FRT细胞株在制备筛选Piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用的制作方法

frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的应用
技术领域
[0001]
本发明涉及生物医药领域，特别涉及frt细胞株在制备筛选piezo1调节 剂的制剂或试剂盒中的应用。


背景技术：

[0002]
2010年末，patapoutian教授等发现了受机械力刺激并促使钙离子内 流的机械压电通道fam38a和fam38b，并命名为piezo1、piezo2，之后相关 研究快速成为热门，两种通道生理功能也逐渐清晰。机械压电通道piezo在多 种哺乳动物内皮细胞中均有表达，其中piezo1能够接受牵拉或按压的机械刺 激并引发细胞外ca
2+
内流，进而参与一系列非常重要的生理功能。有研究发 现，piezo1在血管及淋巴管发育、血压调控、红细胞体积调控中起到了重要 的作用，抑制piezo1的表达会导致淋巴管发育不良，溶血性贫血。piezo1通 道具有一系列重要的生理作用，因此具有较高的研究价值，piezo1的特异性 调节剂在相关研究中发挥重要的作用。研究表明，虽然yoda1和jedi1，jedi2 可以特异性地激活piezo1通道，但是yoda1作为激活剂激活作用周期长，而 jedi1，jedi2与piezo1结合亲和力较低，需要较高浓度的jedi才能引起激活。 现有的抑制剂gd
3+
和钌红(ruthenium red，rr)均是广谱钙离子通道抑制剂， 缺乏特异性。因此，如何高通量筛选piezo1的特异性调节剂是深入研究piezo1 通道亟待解决的问题。
[0003]
电生理技术是研究离子通道的金标准，可以用于离子通道调节剂的筛选。 但是此方法不仅需要特定的仪器设备，对技术人员也有很高的要求，不适合 用于通量筛选激活剂和抑制剂的方法。也有研究者使用放射性离子和阴离子 敏感的荧光染料以及化学发光的方法筛选激活剂和抑制剂，但是也需要特殊 材料和复杂的技术，且局限性较强，同时，一次实验后还要重新制备样品， 限制了方法的推广和应用。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明构建了基于钙激活氯离子通道蛋白1(ano1)的piezo1 调节剂高通量筛选模型。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0007]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂，细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
[0008]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；
[0009]
其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关；
[0010]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0011][0012]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0013]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0014]
钙激活氯离子通道蛋白1(anoctamin-1，ano1)作为一种钙激活氯离子 通道(calcium-activated chloride channel，cacc)能够在ca
2+
的作用下开放并 向胞浆中转运cl-、i-等卤素阴离子，但是细胞内外均含有大量cl-，细胞内cl-会在一定程度影响检测结果，而不同于细胞内丰富的cl-，i-在细胞内外含量 极低，选用i-进行实验具有干扰低易控制的优点。黄色荧光蛋白(yellow fluorescent protein,yfp)可在细胞内长久表达，其相对荧光强度高，yfp具 有多种突变体，有遇卤素离子淬灭的特性，不同的突变体对不同的卤素离子 敏感，其中双突变体yfp-h148q/i152l对i-具有极高的亲和力，基于此原理， 本研究通过构建共表达ano1-egfp和yfp-h148q/i152l的fischer大鼠甲状 腺上皮(fischer rat thyroid，frt)细胞，构建可用于研究piezo1通道生理功 能的高通量筛选模型，当piezo1通道被激活时，内流的ca
2+
