氨基酸衍生物及其制备方法和应用、一种抗肿瘤胶束及其制备方法与流程

[0001]
本发明涉及抗肿瘤药物技术领域，特别涉及氨基酸衍生物及其制备方法和应用、一种抗肿瘤胶束及其制备方法。


背景技术：

[0002]
恶性肿瘤已成为危害人类健康的主要原因。根据global cancer observatory 2018显示，全球恶性肿瘤新发病例约1808万例，死亡病例约956万例，5年生存率为40.5％。肿瘤的异质性使肿瘤出现侵袭性和耐药性，化疗药物发生耐药和转移是导致多数肿瘤患者治疗失败的重要原因。
[0003]
阿霉素自1969年被发现以来，仍经常被作为处方药使用，对淋巴瘤，肉瘤和各种实体瘤(包括乳腺癌，肺癌，膀胱癌，骨癌和宫颈癌)的具有良好的抗肿瘤活性。其作用机制是诱导氧化应激，嵌入dna中，以及作用于拓扑异构酶ii。但它也存在一定的局限性，临床研究表明，剂量递增不能杀死所有的肿瘤细胞。但是，阿霉素在使用时同样会出现耐药性。这可能是由于剂量反应的剂量的非线性剂量-效应关系或化疗导致肿瘤敏感性降低而产生耐药性。耐阿霉素的癌细胞主要通过改变膜转运而产生的多药耐药性是对蒽环类药物耐药的主要机制，癌细胞利用它来逃避化学疗法的毒性作用。在具有多重耐药性的肿瘤细胞中，主要外排蛋白p-糖蛋白(p-gp)，多药耐药相关蛋白(mrp)，乳腺癌耐药蛋白(bcrp)和肺耐药相关蛋白(lrp)可在细胞表面过度表达，能够识别和排出化疗药物，可降低细胞内药物浓度，降低其有效性，从而导致耐药性。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明的目的在于提供氨基酸衍生物及其制备方法和应用、一种抗肿瘤胶束，本发明提供的氨基酸衍生物具有逆转抗肿瘤药物耐药作用、抗肿瘤细胞迁移作用和抗肿瘤细胞侵袭作用。
[0005]
为了实现上述发明的目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种氨基酸衍生物，包括(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸、(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸或(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸。
[0007]
本发明提供了上述氨基酸衍生物的制备方法，包以下步骤括：
[0008]
(1)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0009]
(2)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行第一脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0010]
(3)第二氨基酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到第二缩合产物；所述第二氨基酸为boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸、boc-phe、boc-trp-oh或boc-his(boc)；
[0011]
(4)所述第二缩合产物与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到第二脱保
护基产物；
[0012]
(5)癸酸与所述第二脱保护基产物进行第三缩合反应，得到第三缩合产物；
[0013]
(6)在密闭h2条件下，所述第三缩合产物在pd/c催化下进行氢解反应，得到氨基酸衍生物。
[0014]
优选的，所述步骤(1)的第一缩合反应体系中还包括edc和hobt；
[0015]
所述步骤(3)的第二缩合反应体系中还包括edc和hobt；
[0016]
所述步骤(5)的第三缩合反应体系中还包括edc和hobt。
[0017]
优选的，所述第一脱保护基反应和第二脱保护基反应在冰浴条件下进行，所述第一脱保护基反应和第二脱保护基反应的时间为6～10h。
[0018]
优选的，所述第一脱保护试剂和第二脱保护试剂独立为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸；所述氯化氢-乙酸乙酯溶液的摩尔浓度为4mol/l。
[0019]
优选的，所述步骤(6)中的氢解反应的温度为室温，时间为6～10h；所述密闭h2的气压优选为1.1～1.3倍大气压。
[0020]
本发明提供了上述方案所述氨基酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用，包括所述氨基酸衍生物和抗肿瘤活性组分。
[0021]
本发明提供了一种抗肿瘤胶束，包括阿霉素和上述方案所述氨基酸衍生物。
[0022]
优选的，所述阿霉素和氨基酸衍生物的质量比为1～30:1。
[0023]
本发明提供了上述抗肿瘤胶束的制备方法，包括以下步骤：
[0024]
(1)将氨基酸衍生物、阿霉素与有机溶剂混合，得到混合液，将所述混合液制成薄膜；
[0025]
(2)将所述薄膜与极性有机溶剂混合，进行第一超声，得到第一超声溶解液；
[0026]
(3)将所述第一超声溶解液与水混合，进行第二超声，得到第二超声溶解液；
[0027]
(4)将所述第二超声溶解液进行冻干，得到抗肿瘤胶束。
[0028]
本发明提供了一种氨基酸衍生物，包括(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸、(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸或(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸。本发明提供的氨基酸衍生物具有羧基脂肪链，能够增加活性药物的入胞性，从而使氨基酸衍生物具有逆转抗肿瘤药物耐药作用和抗肿瘤细胞迁移的作用。同时，本发明提供的氨基酸衍生物具有体外抗血小板聚集活性。
[0029]
本发明提供了上述氨基酸衍生物的制备方法，此法所得氨基酸衍生物的收率较高，且操作简单，易于实现工业化批量生产。
[0030]
本发明提供了一种抗肿瘤胶束，包括上述方案所述氨基酸衍生物和阿霉素。此胶束具有良好的抗肿瘤、抗迁移和抗侵袭以及逆转耐药作用。
[0031]
本发明提供了上述抗肿瘤胶束的制备方法，此法操作简单，易于实现工业化批量生产。
附图说明
[0032]
图1为性能测试1中化合物1和胶束3的粒径变化图；
[0033]
图2为性能测试1中化合物1和胶束3的zeta电位图；
[0034]
图3为性能测试1中化合物1和胶束3的丁达尔效应图；
[0035]
图4为性能测试1中化合物1和胶束3的透射电镜图；
[0036]
图5为性能测试1中化合物1的扫描电镜图；
[0037]
图6为性能测试1中化合物1在小鼠血浆中的原子力显微镜图；
[0038]
图7为性能测试1中k562细胞、hct/116细胞检测下不同胶束的ic50值；
[0039]
图8为性能测试1中不同细胞检测下adr与胶束3的ic50值；
[0040]
图9为性能测试1中不同化合物1浓度下正常细胞l02的存活率图；
[0041]
图10为性能测试1(五)中不同入胞抑制剂下胶束3细胞内吞摄取实验的荧光图片；
[0042]
图11为性能测试1(五)中不同入胞抑制剂下细胞的荧光强度比较图；
[0043]
图12为性能测试1(六)中ns组、adr组和胶束3组的肿瘤和脏器质量图以及小鼠的体重变化图；
[0044]
图13为性能测试1(六)中ns组、adr组和胶束3组小鼠体内的尿素酶(ure)浓度；
[0045]
图14为性能测试1(六)中ns组、adr组和胶束3组小鼠的肝脏比；
[0046]
图15为性能测试1(七)中不同药物作用下红细胞的形态；
[0047]
图16为性能测试1(八)中组a的原子力显微镜图；
[0048]
图17为性能测试1(八)中组b的原子力显微镜图；
[0049]
图18为性能测试1(八)中组c的原子力显微镜图；
[0050]
图19为性能测试1(九)中不同受试药物下a549细胞的迁移图片；
[0051]
图20为性能测试1(十)中不同受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性图片；
[0052]
图21为性能测试2(一)中化合物2的粒径大小和zeta电位；
[0053]
图22为性能测试2(一)中化合物2和胶束3的丁达尔效应图；
[0054]
图23为性能测试2(一)中化合物2的透射电镜图；
[0055]
图24为性能测试2(二)中k562细胞检测下不同胶束的ic50值；
[0056]
图25为性能测试2(三)中不同化合物2浓度下正常细胞l02的存活率图；
[0057]
图26为性能测试2(四)中组a的原子力显微镜图；
[0058]
图27为性能测试2(四)中组b的原子力显微镜图；
[0059]
图28为性能测试2(四)中组c的原子力显微镜图；
[0060]
图29为性能测试2(五)中a549细胞拍照结果；
[0061]
图30为性能测试2(五)中a549/tax细胞拍照结果；
[0062]
图31为性能测试2(六)中a549细胞拍照结果；
[0063]
图32为性能测试3(一)中化合物3的粒径大小和zeta电位；
[0064]
图33为性能测试3(一)中化合物3和胶束3的丁达尔效应图；
[0065]
图34为性能测试3(一)中化合物3的透射电镜图；
[0066]
图35为性能测试3(二)中k562细胞检测下不同胶束的ic50值；
[0067]
图36为性能测试3(四)中组a的原子力显微镜图；
[0068]
图37为性能测试3(四)中组b的原子力显微镜图；
[0069]
图38为性能测试3(四)中组c的原子力显微镜图；
[0070]
图39为性能测试3(五)中a549细胞拍照结果；
[0071]
图40为性能测试3(五)中a549/tax细胞拍照结果；
[0072]
图41为性能测试3(六)中a549细胞拍照结果；
[0073]
图42为性能测试4(一)中化合物4的粒径大小和zeta电位；
[0074]
图43为性能测试4(一)中化合物4和胶束3的丁达尔效应图；
[0075]
图44为性能测试4(一)中化合物4的透射电镜图；
[0076]
图45为性能测试4(二)中k562细胞检测下不同胶束的ic50值；
[0077]
图46为性能测试4(三)中不同化合物4浓度下正常细胞l02的存活率图
[0078]
图47为性能测试4(四)中组a的原子力显微镜图；
[0079]
图48为性能测试4(四)中组b的原子力显微镜图；
[0080]
图49为性能测试4(四)中组c的原子力显微镜图；
[0081]
图50为性能测试4(五)中a549细胞拍照结果；
[0082]
图51为性能测试4(五)中a549/tax细胞拍照结果；
[0083]
图52为性能测试4(六)中a549细胞拍照结果。
具体实施方式
[0084]
本发明提供了一种包括结构式如式i所示的(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸；
[0085]
结构式如式ii所示的(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸；
[0086]
结构式如式iii所示的(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸；
[0087]
和结构式如式iv所示的(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸；
[0088][0089]
在本发明中，上述氨基酸衍生物具有羧基脂肪链，能够增加入胞性，从而使氨基酸衍生物具有逆转抗肿瘤药物耐药作用和抗肿瘤细胞迁移作用。同时，本发明提供的氨基酸衍生物具有体外抗血小板聚集活性。
[0090]
本发明提供了所述氨基酸衍生物的制备方法，包括以下步骤：
[0091]
(1)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0092]
(2)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行第一脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0093]
(3)第二氨基酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到第二缩合产物；所述第二氨基酸为boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸、boc-phe、boc-trp-oh或boc-his(boc)；
[0094]
(4)所述第二缩合产物与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到第二脱保护基产物；
[0095]
(5)癸酸与所述第二脱保护基产物进行第三缩合反应，得到第三缩合产物；
[0096]
(6)在密闭h2条件下，所述第三缩合产物在pd/c催化下进行氢解反应，得到氨基酸衍生物。
[0097]
在本发明中，当所述第二氨基酸为boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸时，所得氨基酸衍生物为(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸，所述s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备方法，包括以下步骤：
