一株稀有鮈鲫脑细胞系及其应用的制作方法

[0001]
本发明涉及水生生物研究技术领域，更具体的说是涉及一株稀有鮈鲫脑细胞系及其应用。


背景技术：

[0002]
鱼类原代细胞系的建立目前属于较为成熟的技术，但要获得对病毒敏感的细胞系，具有一定的偶然性和困难性；通常需要以数量对质量，即制备大批量的原代细胞系，从中筛选出所需要的细胞系。
[0003]
稀有鮈鲫(gobiocypris rarus)属鲤科鮈鲫属，是中国特有种类，主要分布于四川省长江上游。稀有鮈鲫是一种小型的实验动物，具有生长速度快，易繁殖，遗传背景清晰的特点，这些特性使其成为水生态毒理学良好的受试生物。目前尚未未见关于稀有鮈鲫脑来源细胞系的报道。
[0004]
因此，如何建立一种对水生动物病毒敏感的鮈鲫脑来源细胞系成为本领域亟待解决的技术问题。


技术实现要素：

[0005]
有鉴于此，本发明提供了一株稀有鮈鲫脑细胞系，具有较轻的繁殖能力，对多种水生生物病毒具有敏感性。
[0006]
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007]
一株稀有鮈鲫脑细胞系，分类命名稀有鮈鲫脑细胞系grb，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为cctcc no:c2019247，保藏时间为2019年11月7日。
[0008]
上述稀有鮈鲫脑细胞系在水生动物病毒增殖中的应用。
[0009]
优选地，水生动物病毒为鳜弹状病毒scrv或基因ii型草鱼呼肠弧病菌gcrv-ii。
[0010]
优选地，水生动物病毒为鲤春病毒血症病毒svcv或罗非鱼湖病毒tilv。
[0011]
上述稀有鮈鲫脑细胞系在水生生态环境毒性检测中的应用，该毒性检测为水生动物病毒检测。
[0012]
上述稀有鮈鲫脑细胞系在水生动物病毒疫苗研制中的应用。
[0013]
由上述技术方案可知，本发明稀有鮈鲫脑细胞系首次在体外成功培养，采用胶原酶和edta共同消化分离稀有鮈鲫脑组织细胞，培养2天时，部分细胞贴壁，5天时，明显出现延伸生长；12-15天后铺满培养皿，进行消化后，具有较强的繁殖能力，呈现典型的上皮细胞形态。
[0014]
本发明细胞系传代稳定，目前传至70代，细胞仍能良好地维持上皮细胞形态特点、生长特性；冷冻保存复苏后增殖能力较强、状态良好，适于实验应用研究。
[0015]
本发明稀有鮈鲫脑细胞系对多种水生生物病毒具有敏感性，接毒后均出现细胞病变，可应用于病原特性研究、水体毒性评价、疫苗研制等方面。
附图说明
[0016]
图1所示为相差显微镜下的稀有鮈鲫脑细胞系grb形态；
[0017]
其中，a为原代细胞；b为20代稀有鮈鲫脑细胞；c为50代稀有鮈鲫脑细胞；d为70代稀有鮈鲫脑细胞；
[0018]
图2所示为稀有鮈鲫脑细胞grb染色体；
[0019]
其中，a为稀有鮈鲫脑细胞grb染色体数目；b为稀有鮈鲫脑细胞grb p60代染色体；
[0020]
图3所示为稀有鮈鲫脑细胞grb病毒敏感性cpe图；
[0021]
其中，a.空白对照；b.接种svcv的grb细胞；c.接种tilv的grb细胞；d.接种gcrvⅱ的grb细胞；e.接种scrv的grb细胞；
[0022]
图4所示为稀有鮈鲫脑细胞grb的病毒感染pcr电泳图；
[0023]
其中，pc.阳性对照；nc.阴性对照。
具体实施方式
[0024]
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0025]
实施例1稀有鮈鲫脑细胞系的分离、传代培养和冻存保种
[0026]
实验动物：(3
±
0.5)g的稀有鮈鲫(经过反复的分子方法验证其为未感染水生动物病毒的健康稀有鮈鲫)。
[0027]
实验器具：解剖刀、眼科剪刀、眼科镊子和纱布等。
[0028]
培养基和相关试剂：
[0029]
青霉素-链霉素-两性霉素b三抗溶液；
[0030]
培养基：l-15培养基(gibco公司)；
[0031]
胎牛血清：澳洲胎牛血清(gibco公司)；
[0032]
胰酶消化液：磷酸氢二钠2.3g，磷酸二氢钾0.1g，氯化钠8.0g，氯化钾0.2g，edta 0.2g，胰酶2.5g，水1000ml；
[0033]
医用酒精；
[0034]
0.01m的pbs缓冲液(nacl 80g，na2hpo4·
12h2o 29g，kh2po
4 2 g，kcl 25 2g，水1000ml)；
[0035]
细胞冻存液：添加有10﹪dmso、25﹪的澳洲胎牛血清的l-15培养基。
[0036]
稀有鮈鲫脑细胞系的分离：
[0037]
检测健康的稀有鮈鲫，在实验室内暂养15天，无其他疾病，开始实验：
[0038]
(1)取稀有鮈鲫在医用酒精中浸泡15-30s，在无菌条件下，剪取稀有鮈鲫的脑，将稀有鮈鲫剪碎的无菌的脑组织放入添加有终浓度为1％青霉素-链霉素-两性霉素b三抗溶液(青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、两性霉素b100μg/ml)的l-15培养基中浸泡5min；
[0039]
(2)将浸泡后的脑组织剪成小块(约1mm3)，然后用浓度为0.1％w/v胶原酶i消化液(胶原酶ⅰ+0.01m pbs缓冲液)，消化30-45min，用培养基重悬，离心，弃掉上清液，加浓度为0.02％w/vedta消化液(edta+0.01m pbs缓冲液)，消化5-7min，离心去上清，最后加入a培养
