一种用于检测肝癌的试剂组合，试剂盒及其用途的制作方法

[0001]
本发明属于分子生物学检测领域，具体地，属于肝癌检测领域，更具体地，涉及肝癌基因标志物的甲基化水平的检测。


背景技术：

[0002]
肝癌是世界上最常见的和最致命的疾病之一，危害极大的恶性肿瘤。全球高达50％肝癌患者均在中国，是我国第4位常见恶性肿瘤及第2位肿瘤致死病因。据2019年发布的《2015年中国恶性肿瘤流行情况分析》数据显示，2015年我国肝癌发病约37.0万人；因肝癌死亡约32.6万人，正严重威胁我国人民的生命和健康。肝癌起病隐匿，早期无特异性症状，大多数肝癌患者在就诊时已是中晚期，手术治愈率低，生存期短。
[0003]
目前，血清甲胎蛋白(alpha fetal protein，afp)和超声检查是当前临床上诊断肝癌常用而又重要的方法，然而其灵敏度和特异度并不理想。afp筛查的灵敏度只能达到40-60％，许多早期肝癌患者的afp水平总是维持在一个正常水平；而在相当一部分肝病患者中也存在着afp异常升高的情况；超声检测则非常依赖于仪器和人为操作，受医疗资源分布的限制和医生的经验影响；超声造影和穿刺等检查则存在操作复杂、创伤等缺点，不适用于早筛早诊。寻找准确、稳定、有效的肝癌分子标志物对肝癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。
[0004]
肿瘤标志物检测是近年发展起来的用于检测疾病的方法，而寻找准确、稳定、有效的肝癌分子标志物对肝癌进行早期诊断、早期治疗具有重要意义。而随着科学界对肿瘤的认识逐渐深入，越来越多的研究证实细胞表观遗传水平的改变是肿瘤发生与发展的关键事件。dna甲基化、组蛋白修饰及mirna表达异常均属于表观遗传学改变，而肿瘤发生的核心环节也与dna异常甲基化相关。dna甲基化检测稳定性好，易于检测且其异常程度常与癌症的进展相关，是最具肿瘤早筛潜力的标志物，目前已有基于dna甲基化检测的结直肠癌、胃癌等肿瘤辅助诊断产品获得fda或cfda的认证，但尚无肝癌的筛查产品获批上市。
[0005]
很多研究通过检测外周血中的肿瘤细胞或dna甲基化变化，寻找用于肝癌早期诊断的标志物。美国exact sciences公司基于甲基化检测的早期肝癌筛查临床研究显示，在135例hcc(hepatocellular carcinoma)病例和308例对照参与的临床试验中，这一血液检测在诊断早期hcc患者时达到了71％的灵敏度度和90％的特异性。该项目获得了fda突破性医疗器械认定，但其临床研究主要基于欧美人群且存在灵敏度偏低的缺陷；专利cn107164508a通过检测9个基因的5-羟甲基胞嘧啶含量检测肝癌，其具有较优良的检测性能，灵敏度为90％，特异性为91.3％，但其入组的样本并不包含肝硬化、肝炎等肝癌高风险人群，因此可能存在特异性偏低的不足。
[0006]
因此，本领域需求一种基于dna甲基化检测的兼具高灵敏度高特异性的肝癌诊断产品，在肝癌的早期阶段即能进行检出。


技术实现要素：

[0007]
本发明通过在tcga和geo数据库搜集和构建肝癌相关的甲基化大数据集，采用生物信息学方法筛选出有应用开发潜力的肝癌dna甲基化标记物，通过大量研究，申请人发现znf397os基因的甲基化位点的甲基化水平与肝癌有着密切的联系，而在此之前，本领域通常仅认为znf397os是一种锌指蛋白，研究表明其具有调控dna结合转录因子活性的功能，尚无文献报导其与肝癌存在关联。
[0008]
第一方面，本发明提供一种用于检测肝癌的试剂组合，所述试剂组合包括用于检测znf397os基因的cg16657538甲基化位点的甲基化水平的检测试剂。
[0009]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合检测以下区域的甲基化水平：cgccccactcacccttcgctctaccggcggcggcgggaacccacccccgggagcgagaacaatgcccggccgcacgcgcgccggaagtgggagagtgcccctctaggagcccggaggaccgcagctctgtggcaggcgcgggtcgtgtctcgcaggaggggcgcgggtccggctcagacctggcgggggcatcgcagagtacaagcggttgacgcg(seq id no:1)。
[0010]
使用本发明的试剂组合，以较少的标志物就能够在临床上的组织样本中以0.910的灵敏度、0.950的特异性，和0.941的曲线下面积，以及在游离dna样本中0.7619的灵敏度、0.9574的特异性和0.8948的曲线下面积对肝癌进行检测，通过检测该基因的一个甲基化位点就能够对肝癌灵敏和特异性地检出，其成本和时间均得到节约；而使得其在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。
