一种利用基因芯片技术检测饲料中海洋哺乳类动物成分的方法与流程

[0001]
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种利用基因芯片技术检测饲料中海洋哺乳类动物成分的方法。


背景技术：

[0002]
针对饲料中的动物成分，常规检测方法有显微镜、红外光谱、pcr，elisa等，但这些方法存在通量小，易产生假阳性结果等缺点，不适应当前高通量进出口饲料的大规模同时检测的发展趋势。需要建立一种更快速、准确和经济的方法，而基因芯片检测法是一种可以满足这些要求的方法。本文旨在建立一种使用一对通用引物结合基因芯片技术对饲料中的海洋哺乳类动物成分进行快速、简便、特异且低成本的检测方法，保证进出口饲料的安全。


技术实现要素：

[0003]
本发明的目的在于提供一种用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的特异性探针组合。
[0004]
本发明的另一目的在于提供一种用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的基因芯片。
[0005]
本发明的又一目的在于提供一种用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的试剂盒。
[0006]
本发明的又一目的在于提供一种利用基因芯片技术检测饲料中海洋哺乳类动物成分的方法。
[0007]
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
[0008]
用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的特异性探针组合，该特异性探针组合包括1个阳性对照探针和10种海洋哺乳动物家族的探针，所述阳性对照探针的的序列如seq id no.6所示，所述10种海洋哺乳动物家族的探针的序列如seq id no.1～5和seq id no.7～19所示。
[0009]
[0010][0011]
一种用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的引物和探针组合，该引物和探针组合包括如seq id no.20～21所示的通用引物和上述的特异性探针组合。
[0012]
primersequencesequence idfaagacgaggaagaccctatggagcttha(seq id no.20)rgattgcgctgttatccctagggta(seq id no.21)
[0013]
一种用于检测饲料中海洋哺乳类动物成分的基因芯片，它包括芯片载体和上述的特异性探针组合。
[0014]
作为一种优选技术方案，该基因芯片还包括质控探针体系，所述的质控探针体系包括如seq id no.22所示的阳性定位探针(pc)、如seq id no.23所示的阴性质控探针(nc)、如seq id no.24所示的荧光素标记互补链(qc)和空白对照(bc)，所述的空白对照(bc)为50％(v/v)dmso。
[0015]
probe nameprobe sequence(5
’
一3
’
)sequence idpcctggaacagccagaaggacseq id no.22ncgggtgggatcaatttggseq id no.23qcccaaattgatcccacccseq id no.24bc50％dmso [0016]
含有上述特异性探针组合、上述引物和探针组合或上述基因芯片的试剂盒。
[0017]
上述的特异性探针组合、上述的引物和探针组合、上述的基因芯片或上述的试剂盒在检测饲料中海洋哺乳类动物成分中的应用。
[0018]
一种利用基因芯片技术检测饲料中海洋哺乳类动物成分的方法，包括以下步骤：
[0019]
(1)提取样品中的dna；
[0020]
(2)以步骤(1)提取的dna为模板，利用如seq id no.20～21所示的通用引物进行pcr扩增反应；
[0021]
(3)将步骤(2)中pcr扩增反应的产物与权利要求1所述的特异性探针组合进行杂交，实现饲料中海洋哺乳类动物成分的可视化检测。
[0022]
本发明通过对海洋哺乳动物标记基因进行序列分析，选择线粒体dna(mtdna)16srrna基因为目标基因，利用一对通用引物，在该引物扩增区间设计了针对10种海洋哺乳动物的特异性基因芯片检测探针及1条阳性探针(oligo6)，构建检测基因芯片。采用该基因芯片能对至少5种海洋哺乳动物(海狮、海豹、海豚、江豚、白鲸)成分同时进行快速、准确的检测，具有很好的特异性，灵敏度均达到了10pg。该基因芯片检测技术将为我国进出口饲料
鉴别检测提供新的检测方法和技术支持。利用本方法对5份已知阳性样本进行检测，检测结果均呈阳性，与常规pcr结果符合率达100％。
[0023]
本发明的有益效果：
[0024]
本研究建立了一种快捷、特异、灵敏且稳定地检测动物源性基因芯片检测方法，可以应用于检测进出口饲料中是否含有违禁的海洋哺乳动物成分，也可以推广至动物产品的检测，将有效保障饲料和食品工业的健康发展。