液，重悬混匀成细胞悬液；
[0040]
a培养液为l-15培养基+终浓度为1％的青霉素-链霉素-两性霉素b三抗溶液(青霉素100u/ml、链霉素100μg/ml、两性霉素b100μg/ml)+20﹪胎牛血清，ph为7.2-7.6；
[0041]
(3)将细胞悬液移入培养瓶，放入到27℃培养箱中培养，无需co2；
[0042]
(4)待培养2天后观察细胞贴壁情况，适当加入a培养液(保证培养液ph 7.2-7.6)；待细胞铺到瓶底1/3的时候(4-5天)，更换新鲜的培养液一次；
[0043]
(5)待细胞铺满培养皿底(12-15天)，用胰酶消化液初步消化细胞，将消化的细胞放入a培养液进行传代培养，传代比率为1:2-1:3。
[0044]
其中一优势稀有鮈鲫脑细胞系命名为grb。
[0045]
传代培养：待grb细胞长满培养瓶底，弃掉旧的培养液，用pbs洗两次，加入1ml胰酶消化液进行消化；待细胞呈现“白雾”状的时候，加入a培养液，将细胞吹散使细胞混匀，按1:2-3的比例进行传代培养。
[0046]
图1为相差显微镜下的稀有鮈鲫脑细胞系grb的形态，呈现典型的上皮样细胞形态。
[0047]
冻存：按照传代培养的步骤进行消化，将细胞悬液计数；1000r/min离心5min，去除培养液，加入细胞冻存液，重悬细胞，收集于冻存管中，在冻存管上注明细胞的名称、细胞数和冻存日期，液氮保存。
[0048]
复苏：将冻存的grb细胞从液氮中取出，迅速放到37-40℃的水浴中，快速晃动冻存管，使其快速溶解，1500rpm，离心5min，去除细胞冻存液，加入a培养液置于27℃培养，16-24h后换液；复苏后的细胞增殖能力仍然很强，状态良好；日后根据细胞生长情况，隔2-3天传代1次。
[0049]
实施例2稀有鮈鲫脑细胞的染色体分析
[0050]
第60代稀有鮈鲫脑细胞grb于对数生长期加入终浓度为20μg/ml的秋水仙素，27℃处理3-5h后收集细胞，用0.075mol/l的kcl低渗处理20-25min，加入1ml预冷的卡诺固定液，1000r/min离心5min去上清后，用预冷的卡诺固定液固定3次，每次15min。采用冷滴片法滴片，干燥后，用5％的giemsa染色25min。镜检，分别选择100个分裂相进行核型分析和统计。
[0051]
结果显示(图2)，第60代的稀有鮈鲫脑细胞70％的染色体为2n＝50，与稀有鮈鲫体细胞的染色体一致。
[0052]
实施例3稀有鮈鲫脑细胞系grb对不同水生动物病毒的感染实验
[0053]
将生长状况良好的稀有鮈鲫脑细胞grb进行传代，传代比率为1:3，与a培养液充分混匀后分装于25cm2细胞培养瓶中，当细胞铺满瓶底80-90％时，吸弃培养液，hbss缓冲液清洗两次，分别接入1ml 103tcid50/ml的水生生物病毒，水生生物病毒分别为：鲤春病毒血症病毒(spring viraemia of carp virus,svcv)、基因ⅱ型草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,gcrvⅱ)、鳜弹状病毒(siniperca chuatsi rhabdovirus，scrv)、罗非鱼湖病毒(tilv)，pbs作为空白对照组；接入svcv的细胞培养瓶置于22℃恒温培养箱，接入其他病毒的细胞瓶放置28℃的培养箱；不同病毒的空白对照在相应的培养箱培养。
[0054]
病毒孵育1h后，弃病毒液，加入5ml细胞维持液(含5％fbs的l-15培养基)接入svcv的细胞培养瓶置于22℃恒温培养箱，接入其他病毒的细胞瓶放置28℃的培养箱，不同病毒的空白对照在相应的培养箱培养。每天观察细胞生长以及细胞病变效应cpe，一旦出现cpe
病变，在细胞未完全脱落之前收集细胞悬液，并进行rna提取，然后进行rt-pcr检测。未出现病变的接毒组盲传3代后，收集样本进行rt-pcr实验，分析病毒是否在grb细胞中增殖。
[0055]
收集样本时将培养瓶取出，放置于-20℃冰箱过夜，后取出待培养基融化后，用力敲打培养瓶，使细胞完全脱落。吹打混匀冻融后，取出200μl细胞悬液于离心管中进行核酸提取并进行pcr检测。琼脂糖凝胶电泳检测pcr结果。
[0056]
结果：grb细胞分别接种水生动物病毒后，如图3，部分细胞内出现明显的细胞病变(cpe)。在接种第7天收集各病毒悬液200μl提取核酸，进行pcr检测。
[0057]
其中svcv的目的条带为606bp，基因ⅱ型gcrv的目的条带为409bp，tilv-2017a目的条带为496bp，scrv的目的条带为281bp(图4)。
[0058]
根据pcr及凝胶电泳实验结果，接种四种病毒的细胞中，均可检测到目的条带，说明稀有鮈鲫脑细胞系能够增殖tilv、gcrvⅱ、scrv、svcv，为水生动物的研究提供了有力的材料。
[0059]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。
[0060]
对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

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