[0011]
在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少一个的甲基化水平的检测试剂：
[0012]
grasp、pak1、ppfia1，以及otx1。
[0013]
所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少两个的甲基化水平的检测试剂：
[0014]
grasp、pak1、ppfia1，以及otx1。
[0015]
所述试剂组合进一步包括用于检测以下基因中任意至少三个的甲基化水平的检测试剂：
[0016]
grasp、pak1、ppfia1，以及otx1。
[0017]
所述试剂组合进一步包括用于检测以下四个基因的甲基化水平的检测试剂：
[0018]
grasp、pak1、ppfia1，以及otx1。
[0019]
在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂可以是检测整个基因平均甲基化水平的检测试剂。
[0020]
在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因片段的平均甲基化水平的检测试剂。
[0021]
在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂也可以是检测一个基因启动子区域或其片段的平均甲基化水平的检测试剂。
[0022]
在一些具体的实施方案中，所述甲基化水平的检测试剂还可以是检测基因的一个或多个甲基化位点的检测试剂。
[0023]
本领域技术人员能够选择检测grasp、pak1、ppfia1，以及otx1的甲基化水平的检测试剂。例如，中国专利cn110904225提及了grasp与肝癌相关、中国专利cn106947830提及了ppfia1与肝癌相关、中国专利cn1659287提及了pak1基因与肝癌相关。
[0024]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测grasp基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。
[0025]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测中国专利cn110904225中grasp基因扩增片段的平均甲基化水平的检测试剂：
[0026]
cgcagccgccacccctgggcccccagcggacgagctgtacgcggcgctggaggactatcaccctgccgagctgtaccgcgc(seq id no:2)。
[0027]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测grasp基因以下基因片段的平均甲基化水平的检测试剂：
[0028]
cggtcccgaccccgggaccccctgccgcagccgccacccctgggcccccagcggacgagctgtacgcggcgctggaggactatcaccctgccgagctgtaccgcgcgctcgccgtgtccgggggcaccctgccccgccgaaaggtgcgtcccccgcccgccttcaggatctgctcagcccctctccgactccctacagggcctgctgactccgcagtgccctctcctcggcgtccgcggagtcccccaccttcttccccggcccgctgggtgcctcgactccccgcgttccccgctgctgcgaaggccgtggccctcgcctgcacaccgcgcccaggctcg(seq id no:3)。
[0029]
在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测grasp基因甲基化位点cg04034767、cg00817367中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。
[0030]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测ppfia1基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。
[0031]
在一个具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测ppfia1基因以下基因片段的平均甲基化水平的检测试剂：
[0032]
