利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物的方法与流程

[0001]
本发明涉及蛋副产品加工领域，尤其涉及一种利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物的方法。


背景技术：

[0002]
鸡蛋壳作为人类生活的副产品大量存在，其内附着的蛋壳膜尤其容易造成极大的环境污染。而事实上，蛋壳膜与畜产品加工业的主要副产品：角、蹄、皮、毛一样，同为潜在的蛋白质、氨基酸资源。蛋壳膜中约含有90％的蛋白质、2％的糖类和3％的脂质体。壳膜中的蛋白质主要有角蛋白、胶原蛋白(大部分为i、v、x型)及复合蛋白等，其中含量较多的就是角蛋白和胶原蛋白。若将这些被抛弃的蛋壳膜充分利用，既可增加经济效益，又避免对环境的污染。
[0003]
目前已有文献报道的壳膜处理方法主要有酸碱处理法、还原法及酶法等，
[0004]
1.酸碱处理法先用酸预处理使天然壳膜蛋白质溶胀，然后在一定的温度和碱浓度下进行溶解，所制得的蛋白可溶性好，提取率高。但是这个方法相对而言并不环保，产生的酸蒸汽与废液对人体和环境都有较大的不良影响。
[0005]
2.还原法则利用还原剂将蛋壳膜蛋白质分子中的二硫键还原成巯基，从而得到可溶性蛋白，但巯基类化合物还原剂刺激性气味较大、成本较高。
[0006]
3.酶法反应速度快，水溶性好，无环境污染，且酶法反应条件温和，理化性质稳定，是目前较为先进的一种方法。但是该方法耗时长，酶制剂价格昂贵，难以工业化应用。
[0007]
蒸汽爆破技术是一种典型的物理处理方法，其原理是在高压容器内将高压蒸汽压入物料内部间隙，保压后瞬间泄压，使得容器内的蒸汽通过膨胀对外做功，从而产生冲击波对物料进行机械剪切，造成物料组分间紧密结构被破坏，物料发生解离。据了解，目前己有专利将蒸汽爆破技术应用于木质纤维素、苦荞麸皮等原料的处理。
[0008]
目前，还没有研究将蒸汽爆破技术应用于壳膜降解，制备功能性水解物的报道。


技术实现要素：

[0009]
本发明的目的是克服上述困难，提供一种利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物的方法，该方法是在高温高压强剪切力的条件下使壳膜蛋白质中的二硫键发生断裂，有效破坏壳膜蛋白质中的二硫键及氢键等其他化学键，使壳膜蛋白质降解为分子量更低的多肽，提高其利用率，制备功能性水解产物。该方法处理时间短、效率高且工艺简单，适用于工业化生产，是一种前景广阔的壳膜处理技术。
[0010]
上述目的是通过以下技术方案实现的：
[0011]
一种利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物的方法，包括以下步骤：
[0012]
1)蒸汽爆破处理
[0013]
将蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为0.5～2.2mpa条件下保压处理0.5～5min，然后瞬间泄压，收集汽爆样品，保存备用；
[0014]
2)样品稀碱法降解
[0015]
将汽爆样品加入naoh溶液中，并在温度为25～60℃条件下，振荡反应0.5～4h，过滤得到滤液，冷冻干燥得到功能性水解物。
[0016]
进一步地，所述步骤1)中，压力为1.6mpa，保压处理时间为1min。
[0017]
再进一步地，所述步骤1)中，瞬间泄压时间为0.1s。
[0018]
再进一步地，所述步骤2)中，naoh溶液的碱浓度为0.2～0.6％；汽爆样品与naoh溶液的料液比1:10～25。
[0019]
再进一步地，naoh溶液的碱浓度为0.4％；且汽爆样品与naoh溶液的料液比1:20。
[0020]
