一种筛选双孢蘑菇A15菌株耐高温菌株的引物及方法与流程

一种筛选双孢蘑菇a15菌株耐高温菌株的引物及方法
技术领域
[0001]
本发明属于食用菌育种技术领域，涉及一种筛选双孢蘑菇a15菌株耐高温菌株的引物及方法。


背景技术：

[0002]
双孢蘑菇(agaricusbisporus)，又称洋蘑菇、白蘑菇，是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌。据2005年的相关统计，双孢蘑菇已在世界上100多个国家广泛种植，其产量约占世界使用总产量的40％左右，其中我国是排名第一的蘑菇生产大国，据2018年食用菌协会统计，双孢蘑菇产量达到2483295.14吨，成为继香菇和平菇之后的第三大我国主栽品种。这说明在我国，双孢蘑菇消费市场发展迅速，鲜菇市场销售日益渐旺。另外，其含有丰富的蛋白质、多糖、维生素、核苷酸和不饱和脂肪酸，不仅营养丰富，肉质肥美，味道鲜美，而且热能低，具有很高的医疗保健作用，日益受到各国人民的喜爱。
[0003]
双孢蘑菇在生长发育过程中，温度是最为关键的限制性因素，对其产量和品质都有较大的影响。双孢蘑菇对温度的要求分为两个阶段，其菌丝体发育温度范围为4-32℃。双孢蘑菇菌丝生长阶段的最适合温度应保持在22-25℃。双孢蘑菇子实体生长发育的温度范围是4-25℃，对栽培环境进行温度调控是双孢蘑菇栽培过程中的主要调控因子之一。如果温度过高，双孢蘑菇的营养菌丝体生长速度快，但稀疏、细弱无力，甚至死亡；对于子实体发育而言，高温会使菌丝养分消耗大，致使幼菇枯萎，产量减少，品质下降，严重限制了双孢蘑菇产业发展速度。因此，选育双孢蘑菇耐高温的优良菌株是解决这一问题的方法之一。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于提供一种筛选双孢蘑菇a15菌株的耐高温菌株的引物及方法。
[0005]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种筛选双孢蘑菇a15菌株耐高温菌株的引物，所述引物的序列为：
[0006]
9486-2f2：aactaactaacacaccaa；
[0007]
9486-2r2：ttggtgtgttagttagtt。
[0008]
为实现上述目的及其他相关目的，本发明提供的技术方案是：一种筛选双孢蘑菇a15菌株耐高温菌株的方法，包括下列步骤：
[0009]
步骤1：提取a15菌株dna
[0010]
将待检测的双孢蘑菇a15菌株在pda平板上进行培养，然后挑取菌丝，用dna裂解液对挑取的菌丝进行裂解，得到菌丝裂解液；
[0011]
步骤2：pcr扩增
[0012]
以菌丝裂解液作为pcr扩增的模板，使用权利要求1所述的引物9486-2f2和9486-2r2进行pcr扩增；
[0013]
步骤3：如果可以扩增出产物大小为388bp的条带，则其为耐高温菌株，反之则为不耐高温菌株。
[0014]
优选的技术方案为：94℃预变性5min，95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，10min，4℃保存。
[0015]
优选的技术方案为：pcr扩增体系为：总体积为20μl，包括10μl的pcr mix，7ul的双蒸水，1ul的引物9486-2f2，1ul的引物9486-2r2和1ul的菌丝裂解液。
[0016]
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有的优点是：
[0017]
本发明以a15菌株的dna为模板，耐高温菌株可以获得长度为388bp的特异性产物，正常菌株无此特异性产物，以区别耐高温菌株和出发菌株。通过pcr扩增的方法可以快速、准确和简单地鉴定a15耐高温菌株，不仅大大缩短了选育a15菌株的进程，还提高了选育耐高温菌株的准确率。
附图说明
[0018]
图1为9486分子标记筛选电泳图。注：m：d2000 marker；ck:a15出发菌株扩增结果；1-4：a15的4株耐高温菌株的菌株扩增结果。
[0019]
图2为a15菌株孢子菌株的pcr扩增电泳图。注：m：d2000marker；ck:a15出发菌株；1-22：用温度筛选过的孢子菌株。
具体实施方式
[0020]
以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效。
[0021]
请参阅图1-2。须知，本说明书所附图式所绘示的结构、比例、大小等，均仅用以配合说明书所揭示的内容，以供熟悉此技术的人士了解与阅读，并非用以限定本发明可实施的限定条件，故不具技术上的实质意义，任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整，在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下，均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。同时，本说明书中所引用的如“上”、“下”、“左”、“右”、“中间”及“一”等的用语，亦仅为便于叙述的明了，而非用以限定本发明可实施的范围，其相对关系的改变或调整，在无实质变更技术内容下，当亦视为本发明可实施的范畴。
