et al..antimicrobial peptide pc-pis:a new cancer cell killer[j].fish&shellfish immunology,2018,(81):368-373)。免疫组化和基因组数据显示piscidins普遍存在于鲈形目鱼类中的皮肤、肠道上皮细胞，作为第一道防线预防入侵，也存在于鳃、头肾、肝脏及脾脏的肥大细胞中参与抗感染免疫反应(silphaduang u,colorni a,noga ej.evidence for widespread distribution of piscidin antimicrobial peptides in teleost fish[j].disease aquatic organisms,2006,72(3):241
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52.；[6]salger sa,cassady kr,reading bj,et al..a diverse family of host-defense peptides(piscidins)exhibit specialized anti-bacterial and anti-protozoal activities in fishes[j].plos one,2016,11(8):1-25.；[7]zheng lb,qiu jy,chen j,et al..histopathological changes and piscidin 5-like location in infected larimichthyscroceawith parasite cryptocaryon irritans[j].fish&shellfish immunology,2020,(99):52-58.)。
[0003]
通过成孔、靶向一些特定受体(yang j,lu xj,chai fc et al..molecular characterization and functional analysis of apiscidin gene in large yellow croaker(larimichthyscrocea)[j].zoological research,2016,37(6):347-355)扰乱细胞膜的正常功能，抑或抑制细胞壁、核酸或一些酶活来杀菌(campagana s,saint n,molle g,et al..structure mechanism of action of the antimicrobial peptide piscidin[j].biochemistry,2007,46(7):1771
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8)。piscidin1能够引起金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureu)细胞膜的严重去极化，可能由于带有更高正电荷形成更稳定的α-螺旋结构，人工修饰肽pis-1[nkg]能渗透进入大肠杆菌(escherichia coli)中并在其中积累而影响细胞内正常代谢(noga ej,silphaduang u,park ng,et al..piscidin 4,a novel member of the piscidin family of antimicrobial peptides[j].comparative biochemistry&physiology part b,2009,152(4):299
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305)。健康杂交斑纹鲈鳃组织中40μ
g/ml的piscidin2的生理浓度远高于最小抑菌浓度(3.125～6.26μm)足可以抗感染(corrales j,mulero i,mulero v,et al..detection of antimicrobial peptides related to piscidin 4in important aquacultured fish[j].developmental&comparative immunology,2010,34(3):331
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343)。大黄鱼(larimichthyscrocea)piscidin-like(lc-pis)能够杀灭大部分的受检菌种，而眼斑拟石首鱼(sciaenopsocellatus)piscidin-like(so-pis)无任何抗菌活性。因此，可能piscidin家族每一个成员的的功能特征都是独特的。
[0004]
piscidin 5是pisidin家族的一个成员，是从杂交版纹鲈克隆piscidin 4的时候意外获得(salger sa,reading bj,baltzegar da,et al..molecular characterization of two isoforms ofpiscidin4from the hybrid striped bass(moronechrysops