[0098]
(1)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0099]
(2)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行第一脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0100]
(3)boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0101]
(4)所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0102]
(5)癸酸与所述hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0103]
(6)在流动h2条件下，所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。
[0104]
在本发明中，l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl。在本发明中，第一缩合反应体系中还优选包括edc和hobt，所述boc-leu、edc、hobt和l-val-obzl的摩尔比优选为1:1:1:1.1。在本发明中，所述第一缩合反应体系的ph值优选为9。在本发明中，所述第一缩合反应在极性有机溶剂中进行，所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。
[0105]
本发明优选先将boc-leu、edc(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐)、hobt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入l-val-obzl，调节ph值至8～10，进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中，所述活化的时间优选为20～30min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯来活化羧基。在本发明中，所述调节ph值的ph值调节剂优选为n-甲基吗啡啉(nmm)；本发明通过调节ph值，能够使氨基游离。
[0106]
所述第一缩合反应的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
[0107]
在第一缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0108]
所述第一缩合反应后，本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0109]
将所述第一缩合反应液依次进行去除极性有机溶剂、萃取分离、洗涤有机相、干燥和柱层析分离，得到boc-leu-val-obzl纯品。
[0110]
本发明优选使用旋转蒸发仪去除极性有机溶剂。
[0111]
在本发明中，所述萃取分离优选包括以下步骤：向所述去除有机溶剂后的第一缩合反应液中加入乙酸乙酯，进行超声混合，之后加入蒸馏水，得到上层油相和下层水相，通过分液漏斗分离出去下层水相。
[0112]
在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选依次为饱和nahco3溶液、饱和nacl溶液、饱和khso4溶液、饱和nacl溶液、饱和nahco3和饱和nacl溶液；每种洗涤剂的洗涤次数优选为3次。
[0113]
在本发明中，所述干燥优选包括以下步骤：向洗涤后的油相中加入干燥剂进行干燥，之后过滤除去干燥剂，所得滤液进行蒸干。在本发明中，所述干燥剂优选为无水na2so4，所述干燥剂干燥的时间优选为2～10h，更优选为4～8h。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
[0114]
在本发明中，所述柱层析分离的固定相优选为硅胶，流动相优选为乙酸乙酯和石油醚；所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:5。
[0115]
得到所述boc-leu-val-obzl后，本发明将所述boc-leu-val-obzl与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第一脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl。在本发明中，所述第一脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液(tfa)；所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为2～4mol/l，更优选为3mol/l；所述boc-leu-val-obzl的质量与第一脱保护试剂的体积比优选为1g：8～14ml，更优选为1g：10～12ml。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第一脱保护基反应，所述第一脱保护基反应的时间优选为6～10h，更优选为7～8h。
[0116]
在第一脱保护基反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0117]
所述第一脱保护基反应后，本发明优选对所得第一脱保护基反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0118]
对所述第一脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥，得到hcl
·
leu-val-obzl纯品。
[0119]
在本发明中，所述浓缩优选为减压浓缩；本发明对所述减压浓缩没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的减压浓缩方式即可，所浓缩后的状态优选为糖浆状。在本发明中，所述洗涤用洗涤剂优选为无水乙酸乙酯；所述干燥的方式优选为减压抽干。本发明优选重复所述浓缩、洗涤和干燥，所述重复的次数优选为三次。
[0120]
得到所述hcl
·
leu-val-obzl后，本发明将boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述第二缩合反应体系中优选还包括edc和hobt；所述boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸、edc、hobt与hcl
·
leu-val-obzl的摩尔比优选为1:1～1.3:0.2～1:1～1.2，更优选
为1:1:1:1.1。
[0121]
本发明优选先将hcl
·
leu-val-obzl、edc、hobt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸，调节ph值至8～9，进行第二缩合反应，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈。在本发明中，所述活化的时间优选为20min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中，所述调节ph值的ph值调节剂优选为n-甲基吗啡啉(nmm)；所述第二缩合反应的温度优选为室温，时间优选为12h。
[0122]
在第二缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0123]
所述第二缩合反应后，本发明优选对所述第一缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0124]
将所述第二缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
[0125]
在本发明中，所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文中第一缩合反应液的后处理中的操作方式相同，在此不再赘述。
[0126]
得到所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述第二脱保护试剂优选为氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液(tfa)；所述氯化氢-乙酸乙酯溶液或三氟醋酸溶液的摩尔浓度优选为2～4mol/l，更优选为3mol/l。；所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的质量与第二脱保护试剂的体积比优选为1g：8～15ml，更优选为1g：10～12ml。本发明优选在冰浴搅拌的条件下进行所述第二脱保护基反应，所述第二脱保护基反应的时间优选为6～10h，更优选为7～8h。
[0127]
在第二脱保护基反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0128]
所述第二脱保护基反应后，本发明优选对所得第二脱保护基反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0129]
对所述第二脱保护基反应液依次进行浓缩、洗涤和干燥，得到hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。
[0130]
在本发明中，所述浓缩、洗涤和干燥的具体操作方式与上文第一脱保护基反应液后处理中的具体操作方式相同，在此不再赘述。
[0131]
得到所述hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，癸酸与所述hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应，得到(s)-2-癸酰氨
基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，第三缩合反应体系中优选还包括edc和hobt，所述癸酸、edc、hobt和hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯的摩尔比优选为1:1～1.3:0.2～1:1～1.2，更优选为1:1:1:1.1。本发明优选先将癸酸、edc、hobt与极性有机溶剂混合，在冰浴条件下进行活化，得到活化混合液；再向所述活化混合液中加入edc、hobt和hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯，调节ph值至8～9，进行第三缩合反应，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可，具体的如搅拌混合；在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙腈、四氢呋喃或二甲基甲酰胺。在本发明中，所述活化的时间优选为20～30min；本发明通过所述活化，能够生成活泼酯活化羧基组分。在本发明中，所述调节ph值的ph值调节剂优选为n-甲基吗啡啉(nmm)；本发明通过调节ph值，能够使氨基游离。
[0132]
在本发明中，所述第三缩合反应的温度优选为20～35℃，更优选为25～30℃；时间优选为12～24h，更优选为16～20h。
[0133]
在第三缩合反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0134]
所述第三缩合反应后，本发明优选对所述第三缩合反应液进行后处理，所述后处理优选包括以下步骤：
[0135]
将所述第三缩合反应液依次进行去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯纯品。在本发明中，所述去除有机溶剂、萃取分离、洗涤、干燥和柱层析分离的具体操作方式与上文对第一缩合反应液后处理的具体操作方式相同，在此不再赘述。
[0136]
得到所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯后，在密闭h2条件下，所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸。在进行氢解反应前，本发明优选使用极性溶剂将所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解；所述极性有机溶剂优选为四氢呋喃。本发明对所述极性有机溶剂的用量没有特殊的要求，能够将所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯溶解即可；所述溶解的温度优选为35～40℃，更优选为36～38℃。
[0137]
在本发明中，所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与pd/c的质量比优选为10:1。在本发明中，所述氢解反应的温度优选为室温，时间优选为6～12h；所述氢解反应时h2的气压优选为1.1～1.4倍大气压。
[0138]