cgacccagtgttaacagggaatggttattctgtacgggcatctgaactgaaaagtgagaagagcgaactttgcctcctcggccccttctctgtgcctgtggcttatgcgtgtgcccctctcctctttgtcactgcttcccttgccctggatgtggttggtgcactggggtcaccttagaccacaggaaatgtctggttaacacacgaagagatggaaacgctcgcagccacg(seq id no:4)。
[0033]
在一些具体的实施方案中，所述ppfia1基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测ppfia1基因甲基化位点cg14999168、cg14088196、cg25574765中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。
[0034]
在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测pak1基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。
[0035]
在一些具体的实施方案中，所述pak1基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测pak1基因甲基化位点cg17202086、cg26996201、cg12269002、cg18309286中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。
[0036]
在一些具体的实施方案中，所述试剂组合进一步包括用于检测otx1基因整个基因平均甲基化水平的检测试剂。
[0037]
在一些具体的实施方案中，所述otx1基因的甲基化水平的检测试剂进一步包括用于检测otx1基因甲基化位点cg21472506、cg23229261、cg10122865中的一个或多个的甲基化水平的检测试剂。
[0038]
使用上述方案的试剂组合，能够以更高的灵敏度和更好的特异性对肝癌进行检测；在临床上，在肝脏恶变的早期阶段就能灵敏和特异性地检出。
[0039]
在一些实施方案中，使用本发明的检测试剂，可以对样本中所存在的相应基因的
甲基化水平进行检测。
[0040]
在本发明中，“样本”为选自个体的生物样本。具体地，例如，选自细胞系、组织学切片、组织活检/石蜡包埋的组织、体液、粪便、结肠流出物、尿、血浆、血清、全血、分离的血细胞、从血液中分离的细胞，或其组合。
[0041]
优选地，本发明的“样本”为血浆，即血浆中的游离dna。
[0042]
血浆中的游离dna能用作检测肿瘤，具有对病人伤害小，特异性好等特点。但是由于其在血浆中的含量极低，因此，在用于癌症检测时普遍存在灵敏度较低的问题。使用本发明的检测试剂，能够使用血浆中的游离dna作为样本进行检测，具有较高的灵敏度和特异性。
[0043]
在本发明中，“检测试剂”指的是对样本中的基因的甲基化水平进行检测的试剂。其中，所述甲基化水平是通过扩增-测序、芯片、甲基化荧光定量pcr的方式测量。
[0044]
在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物、测序tag序列，用于通过扩增-测序测量甲基化水平。
[0045]
在一个具体的实施方案中，所述扩增-测序是通过将样本中的核酸进行重亚硫酸盐处理，随后构建预文库，再构建终文库，最后进行测序评价的方法进行的。
[0046]
在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于芯片，所述芯片是甲基化芯片，所述甲基化芯片具有与甲基化区域特异性结合的探针。所述芯片可以是包括但不限于例如安捷伦的human cpg island microarrays和human dna methylation microarrays、illumina的infinium humanmethylation27 beadchip、infinium humanmethylation450 beadchip和goldengate methylation assay以及roche nimblegen的human dna methylation 2.1m deluxe promoter array、human dna methylation array等，用于通过芯片测量甲基化水平。
[0047]
在一些具体的实施方案中，检测试剂包括但不限于核酸引物以及核酸探针，用于通过甲基化荧光定量pcr测量甲基化水平。
[0048]
进一步地，所述检测试剂还包括内标引物以及内标探针。
[0049]
在一些具体的实施方案中，上述试剂组合还可以包括其余的试剂，具体地，例如，各种对样本进行前处理或者预处理所需要的试剂。例如，提取样本核酸的样本释放剂，纯化样本核酸的纯化剂，转化所用的重亚硫酸盐或亚硫酸氢盐等。
[0050]
