一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mRNA的DNA四棱锥的制备方法与流程

2021-02-02 01:02:27|

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一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物传感技术领域，具体涉及一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法。

背景技术：

[0002]
肿瘤相关mrna被广泛用作揭示恶性肿瘤发生、发展和转移信息的特异性生物标志物。因此，细胞中肿瘤相关mrna的检测对癌症的早期诊断，治疗和预后具有重要意义。迄今为止，人们已经开发了许多方法来检测这些mrna，例如northern-blots、微阵列分析、和逆转录聚合酶链反应（rt-pcr）。但是，这些方法不仅费时费力，还需要大量样本细胞，难以实现单细胞的实时检测。基于荧光显微镜的分子成像技术，具有高选择性、高分辨率和非侵入性的特点，已逐渐发展为可视化细胞内基因表达的一般策略，为在细胞水平上检测癌症提供了一种有效的方法。而基于荧光共振能量转移（fret）的荧光比率型检测方法，可通过信号比率来有效避免产生假阳性结果。因此，将基于fret的荧光探针与荧光成像技术相结合，已成为生物医学检测研究的热点。
[0003]
肿瘤标志物c-myc是一种肿瘤发生激活剂，在乳腺癌的发生和发展中起着不可忽视的关键作用。本发明将mcf-7乳腺癌细胞中的c-myc mrna作为待测目标物，来评估dna嘴巴的响应能力。