在氢解反应的过程中，本发明优选通过薄层色谱(tlc)监测反应的进行，当原料点消失时反应终止。在本发明中，所述薄层色谱的流动相优选为乙酸乙酯和石油醚，所述乙酸乙酯和石油醚的体积比优选为1:2；在本发明中，所述薄层色谱分析时的rf值优选为0.3。
[0139]
所述氢解反应后，本发明优选对所述氢解反应液依次进行过滤和蒸干，得到(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸纯品。本发明对所述过滤的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的过滤方式即可；本发明通过所述过滤，除去所述氢解反
应液中的pd/c催化剂。本发明优选使用旋转蒸发仪进行所述蒸干。
[0140]
在本发明中，所述(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式a所示。
[0141][0142]
在本发明中，当所述第二氨基酸为boc-phe时，所得氨基酸衍生物为(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸；所述(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备方法，包括以下步骤：
[0143]
(a)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0144]
(b)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0145]
(c)boc-phe与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0146]
(d)所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
phe-leu-val-obzl；
[0147]
(e)癸酸与所述hcl
·
phe-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0148]
(f)在密闭h2条件下，所述(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸。
[0149]
在本发明中，所述步骤(a)、(b)与步骤(1)、(2)完全相同，在此不再赘述。
[0150]
在本发明中，boc-phe与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，boc-phe与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应的方法以及第二缩合反应液的后处理方法与上文步骤(3)中boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸替换为boc-phe，在此不再赘述。
[0151]
在本发明中，所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
phe-leu-val-obzl。在本发明中，所述boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应的方法以及第二脱保护基反应液的后处理方法与上文步骤(4)中boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第二脱保护基反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯，在此不再赘述。
[0152]
在本发明中，癸酸与所述hcl
·
phe-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述癸酸与所述hcl
·
phe-leu-val-obzl进行第三缩合反应的方法以及第三缩合反应液的后处理方法与上文步骤(5)中癸酸与hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为hcl
·
phe-leu-val-obzl，在此不再赘述。
[0153]
在本发明中，在密闭h2条件下，所述(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸。在本发明中，所述(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及氢解反应液的后处理方法与上文步骤(6)中(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及后处理方法相同，区别在于将(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯，在此不再赘述。
[0154]
在本发明中，所述(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式b所示：
[0155][0156]
在本发明中，所述(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备方法包括以下步骤：
[0157]
(i)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0158]
(ii)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0159]
(iii)boc-trp-oh与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-trp-leu-val-obzl；
[0160]
(iv)所述boc-trp-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
trp-leu-val-obzl；
[0161]
(v)癸酸与所述hcl
·
trp-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0162]
(vi)在流动h2条件下，所述(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸。
[0163]
在本发明中，所述步骤(i)、(ii)与步骤(1)、(2)完全相同，在此不再赘述。
[0164]
在本发明中，boc-trp-oh与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-trp-leu-val-obzl。在本发明中，boc-trp-oh与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应
的方法以及第二缩合反应液的后处理方法与上文步骤(3)中boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸替换为boc-trp-oh，在此不再赘述。
[0165]
在本发明中，所述boc-trp-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到hcl
·
trp-leu-val-obzl。在本发明中，所述boc-trp-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应的方法以及第二脱保护基反应液的后处理方法与上文步骤(4)中boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第二脱保护基反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为boc-trp-leu-val-obzl，在此不再赘述。
[0166]
在本发明中，癸酸与所述hcl
·
trp-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，所述癸酸与所述hcl
·
trp-leu-val-obzl进行第三缩合反应的方法以及第三缩合反应液的后处理方法与上文步骤(5)中癸酸与hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为hcl
·
trp-leu-val-obzl，在此不再赘述。
[0167]
在本发明中，在流动h2条件下，所述(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸。在本发明中，所述(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及氢解反应液的后处理方法与上文步骤(6)中(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及后处理方法相同，区别在于将(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯，在此不再赘述。
[0168]
在本发明中，所述(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式c所示：
[0169][0170]
在本发明中，所述(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备方法包括以下步骤：
[0171]
(i)l-val-obzl与boc-leu进行第一缩合反应，得到boc-leu-val-obzl；
[0172]
(ii)所述boc-leu-val-obzl与第一脱保护试剂进行脱保护基反应，得到hcl
·
leu-val-obzl；
[0173]
(iii)boc-his(boc)与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-his(boc)-leu-val-obzl；
[0174]
(iv)所述boc-his(boc)-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到2hcl
·
his-leu-val-obzl；
[0175]
(v)癸酸与所述2hcl
·
his-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-组氨
酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯；
[0176]
(vi)在密闭h2条件下，所述(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸。
[0177]
在本发明中，所述步骤(i)、(ii)与步骤(1)、(2)完全相同，在此不再赘述。
[0178]
在本发明中，boc-his(boc)与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应，得到boc-his(boc)-leu-val-obzl。在本发明中，boc-his(boc)与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应的方法以及第二缩合反应液的后处理方法与上文步骤(3)中boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸与所述hcl
·
leu-val-obzl进行第二缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸替换为boc-his(boc)，在此不再赘述。
[0179]
在本发明中，所述boc-his(boc)-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应，得到2hcl
·
his-leu-val-obzl。在本发明中，所述boc-his(boc)-leu-val-obzl与第二脱保护试剂进行第二脱保护基反应的方法以及第二脱保护基反应液的后处理方法与上文步骤(4)中boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯与氯化氢-乙酸乙酯溶液进行第二脱保护基反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为boc-his(boc)-leu-val-obzl，在此不再赘述。
[0180]
在本发明中，癸酸与所述2hcl
·
his-leu-val-obzl进行第三缩合反应，得到(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯。在本发明中，癸酸与所述2hcl
·
his-leu-val-obzl进行第三缩合反应的方法以及第三缩合反应液的后处理方法与上文步骤(5)中癸酸与hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯进行第三缩合反应的方法及后处理方法相同，区别仅在于将hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为2hcl
·
his-leu-val-obzl，在此不再赘述。
[0181]