再进一步地，所述步骤2)中，振荡反应条件为：温度为25℃，反应时间为1h。
[0021]
本发明研究的理论依据：
[0022]
1.蒸汽爆破条件的选择
[0023]
1.1方法
[0024]
a.称取1000g壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，分别于0.5～2.2mpa下处理0.5～5min，然后在0.1s内瞬间泄压；收集汽爆样品，-4℃保存，备用。
[0025]
b.称取各条件下处理的壳膜各1g，样品加入20ml 0.4％naoh溶液，并在温度为25℃条件下，振荡反应1h，3000g离心10min，倒去上清液。沉淀中再次加入10ml相同溶剂，重复上述操作。将处理过后的三组样品过滤得到不溶性残渣，残渣水洗三次，放入50℃烘箱中烘干，称重；壳膜溶解率按照下式计算：
[0026][0027]
1.2结论
[0028]
如图1所示：蛋壳膜溶解率随着汽爆压力的增大而增大，但在1.6mpa和2.0mpa之间差异不显著；随着保压时间的增加，汽爆处理后壳膜溶解率显著增加，进一步延长处理时间至2min时，溶解率亦有所增加，但变化不显著。故，蒸汽爆破处理最佳汽爆压力为1.6mpa，保压时间为1min。
[0029]
2.不同溶剂的选取
[0030]
2.1方法
[0031]
各取1g汽爆样品和未经汽爆处理壳膜样品，分别设为实验组和对照组，加入20ml不同溶剂(0.05mol/l磷酸盐缓冲液(ph 8.0)、碱浓度为0.4％naoh溶液、0.1mol/l hcl溶液、70％乙醇)，放入振荡水浴锅内振荡反应1h；再在转速为3000g离心10min，倒去上清液，沉淀中再次加入10ml相应溶剂，重复上述操作。
[0032]
将处理过后的实验组和对照组过滤得到不溶性残渣，残渣水洗三次，放入50℃烘箱中烘干，称重，计算溶解率；
[0033]
2.2结果
[0034]
如图2所示：使用0.4％naoh溶液时，汽爆样品的溶解率最高，因此溶剂选用naoh溶液。
[0035]
3.蒸汽爆破辅助稀碱法工艺优化
[0036]
3.1方法
[0037]
不同碱浓度及料液比中壳膜溶解率的测定，分别取1g汽爆样品和未经汽爆处理壳
膜样品设为实验组和对照组，与不同浓度naoh溶液按不同料水比混合，其中碱浓度梯度分别为0、0.2％、0.4％、0.6％，料液比分别为1:10、1:15、1:20、1:25，于不同温度(25℃、40℃、50℃、60℃)下放入振荡水浴锅内分别振荡反应0.5h、1h、2h、4h，过滤得到不溶性残渣，水洗残渣三次，放入50℃烘箱中烘干后称重，计算溶解率；
[0038]
3.2结论
[0039]
a.在naoh溶液的碱浓度低于0.4％时，壳膜溶解率随着碱液浓度增大显著增大，当浓度达到0.6％时变化差异不显著。这可能是因为较高碱浓度能够裂解羰基和硫酸基团间的氢键，从而打开蛋白质结构，暴露出疏水残基。壳膜在极端碱性条件下(如1mol/l naoh)亦较易溶解，但这会导致蛋白质大量降解为低分子多肽，从而限制壳膜蛋白材料的后续开发利用，故naoh溶液的碱浓度优选值为0.4％；
[0040]
b.在料水比1:20时壳膜溶解率达到最大，而更大料水比时差异不显著，故汽爆样品与naoh溶液料水比的优选值为1:20
[0041]
c.未经汽爆处理组壳膜随着降解温度提高溶解率显著增大，但汽爆样品随温度升高变化幅度不显著。随着反应时间增加，最初的1h可明显提高壳膜溶解率，而更长的反应时间并未使溶解率发生显著变化；故反应温度为25℃，反应时间为1h(图3)。
[0042]
4.蒸汽爆破处理对壳膜中二硫键含量的影响
[0043]
4.1方法
[0044]
(1)ntsb试剂的合成：
[0045]