引起cacc开放， 细胞外的i-内流可以引起yfp-h148q/i152l淬灭。模型模式图如图1。本模型 可反复传代，重复性好，经济，快捷，可以敏感地反应细胞内钙信号的变化， 为piezo1通道激活剂、抑制剂的筛选提供更加优秀的解决方案，以及为其他 ca
2+
通道的调节剂高通量筛选方法的建立提供新的思路。
[0015]
在本发明的一些具体实施方案中，所述frt细胞株的构建方法为：构建 钙激活氯离子通道ano1和对卤族元素敏感的黄色荧光蛋白双突变体 yfp-h148q/i152l真核表达载体，经脂质体转染、抗生素筛选和稀释，获取 共表达ano1和yfp-h148q/i152l的frt细胞。
[0016]
在本发明的一些具体实施方案中，所述piezo1调节剂包括jedi1，jedi2 或yoda1。
[0017]
本发明提供了frt细胞株在检测细胞内游离钙离子浓度中的应用；所述 frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0018]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂，细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
[0019]
所述荧光信号为相对荧光强度变化值/slope值/斜率值；
[0020]
其中，所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关；
[0021]
所述相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0022][0023]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值；
[0024]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0025]
本发明提供了frt细胞株在制备检测细胞内游离钙离子浓度的制剂或试 剂盒中的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达。
[0026]
本发明提供了frt细胞株在制备预防和/或治疗与piezo1通道相关疾病的 药物中的应用；所述frt细胞株中ano1和yfp-h148q/i152l共表达；
[0027]
所述frt细胞株通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂，细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系；
(slope)值。加入piezo1调节剂应用荧光淬灭动力学实验检测frt模型细胞 slope值，加入piezo1激活剂，应用荧光淬灭动力学实验检测frt模型细胞 slope值并绘制浓度依赖曲线。再通过fura-2荧光探针检测细胞内的钙信号随 piezo1激活剂浓度的变化，分析细胞内ca
2+
浓度与相对荧光强度之间的关系， 计算模型z
′
因子及信噪比。
[0053]
rt-pcr、dna测序比对和western印迹结果表明，frt细胞内源性表 达piezo1。ano1和yfp-h148q/i152l表达清晰，位置正确，并且ano1被 激活后模型荧光淬灭，证实转染基因表达的蛋白具有生物学活性，frt模型 细胞构建成功。frt模型细胞加入ano1激活剂离子霉素和piezo1的3种 激活剂jedi1，jedi2，yoda1荧光均淬灭，加入gd
3+
后再加入yoda1荧光不淬 灭，证实模型可以用于筛选piezo1通道调节剂，frt模型细胞离子霉素的ec
50
为(7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
，yoda1的ec
50
为(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
，jedi1的 ec
50
为(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
，jedi2的ec
50
为(158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
。 fura-2实验结果证明模型能敏感的反应细胞内钙信号变化。模型z
′
因子为 0.82，信噪比为13.29：1，可用于piezo1通道调节剂高通量筛选。
[0054]
本发明成功构建了能够快速，准确，便捷地筛选piezo1通道激活剂和抑 制剂的高通量筛选模型。
附图说明
[0055]
