一株本土酿酒酵母YT28及其在马瑟兰葡萄酒酿造中的应用的制作方法

一株本土酿酒酵母yt28及其在马瑟兰葡萄酒酿造中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及微生物技术领域。本发明具体涉及一株酿酒酵母及其在马瑟兰葡萄酒酿造中的应用。


背景技术：

[0002]
在葡萄酒发酵过程中，酿酒酵母起着决定性的作用，它将葡萄汁中的绝大部分糖转化为酒精和二氧化碳，同时生成甘油、高级醇、醛、酯等副产物，这些物质都会直接影响葡萄酒的颜色和风味，决定了葡萄酒的质量。目前，我国的葡萄酒酿造存在风格特征不明显，产品同质化现象严重，市场竞争力弱的缺点。商业酵母的广泛使用是其主要原因，对不同的葡萄品种的特征香气无法起到很好的保留作用。
[0003]
在葡萄酒产区天然存在的本土酵母，已经逐渐适应了当地的气候、品种、土壤及酿造车间环境，可以比较好地主导自然菌群快速启动发酵，因此使用本土酿酒酵母进行发酵，受到了很多顶级酒庄酿酒师的追捧。更为重要的是，本土酵母能够产生一些凸显产地葡萄酒独特感官特征的风味物质，从而赋予当地葡萄酒独特的质量和风格。
[0004]
我国生态系统类型十分丰富，蕴藏着丰富的酵母菌资源，从葡萄浆果、葡萄醪以及葡萄酒中发现的酵母菌已达24个属120个种之多。然而，中国在本土酵母筛选方面的研究仍处于基础起步阶段。
[0005]
马瑟兰葡萄品种于2001年由中法庄园引入我国，在我国葡萄酒产区的适应性与酿酒潜质逐步显现，越来越受到中国酒庄和消费者的重视，是中国葡萄酒很有特色和发展潜力的葡萄品种。在追求个性化、品质化、多样化发展的今天，马瑟兰酿酒葡萄品种得到了迅速的发展，成为了中国酿酒葡萄的特色和招牌品种。而针对马瑟兰葡萄品种，使用具有自主知识产权的专用酿酒酵母，发挥其优良品质，突出其特殊的风格特征，具有非常重要的理论和实践意义。