进一步地，上述试剂组合还包括提取血浆游离dna的试剂。
[0051]
第二方面，本发明提供了上述试剂组合在制备用于检测肝癌的试剂盒中的用途。
[0052]
进一步地，本发明提供了上述试剂组合在制备使用血浆游离dna检测肝癌的试剂盒中的用途。
[0053]
第三方面，本发明提供了一种用于检测肝癌的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的试剂组合。
[0054]
进一步地，所述试剂盒还包括但不限于提取核酸的试剂、纯化核酸的试剂、重亚硫酸盐、t4多聚核苷酸激酶、t4连接酶中的至少一种。
[0055]
进一步地，所述提取核酸的试剂是提取组织dna的试剂和血浆游离dna的试剂。
[0056]
进一步地，所述提取核酸的试剂是提取血浆游离dna的试剂。
coulter,ca,usa)去引物二聚体和多余的引物；8)质检：纯化处理后的预文库采用dsdna hs assay kit(life technologies,ca,usa)进行文库总量质检，采用labchip gxii touch进行文库片段分布质检。
[0071]
芯片(twist bioscience)杂交捕获步骤：1)芯片杂交：将质检合格混合好的1.5μg的文库预先真空浓缩成粉末状再和panel、hybridization mix、blocker solution、universal blockers、hybridization enhancer试剂混匀(芯片杂交用到的试剂均由twist bioscience提供)，放置在pcr仪中70度孵育16hours过夜(热盖温度为85度)；2)磁珠捕获：预先使用streptavidin binding buffer将捕获磁珠洗涤3次，将杂交完成的产物加入捕获磁珠中，孵育30分钟，wash buffer i清洗一次，wash buffer 2清洗3次，最后42μl超纯水洗脱；3)扩增：采用kapa hifi hotstart readymix以及通用引物扩增捕获后的文库；4)纯化：采用1倍体积的agencourt ampure xp system(beckman coulter,ca,usa)去引物二聚体和多余的引物。
[0072]
纯化处理后的文库采用dsdna hs assay kit(life technologies,ca,usa)和labchip gxii touch进行文库核酸总量、片段分布和引物二聚体比例质检。
[0073]
3、测序
[0074]
将文库总量、扩增产物的片段大小分布和引物二聚体比例质检均合格的待测文库，按照1:1的物质的量进行混合，使用dsdna hs assay kit(life technologies,ca,usa)对混合文库进行精确定量，将文库变性稀释后使用nextseq500台式测序仪采用pe75进行上机测序。
[0075]
4、肝癌分类模型的建立和评价
[0076]
对于测序得到的原始fastq数据，对原始数据过滤后使用bismark甲基化分析软件对芯片捕获片段进行甲基化分析，获得候选基因单个位点的甲基化水平和基因片段的甲基化水平。利用候选基因单个位点的甲基化水平和基因片段的甲基化水平，针对肝癌和对照样品进行差异分析和模型构建。本发明通过对数据采用logistics回归分析进行了肝癌分类模型的构建和评价。
[0077]
实施例3、本发明试剂组合检测临床样本的甲基化水平
[0078]
收集63例原发性肝癌患者、25例肝硬化患者、15例肝炎患者和7例健康人的样本，按照实施例2所述的方法检测分析znf397os基因cg16657538甲基化位点的甲基化水平，以及znf397os基因与其余基因的组合在样本中的甲基化水平，以验证其检验肝癌的效果。检测结果如表1、图1和图2所示。
[0079]
表1znf397os基因与其余基因的组合在logistics肝癌分类模型中的预测性能
prognosis for diagnosis and prognosis of hepatocellular carcinoma.nature materials,2017和中国专利cn106947830b)。同样按照上述实施例的方法进行检测，检测结果如下表3所示。
[0087]
表3对比基因及其组合在logistics肝癌分类模型中的预测性能
[0088][0089]
其中，6代表plac8基因(检测该基因的cg11606215甲基化水平)，7代表atxn1基因(检测该基因的cg24067911甲基化水平)。
[0090]
从表3中可以看出，对比基因单个在组织样本中的最高曲线下面积为0.858，在游离dna样本中的最高曲线下面积为0.75，低于本发明的znf397os的曲线下面积。而组合的曲线下面积也低于本发明试剂组合的曲线下面积的值。

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