a.0.1g 5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)(dtnb)溶于10ml、1mol/l na2so3溶液，调整ph为7.5；
[0046]
b.向反应体系连续充氧，恒温38℃，磁力搅拌下反应，直到溶液由鲜红色变为浅黄色(约45min)，反应终止，得到ntsb(该溶液可在-20℃保存一年)。
[0047]
(2)游离巯基含量测定：
[0048]
称取15mg壳膜样品悬浮于0.8ml缓冲液a(8mol/l尿素、3m mol/l edta、1％sds和0.2mol/l tris-hcl，ph 8.0)，室温下不定时漩涡振荡；2.5h后，加入0.2ml缓冲液b(50mm dtnb试剂、0.2mol/l tris-hcl，ph 8.0)，再次漩涡振荡1h，室温下10000g离心15min，取上清液412nm下测定吸光度a1(空白对照为0.8ml缓冲液a和0.2ml缓冲液b的混合溶液)，根据下述公式计算游离巯基含量。
[0049]
(3)总巯基含量测定：
[0050]
称取15mg壳膜样品(粒径0.25mm)悬浮于0.8m l缓冲液c(8mol/l尿素、3m mol/l edta、1％sds、0.1mol/l na2so3和0.2mol/l tris-hcl，ph 9.5)，室温下不定时漩涡振荡；2.5h后，加入0.2ml缓冲液d(50m mol/l ntsb试剂、0.2mol/l tris-hcl，ph 9.5)；再次漩涡振荡1h，室温下10000g离心15min，取上清液412nm下测定吸光度a2(空白对照为0.8ml缓冲液c和0.2ml缓冲液d的混合溶液)，根据下述公式计算总巯基含量；
[0051]
(4)二硫键含量的计算
[0052]
根据下述公式计算二硫键含量：
[0053]
[0074][0075]
(3)起泡特性测定：
[0076]
取1g经汽爆处理壳膜溶液和未经汽爆处理壳膜溶液溶于20ml去离子水中，分别设为实验组和对照组。将20ml壳膜溶液倒入50ml离心管中，用直尺量出溶液高度并记为h0，10000g搅拌1min，测量泡沫高度h1，将离心管室温下静置10min后，再次测量泡沫高度h2。采用下式计算壳膜样品的起泡能力(fc)和泡沫稳定性(fs)：
[0077][0078][0079]
(4)dpph自由基清除能力的测定：
[0080]
取2ml壳膜溶液于比色管中，加入2ml 1mmol/l的dpph乙醇溶液，充分混匀后在室温下避光反应30min，反应结束后在517nm处测定其吸光度。对照组为2ml无水乙醇溶液与2ml样液混合液的吸光度，空白组为2ml dpph溶液与2ml蒸馏水混合液的吸光度，用无水乙醇调零。dpph自由基清除能力的计算公式如下：
[0081][0082]
式中:
[0083]
a
s
--
实验组的吸光度
[0084]
a
c
--
对照组的吸光度
[0085]
a
b
--
空白组的吸光度。
[0086]
5.2结论
[0087]
由图5可看出，实验组和对照组壳膜溶解率在碱浓度为0-0.4％时均随着碱浓度的增加而增大，当碱浓度达到0.6％时溶解率下降，过高碱浓度容易导致蛋白质肽链的大量降解，使得蛋白质降解为低分子多肽，不利于其保持蛋白质结构完整，进而影响其与考马斯亮蓝的结合。但总体来说，在各个碱浓度之下，经高温高压处理的壳膜溶解率均显著高于未处理组壳膜溶解率。该实验结果证明高温高压处理确有助于提升壳膜溶解率。
[0088]
由图6a可以看出，经汽爆处理的壳膜乳化性在碱浓度为0.4％之前随碱浓度增大显著增大，在碱浓度为0.6％时稍下降，与前者差异不显著。未经汽爆处理的壳膜乳化性亦随碱浓度增大而增大，但增幅小于汽爆组。由图6b可知，汽爆处理壳膜在碱浓度0.4％之前随碱浓度增加乳化稳定性显著升高，在碱浓度为0.6％时略微减小。未经汽爆处理壳膜乳化稳定性明显低于汽爆处理壳膜，但仍随碱浓度增大呈上升趋势。