附图说明
[0025]
图1为芯片样品杂交。
[0026]
其中，ⅰ：微阵列的白鲸样品杂交；ⅱ：微阵列的海豚样品杂交；ⅲ：微阵列的江豚杂交；ⅳ：微阵列的海豹样品杂交；
ⅴ
：微阵列的海狮样品杂交；
ⅵ
：来自俄罗斯的鱼粉微阵列杂交；
ⅶ
：秘鲁的鱼粉微阵列杂交；
ⅷ
：智利的鱼粉微阵列；
ⅸ
：nc(pcr阴性产物)；
ⅹ
：nc(水)。
具体实施方式
[0027]
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。
[0028]
一、材料和方法
[0029]
1.探针的设计
[0030]
寡核苷酸探针设计中dna序列的检索：从genbank中检索到目的物种和近缘非目的物种的线粒体基因16srrna，下载所有相关dna序列，用megalign(软件)进行比对分析，以筛选可用一对通用引物扩增出的用于鉴定的16srdna的特异性片段。
[0031]
用megalign(软件)进行序列比对后，对于每个目标物种，选择了一些探针序列，探针序列选择的重点在于它们区分目标物种和相关非目标物种的能力。从目的片段的保守区选择其他探针作为阳性对照。所有选择的探针序列长度约为20个核苷酸，用引物premier5(软件)进行评估。将探针退火温度(tm)调整为相似的值。最后，使用blast搜索将探针与genbank的序列进行比较筛选，确定在物种鉴定中的特异性片段。
[0032]
2.五种海洋哺乳动物样本的采集
[0033]
检测样品(见表1)由南京海洋世界、扬州大学、淮安龙宫提供。一些样本是血液，一些是鼻拭子，两个江豚的dna样本由无锡水产研究所赠予。
[0034]
表1检测样品
[0035][0036]
3.dna提取与扩增
[0037]
用dna提取试剂盒(tigen)对5种动物的血液和鼻拭子进行dna提取。荧光标记通用引物pcr扩增特异片段。用dna提取试剂盒(tigen)对3种来自不同国家(俄罗斯、秘鲁、智利)的鱼粉进行dna提取，作为阴性对照进行检测。并通过常规pcr和sanger测序，在genbank中查询，进行种属鉴定，以确定芯片杂交结果的准确性。
[0038]
pcr采用pcr混合物(promega gotaq)进行，该混合物由dna模板2μl，5
×
缓冲液4μl，引物f(10μm)0.5μl，引物r(10μm)1μl，mgcl21.2μl，dntps(2.5mm)1.6μl，go taq0.4μl，添加ddh2o至20ul。rcr程序如表2所示。
[0039]
表2 rcr程序
[0040][0041][0042]
4.芯片的构建与杂交
[0043]
10种海洋哺乳动物的寡核苷酸探针(如seq id no.1～5和seq id no.7～19所示，由中国北京博奥生物有限公司合成)和1个阳性对照探针(如seq id no.6所示)被定位到基因芯片上。每个探针浓度为15μm，重复点3个(见表3)。该基因芯片还包括质控探针体系，即如seq id no.23所示的阴性质控探针(nc)、如seq id no.22所示的阳性定位探针(pc)及如seq id no.24所示的荧光素标记互补链(qc)和空白对照(bc，50％dmso)，本研究所用的阳性定位探针及cys标记互补链如表4所示，质控探针与所检测的海洋哺乳动物的16srrna基因序列均无同源性。阳性定位点探针及荧光素标记互补链的作用是监控扩增标记和杂交、以及显色系统是否有效；阴性质控探针的作用是杂交过程中非特异性杂交的监控指标；空白对照为50％dmso,不含寡核苷酸，其作用是芯片制备过程中的污染监控指标。
[0044]
表3微阵列矩阵图
[0045] 1234567891qcqcqcbcbcbcpcpcpc2ncncncoligo1oligo1oligo1oligo2oligo2oligo23oligo3oligo3oligo3oligo4oligo4oligo4oligo5oligo5oligo54oligo6oligo6oligo6oligo7oligo7oligo7oligo8oligo8oligo85oligo9oligo9oligo9oligo10oligo10oligo10oligo11oligo11oligo116oligo12oligo12oligo12oligo13oligo13oligo13oligo14oligo14oligo147oligo15oligo15oligo15oligo16oligo16oligo16oligo17oligo17oligo178oligo18oligo18oligo18oligo19oligo19oligo19ncncnc9pcpcpcbcbcbcqcqcqc
[0046]
qc:quality control；bc:blank control；pc:positive control；nc:negative control
[0047]
表4基因芯片质控探针
[0048][0049]