技术实现要素：

[0006]
因此，本发明的目的是提供一株筛选自烟台地区的本土酿酒酵母，弥补我国市场上缺少特定产区特定品种相对应的本土酿酒酵母选择的不足。
[0007]
本发明的另一目的是提供一株发酵性能好的酿酒酵母在酿造马瑟兰葡萄酒中的应用。
[0008]
针对上述目的，本发明提供的技术方案如下：
[0009]
本发明提供的酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)，名称为yt28，属于酵母属(saccharomyces sp.)，分离自烟台市蓬莱市南王街道龙湖酒庄的成熟的白色酿酒葡萄品种——“霞多丽(chardonnay)”葡萄自然发酵醪液第3天。保藏编号为cgmcc no.20633。
[0010]
除非特别指明，酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)yt28，在本文中简称酿酒酵母yt28。
[0011]
本发明提供的酿酒酵母yt28可用于酿造马瑟兰葡萄酒。利用酿酒酵母yt28酿造葡
萄酒的优点在于：在马瑟兰葡萄醪当中，yt28表现出更好的发酵能力，可以获得较快的发酵速度、较好的葡萄酒质量，稳定的发酵过程。同时，以其酿造出的葡萄酒香气复杂、口感平衡，品质很高。相较于进口商业酿酒酵母，能更好地呈现中国本土葡萄酒的特色，从而帮助马瑟兰葡萄酒形成自己的本土特色，促进我国葡萄酒产业的发展。
附图说明
[0012]
图1菌株yt28在wl培养基上的菌落形态。
[0013]
图2马瑟兰葡萄酒闻香评价的风味雷达图。
[0014]
生物保藏说明
[0015]
生物材料yt28，分类命名:酿酒酵母saccharomyces cerevisiae，于2020年09月11日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmcc no.20633。
具体实施方式
[0016]
为了更好地理解与实施，下面结合实施例和附图详细说明本发明；所举实施例仅用于解释本发明，并非用于限制本发明的范围。
[0017]
除非特别指明，以下实施例中所用的方法均为常规方法。
[0018]
除非特别指明，以下实施例中所用的试剂均为分析纯级别的试剂，且可从正规渠道商购获得。
[0019]
除非特别指明，以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取统计平均值。
[0020]
实施例中涉及的培养基配方如下：
[0021]
ypd固体培养基(每1l)：酵母粉10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，琼脂20g。
[0022]
葡萄酒酵母wln鉴别培养基(每1l)：酵母粉4g，胰蛋白胨5g，葡萄糖50g，kh2po
4 0.55g，kcl 0.425g，cacl
2 0.125g，mgso
4 0.125g，fecl
3 2.5mg，mnso
4 2.5mg，琼脂20g，溴甲酚绿22mg。
[0023]
实施例1酿酒酵母yt28的分离、纯化及其鉴定
[0024]
本发明一株酿造性能好的的酿酒酵母，是从烟台市蓬莱市龙湖酒庄葡萄园的霞多丽葡萄品种中得到，筛选过程如下：
[0025]
挑选摘取完整成熟、无霉果烂果的成串葡萄样品，样品设置三个平行，每份葡萄样品约1kg，保存于无菌袋中，当天采集的葡萄当天处理，无菌条件下将葡萄样品除梗，挑选完整、成熟、无病变霉变的果粒收集于500ml三角瓶中，以药匙在三角瓶内破碎葡萄，葡萄破碎后每瓶葡萄醪约400ml，添加亚硫酸1ml/l，搅拌均匀后以无菌封口膜封口，葡萄醪置于25℃条件下自然发酵。
[0026]
从自然发酵第0天(葡萄破碎时)开始，前7天每24h无菌条件下取样一次，每次取1ml葡萄汁，以无菌水梯度稀释至10-7
，选取合适的3个稀释浓度各0.1ml，涂布于wln鉴别培养基平板，28℃条件下倒置培养72h。之后在葡萄醪菌群动态和化学成分变化平缓的发酵后期，第10天、第12天和第20天再次取样。挑选出菌落数为30-300个的平板，根据wln鉴别培养基对酵母菌分类鉴别的方法，对不同特点的菌落进行分类、编号，记录各类菌落特点及数
目，并拍照存档。菌落形态不同、出现时期不同的每类酵母中，挑选2-3株保存于ypd斜面培养基中，于4℃条件下保存。酵母初步筛选完成后，防止菌落不纯，对菌株进行纯化。挑取单菌落以平板划线法于wln鉴别培养基平板上纯化菌株，28℃条件下倒置培养72h，记录每次纯化后的菌落特点并拍照存档，结合显微镜观察菌株纯度，每个菌株纯化2-3次。纯化后的酵母使用40％甘油冻存管于-80℃条件下保存，待分子鉴定。
[0027]
提前活化待测酵母，将其接种于ypd液体培养基，于28℃，150rpm条件下恒温振荡培养12h，离心后取酵母细胞待用。使用天根酵母基因组dna提取试剂盒提取待测酵母基因组dna。选用引物对its1(5
’-