[0089]
由图7a可知，实验组的壳膜蛋白起泡性随着碱浓度增大显著增大，对照组的壳膜蛋白起泡性增幅较小，变化差异不显著。由图7b可看出，实验组壳膜蛋白在碱浓度0.4％之前随碱浓度增加起泡稳定性显著升高，而在碱浓度为0.6％时泡沫稳定性略微减小，这可能与较高浓度碱条件下壳膜纤维中肽键发生大量水解，蛋白质分子量降低，泡沫间液膜强度减弱有关。对照组壳膜蛋白起泡稳定性明显低于实验组，但仍随碱浓度增大呈上升趋势。
[0090]
由图8可知，随着氢氧化钠溶液浓度的增加实验组与对照组壳膜dpph自由基清除
能力均呈上升趋势，表明随着氢氧化钠溶液浓度的增加壳膜样品抗氧化活性增强。在碱浓度为0-0.4％时，dpph自由基清除能力增幅较为缓慢，当碱浓度增加至0.6％时，dpph自由基清除能力增幅变快。相较于未经汽爆处理的对照组壳膜，经蒸汽爆破处理的高温高压条件下的实验组壳膜其蛋白中的肽键受到更强烈的破坏，使得部分壳膜蛋白降解成离散的寡肽，生成了具有更高抗氧化活性的短肽，故实验组抗氧化活性高于对照组。
[0091]
6不同条件处理对蛋壳膜的溶解率的影响
[0092]
6.1方法(1)对壳膜分别进行四种不同处理，处理方法如下：
[0093]
a.蒸汽爆破处理组：称取1000g壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，于1.6mpa下处理1min，然后在0.1s内瞬间泄压，收集汽爆样品；
[0094]
b.汽爆碱液处理组：汽爆处理方法同上。取1g汽爆处理壳膜样品，加入20ml 0.4％naoh溶液，于室温下(25℃)振荡水浴锅内振荡反应1h。
[0095]
c.碱液处理组：称取1g壳膜，加入20ml 0.4％naoh溶液，于室温下(25℃)振荡水浴锅内振荡反应1h。
[0096]
d.空白组：称取1g壳膜，加入20ml蒸馏水，于室温下(25℃)振荡水浴锅内振荡反应1h。
[0097]
(2)将上述四组的处理样品从水浴锅中取出，3000g离心10min，倒去上清液。沉淀中分别再次加入10ml相同溶剂，重复上述操作。将处理过后的四组样品过滤得到不溶性残渣，残渣水洗三次，放入50℃烘箱中烘干，称重；壳膜溶解率按照下式计算：
[0098][0099]
6.2结论
[0100]
由图10可知，空白组、汽爆处理组、碱液处理组和汽爆碱液处理组样品溶解率分别为5.07％、32.4％、9.2％和91.6％。空白组溶解率显著低于其余三组，而相比于汽爆处理和碱液处理，经汽爆辅助碱液处理后的壳膜样品溶解率显著增加。因此，该实验结果证明蒸汽爆破辅助稀碱液处理确有助于提升壳膜溶解率。
[0101]
7.不同条件处理对蛋壳膜水解度的影响
[0102]
7.1方法
[0103]
(1)汽爆碱法
[0104]
称取1000g壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，于1.6mpa下处理1min，然后在0.1s内瞬间泄压。收集汽爆样品。取1g汽爆处理壳膜样品加入20ml 0.4％naoh溶液，并在温度为25℃条件下，振荡反应1h，取出，离心(3000g，10min)，取部分上清液测定水解度。
[0105]
(2)还原剂酶解法
[0106]
称取5g蛋壳膜，按1:20的料液比加入30mm的亚硫酸钠溶液配置成鸡蛋壳膜悬浊液，用1m naoh调节ph至碱性蛋白酶的最适ph(ph为8.0)，按9u/mg的酶与底物蛋壳膜比加入碱性蛋白酶，再在碱性蛋白酶的最适温度下(55℃)持续震荡6h，取出，离心(3600g，10min)，取部分上清液测定水解度。
[0107]
(3)复合酶解法：
[0108]