在本发明中，在流动h2条件下，所述(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应，得到(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸。在本发明中，所述s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及氢解反应液的后处理方法与上文步骤(6)中(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯在pd/c催化下进行氢解反应的方法及后处理方法相同，区别在于将(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯替换为(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯，在此不再赘述。
[0182]
在本发明中，所述(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备过程如式d所示：
[0183][0184]
本发明提供了上述方案所述氨基酸衍生物或上述方案所述制备方法制备得到的氨基酸衍生物在制备抗肿瘤药物中的应用。在本发明中，所述氨基酸衍生物用于制备抗肿
瘤药物时，具有逆转抗肿瘤药物耐药作用和抗肿瘤细胞迁移作用。
[0185]
本发明提供了一种抗肿瘤胶束，包括阿霉素和上述方案所述氨基酸衍生物。在本发明中，所述阿霉素和氨基酸衍生物的质量比优选为1～30:1，更优选为5～20:1，进一步优选为10～15:1。在本发明中，所述抗肿瘤胶束的形貌为球状颗粒，粒径为150～200nm。在本发明中，所述抗肿瘤胶束具有良好的抗肿瘤、抗迁移和侵袭以及逆转耐药作用。
[0186]
在本发明中，所述抗肿瘤胶束的制备方法优选包括以下步骤：
[0187]
(1)将氨基酸衍生物、阿霉素与有机溶剂混合，得到混合液，将所述混合液制成薄膜；
[0188]
(2)将所述薄膜与极性有机溶剂混合，进行第一超声，得到第一超声溶解液；
[0189]
(3)将所述第一超声溶解液与水混合，进行第二超声，得到第二超声溶解液；
[0190]
(4)将所述第二超声溶解液进行冻干，得到抗肿瘤胶束。
[0191]
本发明将氨基酸衍生物、阿霉素与有机溶剂混合，得到混合液，将所述混合液制成薄膜。本发明对所述混合的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的混合方式即可。在本发明中，所述有机溶剂优选为二氯乙烷；本发明对所述有机溶剂的用量没有特殊的要求，能够将所述氨基酸衍生物和阿霉素完全溶解即可。本发明优选将所述混合液旋转蒸发，制成薄膜；在本发明中，所述旋转蒸发的温度优选为30～40℃，更优选为35℃；时间优选为15～60min，更优选为25～40min；所述旋转蒸发的速率优选为100～300rpm，更优选为150～250rpm。
[0192]
得到所述薄膜后，本发明将所述薄膜与极性有机溶剂混合，进行第一超声，得到第一超声溶解液。在本发明中，所述极性有机溶剂优选为乙醇、甲醇或乙腈。本发明对所述极性有机溶剂的用量没有特殊的要求，能够将所述薄膜完全溶解即可。在本发明中，所述第一超声的功率优选为300～400w，更优选为350w，时间优选为10～30min，更优选为15～25min。本发明通过所述第一超声，能够得到均一的溶液。
[0193]
得到所述第一超声溶解液后，本发明将所述第一超声溶解液与水混合，进行第二超声，得到第二超声溶解液。在本发明中，所述第一超声溶解液与水的体积比优选为1:15～25，更优选为1：20。在本发明中，所述第二超声的功率优选为300～400w，更优选为350w，时间优选为10～30min，更优选为15～25min。本发明通过所述第二超声，能够得到具有丁达尔现象的纳米体系。
[0194]
得到所述第二超声溶解液后，本发明将所述第二超声溶解液进行冻干，得到抗肿瘤胶束。本发明对所述冻干的方式没有特殊的要求，使用本领域技术人员熟知的冻干方式即可。
[0195]
下面结合实施例对本发明提供一种氨基酸衍生物及其制备方法和应用、一种抗肿瘤胶束进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0196]
实施例1(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸的制备(一)制备boc-leu-val-obzl
[0197]
称取1.15g(5mmol)boc-leu、0.96g(5mmol)edc、0.68g(5mmol)hobt，放入搅拌子，加入20ml乙腈，冰浴下活化20min，称取1.35g(5.5mmol)hcl
·
h-val-obzl加入茄瓶中，并加入nmm 2ml调ph至9，室温下反应12小时，tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)，原料点消失终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声
得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液分层。将混合溶液倒入分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3溶液、饱和nacl溶液、饱和khso4溶液、饱和nacl溶液、饱和nahco3溶液、饱和nacl溶液各萃洗3遍。酯层用无水na2so4干燥2小时，利用水泵减压过滤，除去na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚1：5)，得到目标产物，白色蜡状固体，称重1.74g，产率82.86％。
[0198]
esi-ms(m/e):421[m+h]
+
,443[m+na]
+
,mp 88.1～88.5℃；[α]
25d
＝-39.9(c 0.1,ch3oh)。1h-nmr(300mhz,d mso-d6)：δ/ppm。
[0199]
(二)制备hcl
·
leu-val-obzl
[0200]
称取1.74g(4.14mmol)boc-leu-val-obzl于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加17ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4m)，并置干燥管，冰浴搅拌下反应6小时后，tlc监测(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)原料点消失终止反应。反应液在水泵下减压浓缩，残留物加入20ml无水乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体。称重1.35g，产率91.84％。
[0201]
esi-ms(m/e):321[m+h]
+
，mp 125.3-126.5℃；[α]
25d
＝-29.99(c 0.1,ch3oh)。1h-nmr(300mhz,cdcl3)：δ/ppm。
[0202]
(三)制备boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
[0203]
将1.00g(3.17mmol)boc-3-(1-萘基)-l-丙氨酸、0.62g(3.25mmol)edc、0.43g(3.19mmol)hobt于茄瓶中，加入搅拌子加入30ml乙腈，冰浴下活化20min，称取1.35g(3.79mmol)hcl
·
leu-val-obzl加入20ml乙腈溶解于另一茄瓶中，并加入nmm 1ml调ph至9。然后将两反应液混合，反应12小时，tlc(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)监测反应，原料点消失。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各萃洗3遍。用无水na2so4干燥2小时，利用水泵减压过滤除去na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚1：5)，得到目标产物白色固体，称重1.67g，产率85.20％。
[0204]
esi-ms(m/e):618[m+h]
+
，mp 152.9-154.2℃；[α]
25d
＝-59.99(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.15(d,j＝8.04hz,1h),7.88(d,j＝7.53hz,1h),7.78(d,j＝7.86hz,1h),7.54(m,2h),7.37(m,6h),7.28(s,1h),6.52(d,j＝8.19hz,1h),6.37(d,j＝7.35hz,1h),5.18(q,j＝12.21hz,2h),4.52(m,2h),4.41(m,1h),3.66(m,1h),3.47(m,1h),2.19(m,1h),1.95(m,1h),1.38(m,10h),0.90(m,12h)。
[0205]
(四)制备hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
[0206]
向盛有1.67g(2.71mmol)boc-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加16ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4m),并置干燥管，冰浴搅拌下反应6小时后终止反应。tlc监测(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)原料点消失终止反应。用水泵将反应液减压抽干,残留物加入20ml乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体，称重1.45g，产率97.32％。
[0207]
esi-ms(m/e):518[m+h]
+
，mp 209.4-210.6℃；[α]
25d
＝-41.72(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.72(d,j＝8.04hz,1h),8.42(s,4h),8.32(d,j＝7.17hz,
1h),7.94(d,j＝7.41hz,1h),7.84(m,1h),7.56(m,2h),7.35(s,7h),5.10(d,j＝3.27hz,2h),4.50(d,j＝7.47hz,1h),4.17(t,j＝6.30hz,2h),3.47(s,2h),3.34(s,2h),3.17(s,1h),2.50(s,4h),2.10(m,1h),1.61(m,2h),1.38(m,2h),0.92(t,j＝8.58hz,6h),0.84(s,6h)。
[0208]
(五)制备(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯
[0209]
称取0.55g(3.20mmol)癸酸、0.61g(3.20mmol)edc、0.43g(3.20mmol)hobt于茄瓶中，加入搅拌子加入20ml乙腈，冰浴下活化20min；将1.45g(2.62mmol)hcl
·
nh
2-3-(1-萘基)-丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯于另一茄瓶加入20ml乙腈溶解，并加入nmm 1ml调ph至9。将两反应液混合，反应12小时，有白色固体析出，tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)，原料点消失，终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到白色混悬液，加入蒸馏水，不溶解。溶液分层上层为白色乳液，下层溶液澄清。将混合溶液倒入分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各洗3遍。用水泵减压过滤，得到白色固体即为产物，称重1.24g，产率70.86％。
[0210]
esi-ms(m/e):672[m+h]
+
，mp 185.5-187.5℃；[α]
25d
＝-20.99(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.17(d,j＝7.44hz,3h),8.11(d,j＝8.22hz,1h),7.90(d,j＝7.11hz,1h),7.76(d,j＝7.26hz,1h),7.52(m,2h),7.38(s,2h),7.35(s,5h),5.11(d,j＝12.54hz,2h),4.68(m,1h),4.50(m,1h),4.22(t,j＝6.69hz,1h),3.51(m,1h),3.13(m,1h),2.09(m,1h),1.97(t,j＝6.33hz,2h),1.59(m,1h),1.45(m,2h),1.22(m,12h),1.01(s,2h),0.87(m,16h)。
[0211]
(六)制备(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸
[0212]
将1.24g(1.85mmol)(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸苄酯加入30ml四氢呋喃，40℃加热溶解，加入钯碳130mg，使用三通管连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气，然后通入氢气,如此反复3次,确保茄瓶内排除空气布满氢气，室温搅拌6小时,tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：2，rf＝0.3)，原料点消失，终止反应，将钯碳过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，称重0.9g，产率84.11％。