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实 施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
[0056]
图1示cacc法筛选piezo1调节剂原理；其中，a：未加激活剂之前，yfp 双突变体荧光未淬灭；b：加激活剂之后，yfp双突变体荧光淬灭；
[0057]
图2示frt细胞中piezo1mrna表达检测结果图；其中，a：以frt细胞的 cdna为模板，应用piezo1两种特异性引物和管家基因β肌动蛋白进行pcr产物 电泳图；b：piezo1条带的切胶回收产物测序结果在chromas软件上进行分析得 到测序峰图，竖线位置为内含子；c：核苷酸序列在ncbi-blast比对结果图；
[0058]
图3示western blot检测frt细胞中piezo1蛋白表达；
[0059]
图4示倒置荧光显微镜观察稳定转染后蛋白质表达情况；其中，a： ano1-egfp在frt细胞中的表达；b：yfp-h148q/i152l在frt细胞中的表达；
[0060]
图5示加入ionomycin应用荧光淬灭动力学实验检测模型ano1和yfp的生 物学活性；
[0061]
图6示加入piezo1的激活剂和抑制剂应用荧光淬灭动力学实验检测模型筛 选piezo1调节剂的功能，其中，a：向模型中分别加入jedi1(终浓度200μmol
·
l-1), jedi2(终浓度150μmol
·
l-1)，yoda1(终浓度20μmol
·
l-1)and gd3++yoda1(终浓 度均为20μmol
·
l-1)荧光淬灭动力学实验结果图；b：统计学分析结果，n＝4. **p<0.01；
[0062]
图7示各激活剂的剂量依赖曲线，frt模型细胞离子霉素的ec
50
为 (7.76
±
0.53)μmol
·
l-1
，yoda1的ec
50
为(17.27
±
1.21)μmol
·
l-1
，jedi1的ec
50
为(200.60
±
4.46)μmol
·
l-1
，jedi2的ec
50
为(158.10
±
4.65)μmol
·
l-1
；
[0063]
图8示模型slope值与细胞内ca
2+
浓度关系分析；其中，a：加入不同浓度 yoda1检测模型slope值；b：加入不同浓度yoda1检测模型细胞内ca
2+
浓度；c： 对a、b直线拟合；
[0064]
图9示z
′
因子检测结果，模型z
′
因子为0.82；
[0065]
图10示cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果；其中，a示在细胞内不同 ca
2+
浓度情况下，cacc法和荧光探针法灵敏度比较结果；b示在细胞内ca
2+
浓度分别为40、50、100、200、400和800nmol/l的情况下，cacc法和荧光探 针法灵敏度比较结果。
具体实施方式
[0066]
本发明公开了frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需 要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的， 它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行 了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的 方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0067]
本发明首次提出了相对荧光强度变化值/slope值/斜率值的概念：
[0068]
本方法通过动态检测相对荧光强度的变化，并进一步量化相对荧光强度 的变化，
[0069]
每一个荧光强度变化值(也称作slope值/斜率值)对应一个细胞内的ca
2+
浓度，结果显示相对荧光强度变化值/slope值/斜率值与细胞内ca
2+
浓度呈现 良好的正相关。
[0070]
具体相对荧光强度变化值/slope值/斜率值计算如下：
[0071][0072]
0s～1.4s的相对荧光值的平均值。
[0073]
y：2.4s～14.8s与0.6s～13s做线性回归分析所得到的线性回归的结果。
[0074]
如图6a为荧光强度变化情况，图6b为根据图6a荧光强度变化情况量 化结果。
[0075]
通过向frt细胞共转染ano1和yfp-h148q/i152l，本研究构建了可用 于piezo1通道调节剂高通量筛选的frt模型细胞，通过验证结果表明，本研 究建立的frt模型细胞可用于筛选piezo1通道调节剂，信噪比为13.29:1。frt 模型细胞对离子霉素，yoda1，jedi1和jedi2的浓度效应ec
50