技术实现要素：

[0004]
为解决上述问题，本发明提出的一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法，通过巧妙设计dna序列，并经过特定的退火程序自组装成具有三维立体结构dna四棱锥，实现非侵入式的细胞内肿瘤相关mrna可视化检测，并利用fret技术的比率型信号检测方式，有效避免了复杂生物样本中假阳性信号的产生。
[0005]
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥，所述dna四棱锥包括两条捕获探针cp和四条带有荧光标记的dna支撑探针s1~s4，所述s1~s4引物序列为：s1: 5'-tcgct gagta at/cy3/aaa tcaac gcctc aacgt tagca aaa gc aagtg tgggc acgca cacaa aacac aaatc tg-3'；s2: 5'-ctatc ggtag at/cy3/aac gcagt cagtg tcagt ccaga aaa ta ctcag cgaca gattt gtgaa aacaa ctagc gg-3'；s3: 5'-cactg gtcag at/cy5/aaa tcaac gcctc aacgt tagca aaa ct accga tagcc gctag ttgaa aaggt ttgct ga-3'；s4: 5'-ccaca cttgc at/cy5/aac gcagt cagtg tcagt ccaga aaa ct gacca gtgtc agcaa accaa aagtg tgcgt gc-3'。
[0006]
上述dna四棱锥的制备方法包括以下步骤：
将dna干粉溶于1
×
tae/mg
2+
缓冲液，得到浓度为100 μm的母液备用。相关dna经两步退火反应组装成为dna四棱锥，具体步骤为：在1
×
tae/mg
2+
缓冲液中，等摩尔的s1，s3分别与cp在金属浴中 95
º
c加热5 min，自然冷却至室温，然后将其混合并加入等摩尔的s2和s4在pcr仪中50
º
c加热10 min，按照3min/
º
c的速度冷却到25
º
c，4
º
c保持60 min的程序退火，得到终浓度1μm的dna四棱锥，dna四棱锥自组装的过程及检测原理示意图如图1所示。
[0007]
所述1
×
tae/mg
2+
缓冲液成分包括：终浓度20 mm tris、2 mm edta、12.5 mm mgcl2，ph 7.4。
[0008]
捕获探针cp序列为：cp: 5'-ttggt gaagc taacg ttgag gcgtt-3'待测目标物 c-myc mrna序列为：5'-cctca acgtt agctt cacca a-3'本发明的显著优点在于：（1）本发明利用dna自组装技术成功组装的dna四棱锥具有的三维立体结构易于被细胞内吞，实现了非侵入式的可视化检测，且生物相容性良好；（2）本发明dna四棱锥的组装方式决定了其有较多的单链核酸位点（4个）可供与目标杂交，即用较少的dna链结合较多的目标，在一定程度上节约了成本；（3）将本发明所利用的fret技术可以避免由于生物系统复杂性导致的假阳性信号，提高了检测的准确性。
附图说明
[0009]
图1是本发明dna四棱锥自组装的过程及检测原理示意图；图2是实施例1中加入不同浓度的目标物后的荧光响应图；图3是实施例2中加入不同浓度的dnase i后荧光比率的变化图；图4是实施例3中将dna四棱锥与mcf-7细胞孵育后的激光共聚焦图。
具体实施方式
[0010]
为了使本发明所述的内容更加便于理解，下面结合具体实施方式对本发明所述的技术方案做进一步的说明，但是本发明不仅限于此。
[0011]
实施例1一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法，包括以下步骤：1）取等摩尔的s1和cp在金属浴中 95
º
c加热5 min，自然冷却至室温，得到混合物1；再取等摩尔的s3和cp如上制备，得到混合物2；2）将混合物1和混合物2混匀后，加入等摩尔的s2和s4，在pcr仪中，按如下程序退火：50
º
c加热10 min，冷却到25
º
c（3min/
º
c），4
º
c保持60 min，得到终浓度1μm的dna四棱锥；3）加入不同浓度的c-myc目标测荧光；步骤3）中的具体操作方法为：在含1
×
tae/mg2+缓冲液体系中，将不同量的目标物与浓度为200 nm的dna嘴巴混合均匀，使目标的终浓度分别为0，10，20，30，40和50 nm。将所有的样品放入37
ꢀº
c的恒温金属浴中，避光反应1 h，然后在525 nm的激发光波长下测量样品在540-570 nm范围内的荧光强度，结果如图2所示。当目标不存在（0 nm）时，cy3的荧光信号（566 nm）非常强，而cy5的信号（665 nm）很弱。随着目标浓度的不断增大，cy5的荧光强度逐渐增大，cy3的信号急剧降低。
[0012]
实施例2一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法，包括以下步骤：步骤1）、2）同实施例13）dna四棱锥避免产生假阳性信号的能力，在含有dna四棱锥的缓冲液中分别加入dnase i使其终浓度分别为0.5 u/ml和5 u/ml，37
ꢀº
c下避光孵育0，10，20，30，40，50，60 min后在525 nm的激发光波长下测量样品在540-570 nm范围内的荧光强度，结果如图3所示。 dna容易被生物系统中普遍存在的核酸酶降解而产生假阳性信号是公认的事实。与基于单一强度的传感探针相比，基于fret的荧光比率型信号可以有效避免因核酸酶消化、蛋白质结合或热力学波动而产生的假阳性信号。因此，为了验证探针避免假阳性的能力，本发明探索了dna四棱锥与dnase i的相互作用。dnase i是一种能有效降解单链和双链dna的功能强大的核酸内切酶。然而，如图3所示，无论dna四棱锥是用低浓度还是用高浓度的dnasei处理，fa/fd信号随时间的延长都没有明显的变化，这有力地表明dna四棱锥可以有效地抵抗酶降解引起的假阳性信号，提高检测的准确性。
[0013]
实施例3 一种用于可视化检测活细胞内肿瘤相关mrna的dna四棱锥的制备方法，包括以下步骤：步骤1）、2）同实施例13）在细胞成像实验中，将mcf-7细胞用培养皿中的dmem培养液接种，并在5 % co2培养箱中于37
ꢀº
c培养24小时。将100 nm的dna嘴巴加入mcf-7细胞，在37
ꢀº
c和5 %co2中孵育4 h。用pbs多次洗涤去除多余样品。在共聚焦显微镜下，用激光扫描获得细胞的共聚焦荧光图像，结果如图4所示。在mcf-7细胞中在观察到了明显的fret信号，表明目标c-myc mrna的存在。
[0014]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

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