在杂交盒底部加入一些纯净水，将芯片放入盒子中，盖上滑盖即可使用。杂交液(2хsspe)10μl混合pcr产物10μl在95℃变性3min，立即在冰上冷却3min，杂交在50℃下进行60min，在42℃下用溶液i：15ml ssc+10ml sds+975ml h2o(0.3
×
ssc，0.1％sds)洗涤一次，42℃下用溶液ii：3ml ssc+997ml h2o洗涤两次。
[0050]
用微阵列扫描仪(luxscan10k)扫描阵列，用luxscan10k软件分析荧光信号强度。
[0051]
二、结果与讨论
[0052]
1.通用引物和探针设计
[0053]
尽管在通用引物(如表5所示)中使用了简并碱基，但引物的应用效率和准确率仍然很高。通过pcr获得了所有正确的靶序列。
[0054]
表5 16s rrna通用引物
[0055][0056]
由于有些家系成员在16srdna序列中表现出密切的亲缘关系，在扩增片段的范围内，本研究没有特异性差异可以用来区分寡核苷酸2、3等相似家族的成员。共设计了19个探针(见表6)，包括1个阳性对照探针、10个海洋哺乳动物家族探针(一些家族不止一个探针)，探针长度在21bp到25bp之间，gc含量在40％到65％之间，退火温度在50℃到58℃之间。
[0057]
表6微阵列探针序列
[0058]
nosequence(53
‘
)speciesoligo 1caacccaataaatcaaaacc灰鲸oligo 2caacccaataaatcaaaacc须鲸oligo 3gcataaaataataccaccaaggg海豚虎鲸oligo 4cctaccagccaaagtatagtatcac海豚oligo 5ggttggggtgacctcggagtat海豚oligo 6ttacatgagctgacaatttcgg阳性探针oligo 7aataaaacagtaccacctaagggata江豚oligo 8cacaaaacagcaccaccaaggga白鲸oligo 9atcaacccaataacccacaac抹香鲸oligo 10tcaacccaataacccacaac抹香鲸oligo 11ccaacccaaaaaccacaatct抹香鲸
oligo 12ccaacccaaaaaccacaatct海牛oligo 13ccaccctacgggcttaaccta海牛oligo 14gttcaaccacaaaacataccctac儒艮oligo 15gccacccaacagtttaatgaa儒艮oligo 16tactcaagtcaaccaaaacgggat海狮oligo 17cagtcaaccaacagggaataaa海豹oligo 18ctaagacaaaccagtcaaagtgc海豹oligo 19agagcaaatccagtcaaccaac海豹
[0059]
2.目标物种选择和样本采集
[0060]
该微阵列设计用于尽可能多的海洋哺乳动物，共有10个物种的19个探针。但是，由于样品采集困难，我们只采集了5种海洋哺乳动物(见表1)。通过这五个样本，我们可以验证芯片上五种物种探针的效率、特异性和稳定性。对于芯片上其他物种的探针，我们需要收集阳性样本，以便在进一步的研究中进行验证。
[0061]
3.样本dna扩增和测序
[0062]
选择合适的通用引物是微阵列分析的一个基本的步骤。用16srdna通用引物对5种海洋哺乳动物的样本进行了pcr扩增，均扩增出了特异性序列，对扩增片段进行测序，blast进行物种鉴定(表7)。三种鱼粉也被扩增出目标片段并测序，和芯片杂交结果进行验证。blast搜索鱼粉测序结果显示，鱼粉中均无非法添加成分。
[0063]
表7 5种海洋哺乳动物16srdna特异性序列blast结果
[0064][0065]
4.与芯片杂交
[0066]
如图1所示，5种海洋哺乳动物靶向16srdna片段杂交芯片扫描后均显示阳性信号，3份鱼粉样品呈阴性结果，共有2份阴性对照(pcr阴性产物，水)在微阵列的任何探针中均未出现信号。为了检验检测的重复性，不同pcr反应的扩增片段在不同的时间分别和芯片杂交两次。两个重复的杂交结果显示，阳性探针的信号模式十分相似，与相应物种的检测结果一致，显示出良好的特异性和稳定性。
[0067]
对于检测食品或饲料中不合规的海洋哺乳动物成分，该方法具有样品高通量的检测、最小的试剂消耗和同时对多个目标的鉴定的优点。
[0068]
这项研究描述了一个含有19个16srdna探针的dna微阵列的设计，并证明了它的特异性，至少有5个物种(白鲸、海豚、无翅目、海豹、海豹狮子)证实了它们的特异性，其他物种有待进一步收集以产生确定的结果。
[0069]
作为基于dna微阵列检测海产品或饲料中不合规海洋哺乳动物成分的原理证明，用经济上可行的探针设计一个特定属或科的更多物种的dna芯片简单可行。结合快速dna提
取方法，食品和饲料产品的检测可以减少到一天之内。dna微阵列技术在实验室中的应用，可以大大提高质检部门对复合食品和饲料监管的工作效率。
[0070]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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