分别为 (7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
、(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
、(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
、 (158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
。fura-2荧光探针实验证实，frt模型细胞内ca
2+
浓度对piezo1激活剂呈浓度依赖关系，且ca
2+
浓度变化与frt模型细胞荧光 淬灭slope呈正相关，由于slope比ca
2+
浓度信号窗口更大，因此frt模型细 胞可以敏感反应细胞内ca
2+
浓度的变化，模型z
′
因子高达0.82，符合高通量 筛选要求。
[0076]
由于本模型本质上是通过荧光信号反应细胞内ca
2+
浓度的变化进而筛选 piezo1通道调节剂，在快速，灵敏的同时存在一定的缺陷，以下因素可能会 影响筛选结果：首先考虑到frt细胞可能内源性表达的如瞬时受体电位通道、 酸敏感型离子通道1a、毒蕈碱型乙酰胆碱受体和嘌呤能受体等其他一些能升 高细胞内ca
2+
的g蛋白偶联受体或者通道，它们的激活和抑制都会影响到 piezo1通道调节剂的筛选。其次，一些对荧光信号有干扰作用的化合物也会 严重影响筛选结果。此外一些极性较高，且作用位点于细胞内的化合物，因 其不能进入到细胞内，故很难通过本模型筛选。但是，本模型仅作为piezo1 的初筛模型，上述假阳性结果可以通过后续实验分辨真伪。尽管本模型存在 一些问题，但是本模型快速、简
便、经济和稳定性好的优点，仍可以为筛选 工作带来极大的便利。本团队目前已经筛选300余种中药小分子化合物，尚 未发现高活性的激活剂和抑制剂，下一步拟扩大筛选范围，如从核酸适配体 和天然抗体库中筛选，以期发现高效特异的piezo1调节剂。
[0077]
综上，本模型是高通量筛选piezo1通道调节剂的优秀解决方案。本模型 的成功构建不仅为后续piezo1通道调节剂筛选提供了优秀的解决方案，为 piezo1调节剂的临床应用奠定了基础，同时还为其他钙离子通道调节剂筛选 方法的构建提供新思路。
[0078]
统计学分析：所有实验重复3次，数据结果用表示，采用graphpadprism 8.0进行作图与统计学分析，使用单因素方差分析，配对样本t检验，以 p＜0.05为差异有统计学意义。
[0079]
主要试剂和仪器
[0080]
frt细胞由alan s.verkman教授馈赠，本实验室保存；所用引物由生工 公司合成；胎牛血清(fetal calf serum，fbs)(以色列biological industries 公司)；f-12培养基，fura-2/am，yoda1、jedi1、jedi2和离子霉素(ionomycin) (均美国sigma公司)；转染试剂lipofectamine 3000(美国thermo fisher 公司)；trizol，遗传霉素(geneticin，g418)和博来霉素(zeocin)(均美 国invitrogen公司)；切胶回收试剂盒(生工公司)；逆转录试剂盒、pcr试 剂盒、全蛋白提取试剂盒、bca蛋白测定试剂盒(均全式金公司)；兔抗大 鼠piezo1多克隆抗体、兔抗大鼠piezo2多克隆抗体、兔抗大鼠β肌动蛋白单 克隆抗体、山羊抗兔igg(hrp标记)(均英国abcam公司)。
[0081]
fluostar omega全自动多功能酶标仪(德国bmg公司)，倒置荧光显 微镜(日本nikon公司)，co2培养箱(日本panasonic公司)，pcr仪(美 国abi公司)，凝胶成像仪(美国bio-rad公司)，nanodrop 2000(美国 thermo fisher公司)，c6流式细胞仪(美国bd公司)。
[0082]
本发明提供的frt细胞株在制备筛选piezo1调节剂的制剂或试剂盒中的 应用中所用原料及试剂均可由市场购得。
[0083]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0084]
实施例1 rt-pcr检测frt细胞piezo1表达
[0085]
设计大鼠piezo1和piezo2的引物各两对(如表1所示)，取生长状态良 好的frt细胞株，按照trizol说明书提取frt细胞总rna，nanodrop2000 测量总rna浓度。使用逆转录试剂盒逆转录合成cdna：将rna模板和试 剂盒成分按照试剂盒说明书推荐的用量混匀，65℃孵育5min后冰浴2min， 再加入其余组分，在pcr仪中25℃孵育10min后42℃孵育30min。使用 nanodrop2000测定合成的cdna的质量。pcr对产物进行扩增，葡聚糖凝胶 电泳对比产物长度是否正确。