[0213]
esi-ms(m/e):580[m-h]-，mp 77.8-79.8℃；[α]
25d
＝-11.67(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.17(t,j＝7.68hz,2h),7.85(m,2h),7.53(m,1h),7.39(m,1h),4.68(m,1h),4.41(m,1h),4.13(m,1h),3.54(m,1h),3.37(m,1h),3.14(m,1h),2.23(m,1h),2.03(m,2h),1.62(m,1h),1.48(m,3h),1.22(m,14h),1.01(s,1h),0.87(m,15h)。
[0214]
本实施例总产率为30.98％。
[0215]
将(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸与阿霉素制成胶束
[0216]
胶束1：称取5.8mg(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和5.8mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0217]
胶束2：称取29mg(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和5.8mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0218]
胶束3：称取58mg(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和5.8mg阿
霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0219]
胶束4：称取116mg(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和5.8mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0220]
胶束5：称取174mg(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸和5.8mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0221]
性能测试1
[0222]
(一)(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸、抗肿瘤胶束的纳米自主装特性
[0223]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l的(s)-2-癸酰氨基-3-(1-萘基)丙酰基-亮氨酰-缬氨酸(简称化合物1)水溶液和0.1g/l、0.01g/l、0.001g/l的胶束3的水溶液，300w功率下超声30min，连续7天利用纳米粒度仪测量粒径大小，粒径变化图如图1所示；图1中(a)为化合物1的粒径变化图，(b)为胶束3的粒径变化图。化合物1和胶束3的zeta电位图如图2所示。由图1和图2可以看出，化合物1在ph＝7的1
×
10-6
mmol/l的水溶液中粒径相对比较稳定，粒径大小为192
±
26nm；胶束3在中性溶液，ph＝7的条件下更稳定。
[0224]
用激光笔(λ＝650nm)照射装有溶液的玻璃瓶，用水作对照组，观察各组中产生的丁达尔效应，如图3所示。图3中从左到右依次是胶束3(0.01g/l)，化合物1(1
×
10-6
mmol/l)，水。可以看到胶束3和化合物l水溶液均匀，有明显的丁达尔效应。
[0225]
分别取胶束3(0.01g/l)，化合物1(1
×
10-6
mmol/l)滴在铜网上，37℃烘箱中干燥，利用透射电镜观察各水溶液的形态，如图4所示；图4中(a)为化合物1溶液的形貌图，(b)为胶束3溶液的形貌图。由图4可以看出，化合物1在1
×
10-6
mmol/l浓度中形成的纳米颗粒均匀，粒径大小在40nm左右；胶束3在0.01g/l水溶液中形成的纳米颗粒径在200nm左右。
[0226]
利用扫描电镜观察发现化合物1(1
×
10-6
mmol/l)水溶液的形态，结果如图5所示。由图5可以看出，化合物1在1
×
10-6
mmol/l浓度中形成的均匀的纳米立方体，粒径在50～100nm之间。
[0227]
利用原子粒显微镜观察化合物1(1
×
10-6
mmol/l)在小鼠血浆中的纳米形态，结果如图6所示。由图6可以看出，化合物1(1
×
10-6
mmol/l)在小鼠血浆中呈均匀的纳米颗粒，高度为40nm左右。
[0228]
(二)不同胶束逆转耐药的作用
[0229]
1.耐药细胞k562/adr培养
[0230]
(1)细胞复苏：将冻存的细胞在37℃的水浴中快速融化，边融化边摇动，吸出细胞悬液转移至离心管中，并加入10ml完全培养基，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟，去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时，观察细胞生长情况，根据细胞数量进行传代培养。(2)细胞传代：细胞计数达1
×
106个可进行传代，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的
培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。(3)给药培养：将细胞生长状态良好的细胞转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入含有600～800ng/ml阿霉素培养基，转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。细胞生长良好，大量存活，继续传代并给与含有1000ng/ml阿霉素的培养基培养，培养至细胞生长稳定。(4)脱药培养：将含有阿霉素培养基培养的细胞转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入不含有阿霉素的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况，并进行传代，传代后细胞可用于药物评价。
[0231]
2.耐药细胞hct116/adr培养
[0232]
(1)细胞复苏：将冻存的细胞在37℃的水浴中快速融化，边融化边摇动，吸出细胞悬液转移至离心管中，并加入10ml完全培养基，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟，去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时，观察细胞生长情况，根据细胞数量进行传代培养。(2)细胞传代：细胞愈合度在80％以上可进行传代，弃去旧培养，加入2ml的pbs缓冲液冲洗2遍，加入1ml胰酶，放入37℃、5％co2的培养箱中消化2分钟，加入新的完全培养基2ml终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。(3)给药培养：将细胞生长状态良好的细胞传代后8小时，待细胞贴壁后，加入含有200-300ng/ml阿霉素培养基，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。细胞生长良好，大量存活，继续传代并给与含有500ng/ml阿霉素的培养基培养，培养至细胞生长稳定。(4)脱药培养：将含有阿霉素培养基培养的细胞加入1ml胰酶，放入37℃、5％co2的培养箱中消化2分钟，加入新的完全培养基2ml终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。并进行传代，传代后细胞可用于药物评价。
[0233]
3.mtt法评价胶束对耐药肿瘤细胞毒性
[0234]
细胞计数后按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养，为了测试载药胶束对肿瘤细胞的毒性，培养时间6h后加入不同浓度的受试药物(化合物1、阿霉素、胶束1～5)，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5
‰
dmso完全培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μl配置好的mtt溶液(浓度为5mg/ml)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μl的dmso，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于dmso中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用graphpad prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算ic50。实验共重复三次，然后取平均值，所得结果如图7所示，图7中(a)为k562细胞检测下不同胶束的ic50值，(b)为hct/116细胞检测下不同胶束的ic50值。
[0235]
k562细胞测得阿霉素的ic50为0.75
±
0.18，k562/adr细胞测得阿霉素的ic50为73.25
±
7.21，耐药倍数97.67倍。在不同比例化合物1与阿霉素(adr)混合制成的胶束中，随着化合物1比例的增加，逆转耐药倍数不断变化。化合物1与adr10:1混合制成的胶束3阿霉素的ic50最低为5.56
±
0.78，逆转耐药倍数为13.17倍。由此可以看出，本发明提供的氨基酸衍生物具有良好的逆转耐药作用。
[0236]
hct/116细胞测得阿霉素的ic50为0.42
±
0.11，hct/116耐阿霉素细胞测得阿霉素的ic50为8.35
±
0.72，耐药倍数为19.88倍。在不同比例化合物1与adr混合制成的胶束中，随着化合物1比例的增加，逆转耐药倍数不断变化。化合物1与adr10:1混合制成的胶束3阿霉素的ic50最低为1.29
±
0.21，逆转耐药倍数为6.47倍。由此可以看出，本发明提供的氨基酸衍生物具有良好的逆转耐药作用。
[0237]
(三)胶束3对肿瘤细胞的体外抗肿瘤作用
[0238]
1.半悬浮细胞株(s180)培养方法
[0239]
细胞复苏：将冻存的细胞在37℃的水浴中快速融化，边融化边摇动，吸出细胞悬液转移至离心管中，并加入10ml完全培养基，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟，去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时，观察细胞生长情况，根据细胞数量进行传代培养。
[0240]
细胞传代：细胞愈合度在80％以上可进行传代，s180细胞是半悬浮细胞，长时间培养可看到细胞贴壁生长，但用吸管吹打可是细胞悬浮，不需要加胰酶消化。用吸管轻轻吹打，并将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。
[0241]
取对数期生长的s180细胞，细胞计数后按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间6h后加入受试药物(阿霉素、胶束3)，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5
‰
dmso完全培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μl配置好的mtt溶液(浓度为5mg/ml)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μl的dmso，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于dmso中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用graphpadprism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算ic50。实验共重复三次，然后取平均值。所得结果如图8所示。
[0242]
2.贴壁细胞株培养方法
[0243]
细胞复苏：将冻存的细胞在37℃的水浴中快速融化，边融化边摇动，吸出细胞悬液转移至离心管中，并加入10ml完全培养基，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟，去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中，在37℃、5％co2的培养箱中培养24小时，观察细胞生长情况，根据细胞数量进行传代培养。
[0244]
细胞传代：细胞愈合度在80％以上可进行传代，弃去旧培养，加入2ml的pbs缓冲液冲洗2遍，加入1ml胰酶，放入37℃、5％co2的培养箱中消化2分钟，加入新的完全培养基2ml