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moronesaxatilis)[j].fish&shellfish immunology,2011,30(1):420-424)。相比于piscidin 5-like type 1，piscidin 5-liketype 2在氨基酸水平上有4个氨基酸的突变和一个氨基酸的缺失，二者是一个典型的头肾型表达基因(zhou qj,su yq,niu sf,et al..discovery and molecular cloning of piscidin-5-like genefrom the large yellow croaker(larimichthyscrocea)[j].fish&shellfish immunology,2014,41(2):417-420)。体外的重组蛋白rlc-pis能够杀灭一些特定的水产致病菌，抑制一些弧菌，rlc-pis通过靶向一些病原相关的分子模式，如lps、lta来破坏细胞膜的结构；同时，还能结合到基因组dna上扰乱正常的代谢。piscidin 5-like type 3的合成肽能够提高大黄鱼感染溶藻弧菌(vibroalginolyticus)后的存活率，降低血液中细菌的量及interleukin-1β、interleukin-10、tumor necrosis factor-α基因的表达量(yang j,lu xj,chai fc et al..molecular characterization and functional analysis of apiscidin gene in large yellow croaker(larimichthyscrocea)[j].zoological research,2016,37(6):347-355.)。


技术实现要素：

[0005]
本发明的第一目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4基因的编码序列。
[0006]
本发明的第二目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的氨基酸序列。
[0007]
本发明的第三目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的制备方法。
[0008]
本发明的第四目的在于提供大黄鱼抗菌肽piscidin 5-like type 4的应用。
[0009]
所述大黄鱼抗菌肽piscidin 5 like type 4命名为lc-p5l4。
[0010]
所述大黄鱼抗菌肽lc-p5l4基因的编码序列为：
[0011][0012]
所述大黄鱼抗菌肽lc-p5l4的氨基酸序列为：
[0013][0014]
重组蛋白rlc-p5l4的制备方法，包括以下步骤：
[0015]
1)构建lc-p5l4重组表达载体；
[0016]
2)将步骤1)所得的重组表达载体转化宿主细胞，并对宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
[0017]
3)分离纯化步骤2)所得的表达产物，获得重组蛋白，即rlc-p5l4。
[0018]
在步骤1)中，所述表达载体可选用pet-32a。
[0019]
在步骤2)中，所述宿主细胞可选用e.coli bl21(de3)。
[0020]
在步骤3)中，可先将步骤2)所得的表达产物进行透析，再进行亲和层析。
[0021]
所述重组蛋白rlc-p5l4可在制备抗菌药物和作为水产养殖业中防治美人鱼发光杆菌感染疾病的饲料添加剂中应用。
[0022]
所述rlc-p5l4只对美人鱼发光杆菌具有独特的抑杀活性，因此所述大黄鱼抗菌肽piscidin5-like type 4在制备抗菌药物和作为水产养殖业中防治美人鱼发光杆菌感染疾病的饲料添加剂中具有广泛的应用价值。
[0023]
本发明在分离得到lc-p5l4的基础上，根据lc-p5l4基因序列特征成功构建重组表达载体并在大肠杆菌系统中表达并纯化获得重组rlc-p5l4蛋白，该重组蛋白具有抗美人鱼发光杆菌的活性。研究结果表明，lc-p5l4是一种重要的先天免疫因子，参与大黄鱼的抗美人鱼发光杆菌感染反应，因此，重组基因工程产品rlc-p5l4在抗菌新药及添加剂的开发中具有非常诱人的应用前景。
附图说明
[0024]
图1为pet-32a原核表达载体构建图。
[0025]
图2为pet-32a-lc-p5l4重组质粒在e.coli bl21(de3)中的诱导表达电泳图。左图为sds-page分析pet-32a-lc-p5l4重组大肠杆菌iptg诱导表达菌体超生破碎后分离上清与沉淀的电泳图，右图为纯化产物的western blot图。图中，m为sds-page标准蛋白质marker，1:iptg诱导前含重组质粒的e.coli bl21(de3)总细胞提取物，2为iptg诱导的重组蛋白，3为菌体超生破碎后沉淀，4为超声波处理后的上清液。
[0026]
图3为40μm rlc-p5l4与美人鱼发光杆菌共孵不同时间的扫描电子显微镜图。其中，图a为未经处理的空白对照或经rtrx-his-tag处理的阴性对照。图b-d为分别用rlc-p5l4处理30min(b)、1h(c)、2h(d)。
[0027]