[0086]
将电泳后的凝胶放置在紫外灯下，用洁净的手术刀切下待测序的条带，切 胶时尽量切得快速，尽量切去不必要的凝胶。使用电子天平对切下的凝胶进 行称重，并按照凝胶的质量按照切胶回收试剂盒说明书推荐比例加入适量的 溶胶试剂，置于60℃溶胶5min，过柱纯化，得到纯化的pcr产物。回收后 的dna溶液进行核酸测序。测序工作由上海生工公司完成。使用chromas软 件检查测序峰，并用ncbi-blast对比核酸序列与测序结果。
[0087]
实施例2 western印迹检测frt细胞piezo1和piezo2蛋白表达
[0088]
取生长状态良好的frt细胞株，按照全蛋白提取试剂盒提取frt细胞总 蛋白，提取完成后使用nanodrop 2000微量分光光度计在280nm波长下测定 浓度，并计算总蛋白量。加
入20μl 5
×
loadingbuffer，于100℃金属浴15min， 制备好的蛋白样品置于-20℃冰箱保存。
[0089]
将制好的蛋白样品于-20℃冰箱中取出室温放置数分钟后，先低速离心1 min，再置于100℃金属浴15min，后12000r/min离心5min。在电泳槽里加 入1
×
电泳液，加入样品，按照nanodrop 2000测出的总蛋白量进行加样，每 个孔上样20μg总蛋白，恒压80v电泳30min。跑至彩色marker分离开后， 更换电压120v电泳60min，直到蓝色条带跑出胶板底部。根据marker指示 的分子大小切胶，按照胶的大小剪好置于pvdf膜。放置好后置于转膜仪中， 100v持续120min。转好的膜置于5％的脱脂奶粉中进行封闭，于室内摇床上 2h，之后用tbs洗膜。洗膜完成加入piezo1，piezo2和β肌动蛋白的兔抗鼠 抗体作为一抗4℃过夜封闭，回收一抗，继续用pbs洗膜，洗3到4次。再 封闭二抗，二抗为羊抗兔抗体。洗完膜后，显色，成像。一抗和二抗均按照 说明书进行1：1000稀释。
[0090]
实施例3共表达ano1-增强绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein，egfp)与yfp-h148q/i152l的frt模型细胞构建
[0091]
取已转入ano1-egfp/pcdna3.1的大肠杆菌接入50ml 2
×
yt培养基， 37℃过夜培养，按照质粒小提取试剂盒说明书裂解细菌提取质粒。提取完成 后，用nanodrop 2000检测质粒的浓度和纯度，按照lipofectamine 3000试剂 要求，取浓度在500～5000mg
·
l-1
的质粒备用。转染前12h消化frt细胞至 24孔板，保证转染时细胞密度达到70％～90％，按照lipofectamine 3000说明 书在ep管中加入转染试剂、质粒和f-12基本培养液，室温孵育20min。孵 育时用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，pbs)清洗细胞，去除残留 的血清。清洗完成后，每个孔中加入450μl f-12完全培养液。脂质体-质粒混 合溶液孵育完成后，向每个孔逐滴加入50μl混合溶液，摇匀后放入co2培 养箱37℃孵育48h，在荧光显微镜下观察细胞表达绿色荧光，表示 ano1-egfp转染成功，再加入含有博来霉素的筛选培养基进行筛选。筛选2 周后对得到的细胞株进行有限稀释，获取表达量高的克隆株。得到高表达的 克隆后扩大培养细胞。
[0092]
用同样的方法提取yfp-h148q/i152l的质粒并转染稳定表达ano1-egfp 的frt细胞。转染48h后，荧光显微镜下观察细胞表达情况，并加入含有遗 传霉素的筛选培养基进行筛选。筛选2周后对得到的细胞株进行有限稀释， 获取表达量高的克隆株。得到高表达的克隆株后扩大培养细胞。
[0093]
实施例4荧光淬灭动力学实验鉴定转染ano1和yfp-h148q/i152l后 frt模型细胞的生物学功能
[0094]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中，37℃过夜培养。使 用含edta的无钙镁pbs清洗细胞2遍，每个孔加入10μmol
·
l-1
的ano1 激活剂离子霉素50μl。在fluostar omega全自动多功能酶标仪的泵中加入 含有ca
2+
、mg
2+
的nai-pbs，设定泵进样量为150μl，泵加样前由仪器确定 各孔的增益(gain)值，与初始荧光强度。泵加样后仪器每隔0.2s自动计算 一次相对荧光强度(由该时刻荧光强度与gain值和初始荧光强度换算得到)， 记录各时刻相对荧光强度变化，原始数据由graphpad prism 8.0绘制模式图， 根据荧光淬灭动力学实验结果确定稳定表达ano1和yfp-h148q/i152l的 frt模型细胞是否具有生物学功能。