终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入新的完全培养基转移至t25细胞培养瓶中,在37℃、5％co2的培养箱中培养48小时，观察细胞生长情况。
[0245]
取对数期生长的llc细胞、a549细胞、mcf-7细胞、hepg2细胞，倒出培养瓶中的液体，加入2ml的pbs缓冲液冲洗两次，以便将培养瓶内残留的血清清洗干净，加入1ml胰酶至培养瓶中，加入1ml胰酶，放入37℃、5％co2的培养箱中消化2～3分钟，观察是否为球形流动状，若是则加入新的完全培养基2ml终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，然后再向管中加入新鲜的完全培养基，用灭菌过的枪头吹打均匀。然后进行细胞计数。
[0246]
按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间6h后加入受试药物(阿霉素、胶束3)，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5
‰
dmso完全培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μl配置好的mtt溶液(浓度为5mg/ml)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μl的dmso，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于dmso中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用graphpadprism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算ic50。实验共重复三次，然后取平均值。所得结果如图8所示。
[0247]
由图8可以看出，在s180细胞、llc细胞、a549细胞、mcf-7细胞、hepg2细胞中，胶束3的ic50低于阿霉素的ic50，说明胶束3有体外抗肿瘤的作用。
[0248]
(四)化合物1对正常细胞l02的细胞毒作用
[0249]
取对数期生长的l02细胞，倒出培养瓶中的液体，加入2ml的pbs缓冲液冲洗两次，以便将培养瓶内残留的血清清洗干净，加入1ml胰酶至培养瓶中，加入1ml胰酶，放入37℃、5％co2的培养箱中消化2～3分钟，观察是否为球形流动状，若是则加入新的完全培养基2ml终止消化，用吸管轻轻吹起，将细胞混悬液转移至离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，然后再向管中加入新鲜的完全培养基，用灭菌过的枪头吹打均匀。然后进行细胞计数。
[0250]
按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间6h后加入受试药物(不同浓度的化合物1)，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5
‰
dmso完全培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μl配置好的mtt溶液(浓度为5mg/ml)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μl的dmso，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于dmso中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。所得结果如图9所示。
[0251]
由图9可以看出，化合物1对正常细胞l02无明显毒性。
[0252]
(五)细胞内吞摄取实验
[0253]
使用三种不同的入胞抑制剂(氯丙嗪、甲基-β环糊精和阿米洛)利用激光共聚焦显微镜对胶束3通过内吞进入细胞的途径进行考察，并设置空白对照组进行对比。氯丙嗪通过阻断网格蛋白进行抑制网格蛋白介导的内吞作用，甲基-β环糊精通过移除细胞膜上的胆固醇，破坏小窝蛋白的完整性来抑制小窝蛋白介导的内吞途径。阿米洛利通过抑制na
+
/h
+
交换，抑制巨胞饮作用。
[0254]
将k562/adr细胞1
×
106个接种于激光共聚焦小皿中，加入含有内吞抑制剂的培养基，阿米洛利培养基浓度为50μm、氯丙嗪30μm，甲基-β环糊精浓度为5mm。放置于37℃，含有5％co2的细胞培养箱中进行培养1小时后，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃取培养基，更换含有胶束3(含adr5μm)的培养基并在37℃、5％co2的细胞培养箱中孵育6小时，设置离心机3000转/分钟，离心3分钟去除后弃取培养基，并用pbs洗涤细胞3次，利用激光共聚焦显微镜在激发波长475～485nm，发射波长575～585nm的条件下观察，比较各组荧光强度。所得荧光图片如图10所示，荧光强度比较图如图11所示。
[0255]
由图10和图11可以看出，本发明所述的胶束主要通过阿米洛利相关途径进入细胞。
[0256]
(六)体内抗肿瘤评价
[0257]
采用雄性icr小鼠(体重20
±
2g)，从荷瘤小鼠中获得皮下肿瘤s180腹水肿瘤细胞，每只皮下注射0.2毫升瘤液含1
×
107活瘤细胞，6天后将移植小鼠随机分为3组(每组6只)。每组分别给药为阿霉素2μmol/kg，胶束3为2.2mg/kg(含阿霉素0.4μmol/kg)，ns 0.2ml为阴性对照。尾静脉注射连续给药8天。第14天将icr小鼠安乐死之后，取出肿瘤和脏器称重，并取0.5ml血液离心后取血清测尿素氮。
[0258]
ns组、adr组和胶束3组的肿瘤和脏器质量图及体重变化图如图12所示，图12中(a)为ns组、adr组和胶束3组小鼠的肿瘤和脏器质量图，(b)为ns组、adr组和胶束3组小鼠的体重变化图；ns组、adr组和胶束3组小鼠体内的尿素酶(ure)浓度如图13所示；ns组、adr组和胶束3组小鼠的肝脏比如图14所示。
[0259]
阿霉素和胶束3对s180肿瘤的影响结果见表1。
[0260]
表1阿霉素和胶束3对s180肿瘤的影响结果
[0261][0262]
注：n＝6，经单因素方差分析：a：与ns相比，p＜0.05；b：与ns相比，p＞0.05。
[0263]
由表1可以看出，胶束3组抑制肿瘤的效果与阿霉素组相当，但胶束3组阿霉素用量是阿霉素组的1/5。
[0264]
(七)对红细胞的毒性作用
[0265]
取正常icr雄鼠(体重20
±
2g)新鲜血0.5ml加入抗凝剂(枸橼酸钠3.8％)50μl。一支无菌硅化离心管，先加入与稀释后样本等量的分离液3ml，将所取血液样本加于分离液液
面上，设置离心机2300转/分钟，30min。离心后，轻轻取出离心管，底层为红细胞层。用移液枪轻轻吸出上面液体并弃去，在剩余红细胞层中加入10ml清洗液，轻轻吹匀细胞，设置离心机1000转/分钟，离心10min，弃上清。同法洗涤2次，用生理盐水稀释细胞计数2
×
106/ml，每样本取297μl，各加入化合物1、胶束3和阿霉素3μl，放入37℃的孵箱中孵育30min，固定，滴到硅片中，常温干燥器中晾干，利用原子力显微镜观察红细胞形态，结果如图15所示。由图15可以看出，各组均可以看到中凹圆盘状红细胞，形态未发生改变，未出现红细胞破裂。
[0266]
(八)化合物1体外对血小板的影响
[0267]
取正常健康sd雄性大鼠(体重180～220g)，静悉饲养一天，禁食12小时。称重后，依据大鼠体重按照0.7ml/100g，腹腔注射20％乌拉坦溶液进行麻醉。将麻醉后的大鼠固定在鼠板上，用弯镊将肌肉层分开，在气管的右侧分离动脉，并在动脉下面放两根线，一根在近心端，一根在远心端。远心端的进行结扎，近心端先用动脉夹夹上，用眼科剪在靠近远心端剪口，将取血管插入该动脉，用手术线固定。松开动脉夹，取5ml动脉血，并加入0.5ml 3.8％的枸橼酸钠生理盐水溶液，轻轻混匀，防止出现凝集。设置离心机，4℃下，转速1000r/min，将血液离心10min。用移液枪小心吸取上层血浆于另一个新的15ml离心管中，设置离心机，4℃下，转速3000r/min，离心10min。用移液枪小心吸走上次液体，留取白色沉淀即为未活化血小板。加入4℃生理盐水，轻轻吹打，洗涤血小板，设置离心机，4℃下，转速3000r/min，离心10min，弃上清，重复2次。加入4℃生理盐水至3ml，细胞计数1
×
106/ml。
[0268]
用生理盐水配置化合物浓度为1
×
10-6
m的溶液，花生四烯酸配置成1050μm的溶液。
[0269]
实验分组：
[0270]
组a：290μl血小板生理盐水溶液+10μlns；
[0271]
组b：280μl血小板生理盐水溶液+10μl生理盐水+10μlaa；
[0272]
组c：280μl血小板生理盐水溶液+10μl化合物+10μlaa。
[0273]
组a的原子力显微镜图如图16所示，组b的原子力显微镜图如图17所示，组c的原子力显微镜图如图18所示。
[0274]
由图16～18可以看出，化合物1可显著抑制血小板的活化，抑制血栓形成。
[0275]
(九)化合物及胶束3体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0276]
transwell分上下两室，底层是铺有一层聚碳酸酯膜，该膜上带有可允许细胞通过的微孔。在抗细胞迁移实验中，上室接种肿瘤细胞株并给与不含血清的相应培养基进行细胞培养，下室中加入含有10％胎牛血清的相应培养基，聚碳酸酯膜允许细胞穿过，处于上室的细胞由于缺乏血清培养基，而下室培养基含有血清，在血清的诱导下向富含血清营养成分的下室移动，通过这种方法模拟肿瘤细胞的迁移。穿过膜的细胞通常富集于载膜下表面，经过固定、染色后，在显微镜下选取不同的视野进行计数，利用统计分析比较细胞数量来直接反映受试药物对肿瘤细胞迁移能力的影响。rgd肽是一种含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(arg-gly-asp)序列，可被整合素特异性识别，在细胞黏附，侵袭等过程中发挥调节功能。本实验采用rgds作为阳性对照，评价化合物及胶束3在抗肿瘤细胞迁移的作用。
[0277]
a549细胞属于贴壁依赖型细胞株，具有转移性。取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物，弃去原培养基，加入2ml pbs缓冲液清洗2次后，加入1ml胰酶消化细胞2min，加入含血清培养基终止消化，用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散，将细胞混悬液转移至经过灭
菌的15ml离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入5ml不含血清培养基，混匀后再次离心，弃上清，目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀，利用细胞计数板在显微镜下进行计数，并加入适量不含血清培养基，配成细胞浓度为5
×
105个/ml的细胞悬液。transwell小室上室每孔加入100μl细胞悬液，同时加入受试药物(化合物1、胶束3和阿霉素，浓度见表2)的溶液25μl。下室加入600μl含血清的rpmi-1640培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养8小时。
[0278]
8小时后，从孵箱中取出transwell小室，使用移液枪将上室液体小心吸出，避免破坏transwell的聚碳酸酯膜，并在上室每孔中加入100μlpbs缓冲液进行洗涤，使用移液枪将上室液体小心吸出，用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体，重复此操作3次使上室膜上无细胞残留。使用移液枪将下室液体吸出，并加入600μl4％多聚甲醛，固定上室膜下侧细胞30min，30min后吸除下室4％多聚甲醛，每孔中加入600μl 0.1％的结晶紫染色液，染色15min，15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘，放入盛有蒸馏水的烧杯清洗，重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数，所得结果如图19所示，图19中，a为pbs，b为胶束3(含adr 0.5μm)，c为adr0.5μm，d为rgds20μm，e为胶束3(含adr 1μm)，f为adr 1μm，g：化合物20μm。每孔选取9个视野，每个视野细胞分布均匀且数量基本一致，并利用imagej软件进行计数，所得试药物体外抑制a549细胞迁移结果如表2所示。
[0279]
表2受试药物体外抑制a549细胞迁移结果
[0280][0281]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds 20μm组相比，p>0.05。
[0282]
由表2可以看出，胶束3和化合物1能显著抑制a549细胞的迁移。
[0283]
(十)化合物及胶束3体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0284]
利用transwell小室评价体外抗肿瘤细胞侵袭活性，需要先在transwell小室上室铺一层基质胶，模拟肿瘤细胞发生侵袭时的体内环境。
[0285]
实验方法：