称取5g蛋壳膜，按1:20的料液比加入蒸馏水配置成鸡蛋壳膜悬浊液，用1m naoh或1m hcl调节ph至所用酶的最适ph，按总加酶量15u/mg的酶与底物蛋壳膜比分别先后加入碱
性蛋白酶和木瓜蛋白酶，加酶量配比为1：1，各酶酶解时间均为2h，再在各个酶的最适温度下持续震荡6h(木瓜蛋白酶采用ph为6.5，酶解温度60℃，碱性蛋白酶采用ph为8.0，酶解温度55℃)，取出，离心(3600g，10min)，取部分上清液测定水解度。
[0109]
(4)水解度测定：
[0110]
游离氨基态氮含量采用国标gb/t 5009.39-2003氨基态氮甲醛值法测定，实验做三次平行。吸取5ml样品(上述三种处理方法所得上清液)，加入60ml蒸馏水，开动磁力搅拌器，用0.050mol/l naoh标准溶液滴定至酸度计指示ph 8.2，加入10.0ml中性甲醛溶液，混匀。再用0.050mol/l naoh标准溶液继续滴定至ph 9.2，记下消耗naoh标准溶液的体积，记为v1。同时取65ml蒸馏水，先用0.050mol/l naoh标准溶液调节至ph为8.2，再加入10.0ml中性甲醛溶液，继续用naoh滴定至ph 9.2，做为试剂空白试验，记录消耗naoh的体积，记为v 2
。试样中氨基酸态氮的含量计算公式：
[0111][0112]
x表示试样中氨基酸态氮的含量，单位为g/ml；v1表示测定试样加入甲醛后消耗naoh标准滴定溶液的体积，单位为ml；v2表示试剂空白实验加入甲醛后消耗naoh标准滴定溶液的体积，单位为ml；c表示naoh标准滴定溶液的浓度，单位为mol/l；0.014表示与1ml 1.000mol/l naoh标准滴定溶液相当的氮的质量，单位为g。
[0113]
总氮含量采用国标gb 5009.5-2016凯氏定氮法测定初始鸡蛋壳膜中的氮含量。
[0114]
壳膜水解度按照下式计算：
[0115][0116]
7.2结论
[0117]
由图11可知，汽爆碱法、还原剂酶解法和复合酶解法水解度分别为11.29％、27.02％和63％。相比于还原剂酶解法和复合酶解法，经汽爆辅助碱液处理后的壳膜样品水解度显著增加。因此该实验结果证明蒸汽爆破辅助稀碱液处理有利于提升壳膜利用率，制备功能性水解产物。
[0118]
本发明的有益效果在于：
[0119]
(1)相比于现有的还原法、酶解法，蒸汽爆破辅助稀碱溶液降解法操作工序简单、处理时间短、效率高，易于工业化生产。
[0120]
(2)蒸汽爆破技术结合稀碱溶液处理可使壳膜蛋白质的溶解性、乳化特性、起泡特性等功能特性得到不同程度的改善，其中壳膜蛋白质的乳化性、起泡性与传统碱提酸沉法相当，而乳化稳定性以及泡沫稳定性均优于传统碱提酸沉法。
附图说明
[0121]
图1为壳膜样品在不同溶剂中的溶解率；
[0122]
图2为汽爆压力(a)和保压时间(b)对壳膜溶解率的影响；
[0123]
图3为汽爆降解壳膜工艺条件料液比(a)，碱浓度(b)，温度(c)和时间(d)的优化；
[0124]
图4为二硫键及游离巯基含量变化；
[0125]
图5为壳膜样品在不同碱浓度下的溶解性变化；
[0126]
图6为壳膜样品乳化性(a)和乳化稳定性(b)变化；
[0127]
图7为壳膜样品起泡性(a)和气泡稳定性(b)变化；
[0128]
图8为壳膜样品抗氧化性变化；
[0129]
图9为壳膜样品处理前(a)和汽爆降解后(b)变化；
[0130]
图10为不同处理条件下样品溶解率差异；
[0131]
图11为不同处理方式壳膜水解度差异。
具体实施方式
[0132]
下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是本次实验的部分描述，而不具有限定性，不能以此限定本发明的保护范围。
[0133]
实施例1
[0134]