[0095]
实施例5荧光淬灭动力学实验检测模型功能
[0096]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中，37℃过夜培养。用 含edta的无钙镁pbs清洗细胞2遍，将待检测的细胞分为6组：空白组 (pbs)、离子霉素(10μmol
·
l-1
)、jedi1(200μmol
·
l-1
)、jedi2(150μmol
·
l-1
)、 yoda1(20μmol
·
l-1
)和gd
3+
+yoda1(均20μmol
·
l-1
)组，每组药物体积均 为50μl。在fluostar omega全自动多功能酶标仪的泵中加入含有ca
2+
和 mg
2+
的nai-pbs，设定泵进样量为150μl，泵加样前由fluostar omega全自 动多功能酶标仪确定各孔的增益(gain)值，泵加样后仪器每隔0.2s自动计 算一次相对荧光强度，记录各组相对荧光强度变化。
[0097]
实施例6绘制模型浓度依赖曲线确定模型功能活性
[0098]
将生长状态良好的frt模型细胞铺于黑壁96孔板中，37℃过夜培养。待 检测的细胞分为5组：空白组、离子霉素、jedi1、jedi2和yoda1，除空白组 外每组按1000，900，800，700，600，500，400，300，200，100，75，50， 25，10，5，1和0.2μmol
·
l-1
设置浓度梯度，每个浓度重复3次，利用excel 软件对原始数据进行宏计算，求出斜率(slope)值。记录各组slope值使用 graphpad prism 8.0软件绘制模型对不同激活剂的浓度依赖曲线。
[0099]
实施例7 fura-2荧光探针法检测frt模型细胞ca
2+
浓度
[0100]
frt模型细胞消化离心后制成细胞悬液，加入fura-2/am(终浓度为5 μmol
·
l-1
)，37℃孵育30min，并轻轻振动。采用无钙镁pbs缓冲液洗涤细 胞1次，以去除细胞外残留的fura-2/am。离心后，加入无钙镁pbs缓冲液 制成细胞悬液。在fluostar omega全自动多功能酶标仪中使用340nm和380 nm双激发源在510nm处记录荧光强度，测定时记录静息时和加入yoda1 (piezo1激活剂)给具体浓度后的340nm/380nm荧光比值，根据荧光比值计 算ca
2+
浓度。
[0101]
实施例8 z
′
因子评估
[0102]
将一个96孔板的前6列加入yoda1100μmol
·
l-1
作为实验组,同时将96 孔板的后6列加入pbs缓冲液作为对照组，检测slope值并计算z
′
因子值。 计算公式如下：z
′
＝1-3
×
(|sd
yoda1
|+|sd
pbs
|)/(|mean
yoda1
|－|mean
pbs
|)。式中，sd 为标准差，mean为平均数。
[0103]
效果例1
[0104]
frt细胞中piezo1mrna表达
[0105]
以frt细胞的cdna为模板，应用piezo1两种特异性引物分别扩增出一 条401bp和479bp的条带，管家基因β肌动蛋白在对应的泳道出现260bp条 带，与预期的目的片段大小相符(图2a)。piezo2两种特异性引物均未扩增 出条带。piezo1引物设计如表1。
[0106]
piezo1条带的切胶回收产物测序结果在chromas软件上进行分析，测序峰 图如图2b，测序峰峰型整齐，无重叠峰，竖线位置为内含子。所测核苷酸序 列在ncbi-blast进行比对，与genbank数据库收录的piezo1的基因序列 相似性为100％，如图2c。表明frt细胞内源性表达piezo1mrna。
[0107]
表1引物序列
[0108][0109]
frt细胞中piezo1蛋白表达
[0110]
western印迹结果显示，frt细胞中β肌动蛋白表达清晰，有大小为413ku 的piezo1蛋白表达，符合其理论值(如图3)，piezo2蛋白未出现对应条带。 表明frt细胞在蛋白水平上内源性表达piezo1。
[0111]
frt细胞模型的鉴定
[0112]
通过荧光显微镜观察，ano1转染成功，表达清晰(图4a)， yfp-h148q/i152清晰表达于胞浆中(图4b)。细胞中加入离子霉素10 μmol
·
l-1
，加入i-后，荧光淬灭；只加入pbs的细胞，加后加入i-后，荧光不 淬灭，细胞具有cacc通道功能，证明ano1-egfp表达于frt模型细胞胞 膜上而非表达于细胞外，frt模型细胞构建成功(图5)。