[0286]
1)包被基质胶：将冻存于-20℃冰箱中呈固态的matrigel基质胶置于4℃冰箱过夜，使matrigel基质变成粉红色的液态。取960μl无血清r1640培养基加入240μlmatrigel基质胶，充分混和均匀，加入至transwell小室上室，每孔加100μl，然后transwell小室将37℃，5％co2的细胞孵箱中孵育5h，使基质胶凝固。
[0287]
2)水化基底膜：用移液枪小心吸除上室剩余液体，加入50μl相应无血清培养基，置于37℃，5％co2的细胞孵箱中孵育30min。之后用移液枪小心吸除上室剩余液体。
[0288]
3)接种细胞：取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物，弃去原培养基，加入2ml pbs缓冲液清洗2次后，加入1ml胰酶消化细胞2min，加入含血清培养基终止消化，用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散，将细胞混悬液转移至经过灭菌的15ml离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入5ml不含血清培养基，混匀后再次离心，弃上清，目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀，利用细胞计数板在显微镜下进行计数，并加入适量不含血清培养基，配成细胞浓度为5
×
105个/ml的细胞悬液。transwell小室上室每孔加入100μl细胞悬液，同时加入受试药物的溶液25μl，设置复孔。下室加入600μl含血清的rpmi-1640培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养12小时。
[0289]
4)后处理：使用移液枪将上室液体小心吸出，并在上室每孔中加入100μlpbs缓冲液进行洗涤，使用移液枪将上室液体小心吸出，用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体，重复此操作3次。使用移液枪将下室液体吸出，并加入600μl4％多聚甲醛，固定上室膜下侧细胞30min，30min后吸除下室4％多聚甲醛，每孔中加入600μl 0.1％的结晶紫染色液，染色15min，15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘，放入盛有蒸馏水的烧杯清洗，重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数，所得结果如图20所示，图20中，a为pbs，b为rgds 20μm，c为化合物20μm，d为adr1μm，e为胶束3(含adr1μm)。每孔选取9个视野，每个视野细胞分布均匀且数量基本一致，并利用imagej软件进行计数，所得受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性结果如表3所示。
[0290]
表3受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性
[0291][0292][0293]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与pbs组相比，p>0.05。
[0294]
由表3可以看出，胶束3和化合物1能显著抑制a549细胞的侵袭。
[0295]
实施例2(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备
[0296]
(一)制备boc-leu-val-obzl
[0297]
此处参见实施例1(一)中boc-leu-val-obzl的制备。
[0298]
(二)制备hcl
·
leu-val-obzl
[0299]
此处参见实施例1(二)中hcl
·
leu-val-obzl的制备。
[0300]
(三)制备boc-phe-leu-val-obzl
nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.17(d,j＝8.0hz,1h),7.99(dd,j＝8.4,5.7hz,2h),7.35(d,j＝2.3hz,5h),7.20(m,5h),5.11(d,j＝4.6hz,2h),4.21(m,1h),2.97(dd,j＝13.9,3.9hz,1h),2.70(dd,j＝13.8,10.2hz,1h),2.01(m,3h),1.58(dt,j＝13.1,6.9hz,1h),1.37(dt,j＝24.3,7.3hz,5h),1.21(t,j＝11.7hz,10h),1.06(s,2h),0.85(m,15h)。
[0309]
(六)制备(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸
[0310]
将1.5g(2.42mmol)(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯加入30ml甲醇溶解，加入钯碳200mg，使用三通管连接反应瓶和氢气袋，先用真空水泵抽走反应液中的空气，然后通入氢气，如此反复3次，确保茄瓶内排除空气布满氢气，室温搅拌6小时，tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)，原料点消失，终止反应，将钯碳过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干，称重1.1g，产率85.93％。
[0311]
esi-ms(m/e):530[m-h]-，mp 111.6-112.4℃；[α]
25d
＝-19.9(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.04(dd,j＝18.4,8.3hz,2h),7.88(d,j＝8.5hz,1h),7.21(m,5h),4.50(m,1h),4.41(m,1h)，4.14(dd,j＝8.4,5.6hz,1h)，3.01(m,1h)，2.71(dd,j＝13.9,10.3hz,1h),2.03(dt,j＝23.1,7.0hz,3h),1.63(m,1h)，1.47(t,j＝7.2hz,2h),1.35(q,j＝7.3hz,2h),1.18(m,12h),0.86(m,15h).
13
c nmr(75mhz,dmso-d6):δ/ppm＝172.73,172.03(d,j＝8.7hz),171.24,138.04,129.11,127.87,126.06,57.09,53.60,51.03,40.89,37.33,35.20,31.29,29.96,28.68,25.19,24.10,23.06,22.07,21.71,19.04,17.97,13.92。
[0312]
本实施例总产率为41.43％。
[0313]
将(s)-癸酰-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸与阿霉素制成胶束
[0314]
胶束1：称取1.06mg(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇1ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水10ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0315]
胶束2：称取5.31mg(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇1ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水10ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0316]
胶束3：称取10.62mg(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0317]
胶束4：称取21.24mg(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入20ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0318]
胶束5：称取31.86mg(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入20ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0319]
性能测试2
[0320]
(一)(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸及其抗肿瘤胶束的纳米自主装特性
[0321]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l(s)-苯丙氨酰-亮氨酰-缬氨酸(简称化合物2)的水溶液，300w功率下超声30min，连续7天利用纳米粒度
仪测量粒径大小和zeta电位，观察粒径变化。测量结果如图21所示，图21中(a)为化合物2的zeta电位和粒径大小，(b)为粒径变化图。由图21可以看出，化合物2在ph＝7的1
×
10-6
mmol/l的水溶液中粒径相对比较稳定，粒径大小为190nm左右。
[0322]
用激光笔(λ＝650nm)照射装有溶液的玻璃瓶，用水作对照组，观察各组中产生的丁达尔效应，结果如图22所示。图22从左到右依次是胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l的化合物2水溶液，水。可以看到胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l的化合物2水溶液均匀，有明显的丁达尔效应。
[0323]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l化合物水溶液各取7μl滴在铜网上，37℃烘箱中干燥，利用透射电镜观察各水溶液的形态，发现，化合物2在ph＝7.0水溶液在1
×
10-6
mmol/l浓度中形成的纳米颗粒均匀，粒径大小在40nm左右，如图23所示。
[0324]
(二)抗肿瘤胶束的逆转耐药的作用
[0325]
1.耐药细胞k562/adr培养参照性能测试1(二)。
[0326]
2.mtt法评价胶束对耐药肿瘤细胞毒性
[0327]
细胞计数后按照每孔100μl含有5000个细胞种板，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养，培养时间6h后加入药物，每种受试药物设6孔并设置对照孔，对照孔中不给药，只加入含有5
‰
dmso完全培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱培养48小时。48小时后每孔板中加入25μl配置好的mtt溶液(浓度为5mg/ml)，再放置于细胞培养箱中进行培养，培养时间约为4小时，终止培养。取出96孔板，将其放入离心机中进行离心，设置离心机转速为1000rpm，10min。离心后小心取出96孔板，将孔内的培养液吸除干净，再用枪头向每孔中加入150μl的dmso，将96孔板放于摇床上进行震荡摇匀，使结晶物甲臜充分溶解于dmso中。最后，在酶联免疫吸附仪上设置波段为490nm、570nm，测定各孔的吸光度值，与对照组相比计算细胞的存活率。利用graphpad prism5通过对数浓度与细胞存活百分比的线性回归曲线拟合来计算ic50。实验共重复三次，然后取平均值，所得结果如图24所示。
[0328]
k562细胞测得阿霉素的ic50为0.75
±
0.18，k562/adr细胞测得阿霉素的ic50为73.25
±
7.21，耐药倍数97.67倍。在不同比例化合物2与adr混合制成的胶束中，随着化合物比例的增加，逆转耐药倍数不断变化。化合物2与adr20:1混合制成的胶束4阿霉素的ic50最低为5.52
±
0.79，逆转耐药倍数为13.27倍。
[0329]
(三)化合物2对正常细胞l02的细胞毒作用
[0330]
测试方法参照性能测试1(四)，区别在于将受试药物替换成化合物2。所得细胞的存活率结果如图25所示。
[0331]
由图25可以看出，化合物2对正常细胞l02无明显毒性。
[0332]
(四)化合物2体外对血小板的影响
[0333]
测试方法参照性能测试1(八)，区别在于，实验分组：
[0334]
组a：290μl血小板生理盐水溶液+10μlns；
[0335]
组b：280μl血小板生理盐水溶液+10μl生理盐水+10μlaa；
[0336]
组c：280μl血小板生理盐水溶液+10μl化合物2+10μlaa。
[0337]
组a的原子力显微镜图如图26所示，组b的原子力显微镜图如图27所示，组c的原子
力显微镜图如图28所示。
[0338]
由图26～28可以看出，化合物2具有抗血小板聚集的作用。
[0339]
(五)化合物2体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0340]