tccgtaggtgaacctgcgg-3
’
)和its4(5
’-
tcctccgcttattgatatgc-3
’
)对酵母rdna基因5.8s its区进行pcr扩增。pcr反应条件：95℃预变性5min；95℃变性1min，52℃退火2min，72℃延伸2min，循环35次；72℃补充延伸10min。pcr反应体系：10
×
pcr buffer(taq buffer with kcl)5μl，25mmol/l mgcl
2 6μl，10mmol/l dntps1μl，10μmol/l引物各2.5μl，taq酶2.0u，模板dna 1μl，加双蒸水定容至50μl。取6μl扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
[0028]
pcr产物测序由北京华大基因和北京擎科新业生物技术有限公司完成。
[0029]
通过美国国家生物技术信息中心(ncbi)网站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi)中的blast工具搜索待测菌株目的序列，进行相似序列搜索，根据同源序列的相似性初步确定yt28菌株的种属地位，同时校正测序图谱。比较yt28与已知酵母菌对应序列的相似程度，相似度超过99％，并通过yt28在wln鉴别培养基上的菌落形态和细胞显微形态最终鉴定待测菌株的种属地位。
[0030]
其中，酿酒酵母yt28的5.8s its rdna的测序结果如seq id no.1所示。
[0031]
与相关模式菌株酿酒酵母yjm271相似性：99％，鉴定为酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)。
[0032]
实施例2酿酒酵母yt28和商业酿酒酵母小型酿酒比较试验
[0033]
将成熟的马瑟兰品种酿酒葡萄除梗破碎，以1l玻璃广口瓶作为葡萄酒发酵容器，yt28及来源酒庄使用的商业酿酒酵母共两组分别设置3个平行。取在甘油管中保存的菌株1ml接种于50mlypd液体培养基中，在28℃摇床中振荡培养12h。向每个广口瓶中加0.8l葡萄醪，0.8ml亚硫酸。酵母按3％接种量接入葡萄醪。用蘸有亚硫酸的纱布清理广口瓶口、瓶盖，瓶盖倒放，置于25℃下发酵。葡萄醪开始发酵后，每天进行温度、糖度和比重的检测并记录。根据发酵情况适时搅拌。当葡萄酒比重不再下降时，取上层清液灌装，密封置于4℃冰箱中保存。
[0034]
通过高效液相色谱法(hplc)对葡萄酒中还原糖、甘油、乙醇及部分有机酸含量进行测定，测定结果如表1所示。并根据gb/t 15038-2006对葡萄酒基本理化指标进行检测。
[0035]
表1测试菌株小型酿酒试验后酒样基本糖酸含量
[0036][0037]
小型酿酒试验结果显示，yt28的发酵性能稳定，酒样乙醇含量高于11(v/v％)，总糖不高于4g/l，挥发酸低于1.2g/l，符合gb15038-2006对干型葡萄酒相关指标的要求。
[0038]
葡萄酒香气成分的定性首先采用nist2011和demo谱库检索，再通过各物质在两根不同极性色谱柱——强极性色谱柱tg-waxms(30m
╳
0.25mm i.d.coated with 0.25um)和非极性色谱柱db-5ms(30m
╳
0.25mm i.d.coated with 0.25um)上的线性保留指数(lri)进行初步定性，进而通过对比检出物质与文献中报道的该物质的保留指数进行准确定性。定量分析采用峰面积归一化法确定各挥发性化合物的相对百分含量。
[0039]
本土酵母菌株yt28其酯类物质相对含量较高，并增加了很多不同种类的酯类物质，香气更浓郁。较商业酵母可以更多的保留来自果实的品种香气，同时丰富了葡萄酒的发酵香。
[0040]
表2马瑟兰葡萄汁和葡萄酒的挥发性香气成分分类总结
[0041][0042][0043]
表3不同酿酒酵母挥发性香气成分的种类
[0044]
种类(种)sc4yt28酯类1323醇类25酸类35醛类-1其他类13总数1937
[0045]
葡萄酒的闻香评价试验，邀请10位专业葡萄酒品评师，采用五点强度法对马瑟兰葡萄酒香气的八个方面(酒精气味、花香、绿色水果及柑橘类水果、核果与热带水果、红色水
果与黑色水果、果干、草本植物、发酵香气)进行评价，感官评价员同时进行偏爱排序和差异性比较，每个样品用四位数字标记并随机呈送给每一感官评价员。闻香评价结果见图2闻香评价的风味雷达图。可以看出，yt28菌株具有很好的香气轮廓，花香、绿色水果和红色水果香气浓郁，这可以与gc-ms的结果相互验证。
[0046]
综上所述，优选本土野生酿酒酵母菌株yt28在酿造干红葡萄酒过程中，表现出优秀的发酵性能，与商业酵母相比，更能提升马瑟兰葡萄酒中香气物质的种类和丰富度，保持葡萄品种典型的香气风味特征，酿造出本地特色葡萄酒，具备商业化应用的潜力。

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