[0022]
实施例1：一种快速筛选双孢蘑菇a15菌株的耐高温菌株的引物及方法
[0023]
对筛选得到的a15的4株高温菌株和出发菌株进行基因组重测序和比较分析，挑选碱基序列有差异的基因进行验证，筛选得到了编号为9486的基因，序列为seq.no.3。根据基因9486基因设计引物9486-2f2和9486-2r2，序列分别为seq.no.1和seq.no.2。用作筛选双孢蘑菇a15菌株的耐高温菌株的引物。其具体步骤如下：
[0024]
(1)提取a15菌株dna
[0025]
收集的双孢蘑菇a15菌株在pda平板上进行培养，待平板上的菌落直径约为2cm，挑取菌丝，用dna裂解液对挑取的菌丝进行裂解，得到的裂解的液体作为pcr模板。dna裂解液购自上海生工生物工程股份有限公司。
[0026]
(2)pcr扩增
[0027]
以菌丝裂解液作为pcr模板，使用引物9486-2f2和9486-2r2进行普通pcr扩增。
[0028]
两个引物序列为：9486-2f2：aactaactaacacaccaa；
[0029]
9486-2r2：ttggtgtgttagttagtt。
[0030]
(3)pcr扩增条件
[0031]
上述pcr扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个循环，72℃，5min，4℃保存。
[0032]
pcr扩增体系为：总体积为20μl,包括10ul pcr mix，7ul双蒸水，1μl引物9486-2f2，1μl引物9486-2r2和dna模板1μl。pcr mix购自大连宝生公司。
[0033]
(4)耐高温菌株筛选
[0034]
利用引物9486-2f2和9486-2r2进行普通pcr扩增的产物大小为388bp，如果以a15菌株的杂交菌株或者孢子菌株的dna为模板，用引物9486-2f2和9486-2r2进行pcr扩增，如果可以扩增出产物大小为388bp的条带(图1)，视其为耐高温菌株，反之亦然。
[0035]
为了快速、简单和高效地鉴定双孢蘑菇耐高温菌株，对双孢蘑菇出发菌株和其耐高温菌株基因组差异序列大的地方挑选出来，并设计引物9486-2f2和9486-2r2如果该引物能在5株测序的耐高温菌株中扩增出来，在出发菌株中扩增不出来，该引物就可以作为鉴定该双孢蘑菇菌株的耐高温菌株。
[0036]
本发明对筛选得到的a15的4株高温菌株和出发菌株进行基因组重测序和比较分析，挑选碱基序列有差异的基因进行验证，筛选得到了编号为9486的基因，在突变位点上设计引物，以a15菌株的dna为模板，耐高温菌株可以获得长度为388bp的特异性产物，正常菌株无此特异性产物，以区别耐高温菌株和出发菌株。通过pcr扩增的方法可以快速、准确和简单地鉴定a15耐高温菌株，不仅大大缩短了选育a15菌株的进程，还提高了选育耐高温菌株的准确率。
[0037]
实施例2：一种快速筛选双孢蘑菇a15菌株的耐高温菌株的引物及方法
[0038]
1.a15菌株的孢子菌株的收集
[0039]
将开伞的a15菌株的子实体放入孢子收集器收集孢子，将孢子涂布在pda平板上，涂布的孢子浓度为103/ml，每个直径为9cm的平板涂布100ul孢子悬液，放入25℃培养箱进行培养。
[0040]
2.a15菌株孢子菌株温度的处理
[0041]
将萌发的孢子菌株用40℃处理24小时后，转移到25℃继续培养，可以继续生长的孢子菌株作为耐高温菌株的备选。
[0042]
3.a15孢子菌株dna提取
[0043]
挑取50mg的孢子菌株的菌丝放入1.5ml的离心管中，加入50ul的dna裂解液，80℃温育5min，dna提取液制备完成。
[0044]
4.pcr扩增
[0045]
以孢子菌株的dna提取液做模板，以9486-2f2和9486-2r2为引物，进行pcr扩增。
[0046]
两个引物序列为：9486-2f2：aactaactaacacaccaa；
[0047]
9486-2r2：ttggtgtgttagttagtt。
[0048]
5.pcr扩增条件
[0049]
上述pcr扩增程序为：94℃预变性5min，95℃变性30s，50℃退火30s，72℃延伸1min，35个，72℃，5min，4℃保存。
[0050]
pcr扩增体系为：总体积为20μl，包括10ul pcr mix，7ul双蒸水，1ul引物9486-f，1ul引物9486-r和dna模板1ul。
[0051]
6.耐高温菌株筛选
[0052]
利用引物9486-f和9486-r进行普通pcr扩增的产物大小为388bp，如果以a15菌株的孢子菌株的dna为模板，用引物9486-f和9486-r进行pcr扩增，如果可以扩增出产物大小为388bp的条带(图2)，视其为耐高温菌株，反之亦然。
[0053]
以上所述者仅为用以解释本发明之较佳实施例，并非企图具以对本发明做任何形式上之限制，是以，凡有在相同之发明精神下所作有关本发明之任何修饰或变更，皆仍应包括在本发明意图保护之范畴。
[0054]
[0055]

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