[0113]
表2图4数据
[0114]
[0115]
[0116][0117]
表3图6a数据
[0118]
[0119]
[0120]
[0121][0122]
表4图6b数据
[0123][0124]
frt模型细胞筛选piezo1调节剂的功能
[0125]
frt模型细胞加入ano1激活剂离子霉素后，荧光淬灭；而加入piezo1 的3种激活剂jedi1，jedi2和yoda1荧光淬灭程度对比加入离子霉素组要更大。 +gd
3+
/yoda1组加入gd
3+
后再加入yoda1的荧光不淬灭(图6a)。+yoda1 组与0空白组(pbs)以及+gd
3+
/yoda1组具有显著性差异(p<0.01)(图6b)， 说明frt模型细胞可用于piezo1调节剂的筛选。
[0126]
表5图6数据
[0127]
[0128]
[0129]
[0130][0131]
frt模型细胞检测不同激活剂的浓度效应
[0132]
frt模型细胞离子霉素的ec
50
为(7.76
±
1.03)μmol
·
l-1
，yoda1的ec
50
为(17.27
±
2.11)μmol
·
l-1
，jedi1的ec
50
为(200.60
±
5.12)μmol
·
l-1
，jedi2 的ec
50
为(158.10
±
3.21)μmol
·
l-1
(图7)。
[0133]
表6图8a数据
[0134][0135][0136]
表7图8b数据
[0137][0138]
frt模型细胞荧光淬灭slope与细胞内ca
2+
浓度关系
[0139]
随着yoda1浓度的升高，ca
2+
浓度越高，其浓度与yoda浓度呈浓度依赖 关系(r2＝0.9939，p<0.05)(图8b),ec
50
为(18.68
±
3.91)μmol
·
l-1
。结合 frt模型细胞荧光淬灭slope对yoda1的浓度效应(图8a)，利用graphpadprism 8.0软件做出斜率值与细胞内ca
2+
浓度关系(图8c)，frt模型细胞荧 光淬灭slope与细胞内ca
2+
浓度呈正相关，且细胞荧光淬灭slope比细胞内ca
2+
浓度值信号窗口更大。因此利用frt模型细胞检测荧光淬灭slope值可以敏 感地反应细胞内ca
2+
浓度的变化。
[0140]
表8图9b数据
[0141]
[0142][0143]
frt模型细胞评估piezo1调节剂yoda1的z
′
因子
[0144]
经软件分析得yoda1组的slope值为85.60
±
2.21，缓冲液对照组的slope 值为6.44
±
1.55(图9b)，信噪比为13.29：1，计算得frt模型细胞piezo1 调节剂yoda1的z
′
因子为0.82，大于0.5，表明细胞模型可用于piezo1调节 剂的高通量筛选(图9a)。
[0145]
效果例2荧光探针法和基于cacc检测细胞内钙浓度的检测方法(下面简 称为cacc法)比较
[0146]
表9
[0147][0148]
备注：1234比较结果显示cacc法优于荧光探针法；5比较结果显示荧 光探针法优于cacc法。
[0149]
详细说明如下：价格：invitrogen公司的检测细胞内钙浓度的荧光探针 (fluo4)市场价格为4196.00人民币。
[0150]
cacc法灵敏度高于荧光探针法的原因：
[0151]
(1)细胞内ca
2+
浓度仅仅为nm级别或者μm级别，很少能达到mm级 别，也就是说细胞内ca
2+
浓度的微量性决定了其直接检测的难度；
[0152]
(2)cacc法是通过yfp双突变体的相对荧光信号的变化间接反映细胞 内ca
2+
浓度，yfp双突变体具有极强的碘离子敏感的特性；cacc单个通道在 碘离子依次通过的情况下，每秒钟可转运106个碘离子；而且通过稳定转染， 本细胞模型具有高表达cacc的特性(也就是说每个细胞上表达多个cacc)； 此外yfp的荧光信号强(yfp的荧光强度是普通荧光信号如gfp即绿色荧光 蛋白的数倍)。
[0153]
如图10所示，结果表明：在细胞内ca
2+
浓度在40、50、100、200、400 和800nm时cacc法灵敏度均显著优于荧光探针法。
[0154]
综上所述，cacc灵敏度高于荧光探针法。
[0155]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普 通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润 饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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