利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物1的方法，包括以下步骤：
[0135]
1)蒸汽爆破处理
[0136]
称取1000g置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.4mpa条件下保压处理0.5min，然后0.1s瞬间泄压，收集汽爆样品，-4℃保存备用；
[0137]
2)样品稀碱法降解
[0138]
按料液比1:25将汽爆样品加入碱浓度为0.6％的naoh溶液中，并在温度为60℃条件下，振荡反应0.5h，过滤得到滤液，冷冻干燥得到功能性水解物1。
[0139]
实施例2
[0140]
利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物2的方法，包括以下步骤：
[0141]
1)蒸汽爆破处理
[0142]
称取1000g蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.6mpa条件下保压处理1min，然后0.1s瞬间泄压，收集汽爆样品，-4℃保存，备用；
[0143]
2)样品稀碱法降解
[0144]
按料液比1:20将汽爆样品加入碱浓度为0.4％的naoh溶液中，并在温度为25℃条件下，振荡反应1h，过滤得到滤液，冷冻干燥得到功能性水解物2。
[0145]
实施例3
[0146]
利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物3的方法，包括以下步骤：
[0147]
1)蒸汽爆破处理
[0148]
称取1000g蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为1.8mpa条件下保压处理2min，然后0.1s瞬间泄压，收集汽爆样品，-4℃保存备用；
[0149]
2)样品稀碱法降解
[0150]
按料液比1:15将汽爆样品加入碱浓度为0.2％的naoh溶液中，并在温度为40℃条件下，振荡反应2h，过滤得到滤液，冷冻干燥得到功能性水解物3。
[0151]
实施例4
[0152]
利用蒸汽爆破技术降解鸡蛋壳膜制备功能性水解物4的方法，包括以下步骤：
[0153]
1)蒸汽爆破处理
[0154]
称取1000g蛋壳膜置于蒸汽爆破机反应器中，在压力为2mpa条件下保压处理3min，
然后0.1s瞬间泄压，收集汽爆样品，-4℃保存备用；
[0155]
2)样品稀碱法降解
[0156]
按料液比1:10将汽爆样品加入碱浓度为0的naoh溶液中，并在温度为50℃条件下，振荡反应4h，过滤得到滤液，冷冻干燥得到功能性水解物4。
[0157]
如图2所示：蛋壳膜溶解率随着汽爆压力的增大而增大，但在1.6mpa和2.0mpa之间差异不显著；随着保压时间的增加，汽爆处理后壳膜溶解率显著增加，进一步延长处理时间至2min时，溶解率亦有所增加，但变化不显著。故蒸汽爆破处理最佳汽爆压力为1.6mpa，保压时间为1min。
[0158]
在naoh溶液的碱浓度低于0.4％时，壳膜溶解率随着碱液浓度增大显著增大，当浓度达到0.6％时变化差异不显著，故naoh溶液的碱浓度优选值为0.4％；在料水比1:20时壳膜溶解率达到最大，而更大料水比时差异不显著，故汽爆样品与naoh溶液料水比的优选值为1:20；未经汽爆处理组壳膜随着降解温度提高溶解率显著增大，但汽爆样品随温度升高变化幅度不显著。随着反应时间增加，最初的1h可明显提高壳膜溶解率，而更长的反应时间并未使溶解率发生显著变化；故反应温度为25℃，反应时间为1h。
[0159]
因此，最佳条件实施例为实施例2。
[0160]
其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除