图4为40μm rlc-p5l4与美人鱼发光杆菌共孵不同时间的透射电子显微镜图。图a为未经处理的空白对照或经rtrx-his-tag处理的阴性对照。图b-d为分别用rlc-p5l4处理1h(b)、2h(c-d)。
具体实施方式
[0028]
以下实施例将结合附图对本发明作进一步的说明。
[0029]
实施例1大黄鱼lc-p5l4原核重组表达载体的构建
[0030]
根据pet-32a载体多克隆位点，设计带有限制性内切酶位点的特异性引物bnp54-f/r扩增编码大黄鱼piscidin 5-like type 4基因orf(不含信号肽)。bnp54-f的5
′
端添加ecor i酶切位点；bnp54-r的5
′
端添加hind iii酶切位点。
[0031]
bnp54-f：5
′-
ccggaattccaaattgtctacgg-3
′
；
[0032]
bnp54-r：5
′-
cccaagctttttgctgccgtcgt-3
′
。
[0033]
扩增lc-p5l4的编码区片段。pcr反应条件为：94℃预变性5min；94℃变性45s，58℃退火45s，72℃延伸45s，重复35个循环；72℃延伸10min。
[0034]
利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收pcr产物，回收的pcr产物经ecor i和hind iii酶切后纯化回收，与ecor i和hindiii双酶切线性化的pet-32a载体连接，构建好大肠杆菌表达重组载体pet-32a-lc-p5l4，测序鉴定读码框准确无误。
[0035]
pet-32a-lc-p5l4载体构建图参见图1。
[0036]
实施例2 pet-32a-lc-p5l4重组质粒在e.coli bl21(de3)中的诱导表达
[0037]
测序正确的质粒pet-32a-lc-p5l4经热激法转化至e.coli bl21(de3)大肠杆菌中，并用iptg诱导表达。
[0038]
结果显示，与诱导前相比，pet-32a-lc-p5l4重组质粒转化的e.coli bl21(de3)有明显的重组蛋白的诱导表达，蛋白条带在25kda左右(参见图2)。
[0039]
实施例3 pet-32a-lc-p5l4重组质粒转化的e.coli bl21(de3)中iptg诱导后的表达产物纯化
[0040]
利用亲和层析法纯化rlc-p5l4重组蛋白，大量诱导表达的阳性重组e.coli bl21(de3)后，上层清液被离心法收获,通过0.22μm过滤器过滤后，上清液通过hiscap 6ff柱，对rlc-p5l4进行亲和吸附，该柱经过无菌milliq水和tris-hcl缓冲液(50mm tris-hcl,500mm nacl,20mm咪唑，ph 7.8)预处理。然后用akta净化器100梯度咪唑清洗柱洗脱。收集洗脱组分，经sds-page电泳分析，可见约25kda的单一条带(参见图2)。
[0041]
实施例4 纯化产物的western blot分析
[0042]
经western blot分析，所获取的纯化产物为大黄鱼piscidin 5-like type 4蛋白。
[0043]
实施例5 rlc-p5l4的抗美人鱼发光杆菌活性鉴定
[0044]
rlc-p5l4的抗美人鱼发光杆菌活性鉴定：将目的蛋白溶解成目的浓度后，与清洗好的美人鱼发光杆菌以1
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108cuf/ml室温共孵2h，并在不同时间取样进行2.5％戊二醛固定，固定好的一部分美人鱼发光杆菌经酒精梯度脱水、临界点干燥、喷金后再扫描电子显微镜下观察，阴性对照组为40μm rtrx-his-tag共孵菌株，实验组为40μm rlc-p5l4与菌株共孵。结果显示，相比于空白对照组和阴性对照组，实验组中美人鱼发光杆菌菌体胞膜塌陷，
随着孵育时间的延长，胞膜出现空洞，明显观察到外泄的内容物。
[0045]
2.5％戊二醛固定好的另一部分美人鱼发光杆菌经pbs清洗收集菌体后，包埋到琼脂糖凝胶模。胶模经锇酸再固定2h、pbs清洗、脱盐、低浓度乙醇初级脱水后醋酸铀4℃染色；染色后的胶模pbs清洗、高浓度乙醇脱水后丙酮透性处理，包埋盒中70℃加热24h后行70nm的超薄切片，切片于柠檬酸铅中染色后观察。结果发现rlc-p5l4处理后的菌体变形、胞膜成孔、内容物外泄。
[0046]
由此可见，rlc-p5l4具有独特的美人鱼发光杆菌活性。
[0047]
图3为40μm rlc-p5l4与美人鱼发光杆菌共孵不同时间的扫描电子显微镜图。其中，图a为未经处理的空白对照或经rtrx-his-tag处理的阴性对照。图b-d为分别用rlc-p5l4处理30min(b)、1h(c)、2h(d)。图4为40μm rlc-p5l4与美人鱼发光杆菌共孵不同时间的透射电子显微镜图。图a为未经处理的空白对照或经rtrx-his-tag处理的阴性对照。图b-d为分别用rlc-p5l4处理1h(b)、2h(c-d)。
[0048]
本发明根据大黄鱼抗虫肽piscidin 5-like type 4基因序列特征，构建原核表达载体、转化大肠杆菌iptg诱导表达并纯化获得rlc-p5l4重组蛋白，从而鉴定重组蛋白抗美人鱼发光杆菌的活性。

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