transwell分上下两室，底层是铺有一层聚碳酸酯膜，该膜上带有可允许细胞通过的微孔。在抗细胞迁移实验中，上室接种肿瘤细胞株并给与不含血清的相应培养基进行细胞培养，下室中加入含有10％胎牛血清的相应培养基，聚碳酸酯膜允许细胞穿过，处于上室的细胞由于缺乏血清培养基，而下室培养基含有血清，在血清的诱导下向富含血清营养成分的下室移动，通过这种方法模拟肿瘤细胞的迁移。穿过膜的细胞通常富集于载膜下表面，经过固定、染色后，在显微镜下选取不同的视野进行计数，利用统计分析比较细胞数量来直接反映受试药物对肿瘤细胞迁移能力的影响。rgd肽是一种含有精氨酸－甘氨酸－天冬氨酸(arg－gly－asp)序列，可被整合素特异性识别，在细胞黏附，侵袭等过程中发挥调节功能。本实验采用rgds作为阳性对照，评价化合物及胶束3在抗肿瘤细胞迁移的作用。
[0341]
a549细胞、a549/tax细胞属于贴壁依赖型细胞株，具有转移性。取对数生长期的细胞，显微镜下观察细胞生长状态良好形态饱满，透明度大，折光性良好，均贴壁且培养液上清透明无漂浮物，弃去原培养基，加入2mlpbs缓冲液清洗2次后，加入1ml胰酶消化细胞2min，加入含血清培养基终止消化，用滴管轻轻吹打使细胞从瓶壁脱落并分散，将细胞混悬液转移至经过灭菌的15ml离心管中，设置离心机1000转/分钟，离心5分钟去除后弃上清，加入5ml不含血清培养基，混匀后再次离心，弃上清，目的是除去残留的含血清的培养基。用滴管轻轻吹打细胞使其分散均匀，利用细胞计数板在显微镜下进行计数，并加入适量不含血清培养基，配成细胞浓度为5
×
105个/ml的细胞悬液。transwell小室上室每孔加入100μl细胞悬液，同时加入受试药物的溶液25μl。下室加入600μl含血清的rpmi-1640培养基，放置于37℃，含有5％co2环境的细胞培养箱中进行培养8小时。
[0342]
8小时后，从孵箱中取出transwell小室，使用移液枪将上室液体小心吸出，避免破坏transwell的聚碳酸酯膜，并在上室每孔中加入100μlpbs缓冲液进行洗涤，使用移液枪将上室液体小心吸出，用蓬松的棉签轻轻擦去残留的液体，重复此操作3次使上室膜上无细胞残留。使用移液枪将下室液体吸出，并加入600μl4％多聚甲醛，固定上室膜下侧细胞30min，30min后吸除下室4％多聚甲醛，每孔中加入600μl 0.1％的结晶紫染色液，染色15min，15min后吸除染色液并用镊子夹住小室边缘，放入盛有蒸馏水的烧杯清洗，重复洗涤3次。置于通风橱晾干后于显微镜下拍照计数，a549细胞拍照结果如图29所示，图29中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物220μm；a549/tax细胞拍照结果如图30所示，图30中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物220μm。每孔选取9个视野，每个视野细胞分布均匀且数量基本一致，并利用imagej软件进行计数，所得受试药物体外抑制a549细胞迁移结果如表4所示，受试药物体外抑制a549/tax细胞迁移结果如表5所示。
[0343]
表4受试药物体外抑制a549细胞迁移结果
obzl加入20ml乙腈溶解于另一茄瓶中，并加入nmm 1ml调ph至9。然后将两反应液混合，反应12小时，tlc(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)监测反应，原料点消失。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各萃洗3遍。用无水na2so4干燥2小时，利用水泵减压过滤，除去无水na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚2：5)，得到目标产物，白色固体，称重2.2g，产率88.00％。
[0365]
esi-ms(m/e):607[m+h]
+
，mp 83.3-84.6℃；[α]
25d
＝-59.9(c＝0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.79(s,1h),8.20(d,j＝8.1hz,1h),7.92(d,j＝8.2hz,1h),7.58(d,j＝7.8hz,1h),7.36(m,7h),7.0(m,3h),6.79(d,j＝8.4hz,1h),5.14(m,2h),4.48(d,j＝7.6hz,1h),4.21(m,2h),3.17(d,j＝5.2hz,1h),3.04(d,j＝14.6hz,1h),2.88(s,1h),2.07(q,j＝6.5hz,1h),1.99(s,1h),1.61(s,1h),1.29(s,9h),1.15(s,2h),0.87(m,12h)。
[0366]
(四)制备hcl
·
trp-leu-val-obzl
[0367]
向盛有2.2g(3.62mmol)boc-trp-leu-val-obzl于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加22ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4m),并置干燥管，冰浴搅拌下反应6小时后终止反应。tlc监测(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)原料点消失终止反应。用水泵将反应液减压抽干，残留物加入20ml乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体，称重1.86g，产率94.75％。
[0368]
esi-ms(m/e):507[m+h]
+
，mp 117.7-119.3℃；[α]
25d
＝-30.7(c＝0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.77(s,1h),8.05(m,3h),7.59(d,j＝7.8hz,1h),7.32(d,j＝18.0hz,6h),7.04(m,3h),5.09(m,2h),4.54(q,j＝8.4hz,1h),4.41(q,j＝7.7hz,1h),4.22(m,1h),3.08(dd,j＝14.7,4.2hz,1h),2.87(dd,j＝14.7,9.4hz,1h),2.06(p,j＝6.8hz,1h),1.75(s,3h),1.57(dt,j＝13.1,6.6hz,1h),1.43(t,j＝7.3hz,2h),1.24(s,2h),0.85(m,12h)。
[0369]
(五)制备(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯
[0370]
称取0.71g(4.12mmol)癸酸、0.79g(4.12mmol)edc、0.56g(4.12mmol)hobt于茄瓶中，加入搅拌子加入20ml乙腈，冰浴下活化20min；将1.86g(3.43mmol)hcl
·
trp-leu-val-obzl于另一茄瓶加入20ml乙腈溶解，并加入nmm 1ml调ph至9。将两反应液混合，反应12小时，溶液浑浊，tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.5)，原料点消失，终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入蒸馏水，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各萃洗3遍。用无水na2so4干燥2小时，利用水泵减压过滤，除去无水na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚2：5)，得到目标产物，白色固体，称重，称重1.8g，产率79.65％。
[0371]
esi-ms(m/e):695[m+cl]-，mp 155.5-156.5℃；[α]
25d
＝-41.27(c＝0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.76(s,1h),8.12(d,j＝8.0hz,1h),7.96(dd,j＝20.6,
8.2hz,2h),7.58(d,j＝7.8hz,1h),7.36(m,6h),7.13
–
6.89(m,3h),5.11(d,j＝5.2hz,2h),4.55(q,j＝8.4hz,1h),4.43(q,j＝7.7hz,1h),4.22(dd,j＝8.0,6.1hz,1h),3.08(dd,j＝14.7,4.3hz,1h),2.87(dd,j＝14.8,9.5hz,1h),2.02(ddt,j＝14.2,10.2,7.0hz,3h),1.39(dt,j＝21.3,7.1hz,4h),1.21(s,6h),1.17(s,3h),0.85(ddt,j＝12.2,8.6,4.8hz,15h)；1c nmr(75mhz,dmso-d6):δ/ppm＝172.19(d,j＝16.8hz),171.53,171.12,136.01,128.19(d,j＝26.6hz),127.34,123.49,120.73,118.42,118.06,111.19,110.18,65.87,57.46,53.12,50.74,47.49,40.92,35.24,33.35,31.29,29.82,28.68,27.50,25.24,24.46,24.03,23.03,22.09,21.72,18.89,18.18,13.96。
[0372]
(六)制备(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸
[0373]
将1.8g(2.73mmol)(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯加入30ml甲醇溶解，加入钯碳200mg，使用三通管连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气，然后通入氢气，如此反复3次，确保茄瓶内排除空气布满氢气，室温搅拌6小时，tlc监测反应(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)，原料点消失，终止反应，将钯碳过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干,称重1.4g，产率90.32％。
[0374]
esi-ms(m/e):569[m-h]-，mp 104.2-105.4℃；[α]
25d
＝-39.99(c＝0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝10.77(s,1h)8.07(d,j＝8.2hz,1h),7.96(d,j＝8.2hz,1h),7.84(d,j＝8.5hz,1h),7.59(d,j＝7.8hz,1h),7.30(d,j＝8.0hz,1h),7.04(m,2h),4.55(td,j＝9.1,4.3hz,1h),4.40(q,j＝7.7hz,1h),4.14(dd,j＝8.4,5.6hz,1h),3.34(s,1h),3.09(dd,j＝14.7,4.2hz,1h),2.88(dd,j＝14.8,9.8hz,1h),2.03(m,3h),1.71(m,1h),1.60(q,j＝6.1hz,1h),1.47(t,j＝7.2hz,2h),1.23(m,12h),1.09(s,2h),0.86(m,15h)。
[0375]
本实施例总产率为49.12％。
[0376]
将(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸与阿霉素制成胶束
[0377]
胶束1：称取1.14mg(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇1ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水10ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0378]
胶束2：称取5.7mg(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0379]
胶束3：称取11.4mg(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0380]
胶束4：称取22.8mg((s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0381]
胶束5：称取34.2mg(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇2ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水20ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0382]
性能测试3
[0383]
(一)(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸及其抗肿瘤胶束的纳米自主装特性
[0384]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l(s)-癸酰-色氨酰-亮氨酰-缬氨酸(简称化合物3)的水溶液，300w功率下超声30min，连续7天利用纳米粒度仪测量粒径大小和zeta电位，观察粒径变化。测量结果如图32所示，图32中(a)为化合物3的zeta电位和粒径大小，(b)为粒径变化图。由图32可以看出，化合物3在ph＝7的1
×
10-6
mmol/l的水溶液中粒径相对比较稳定，粒径大小为192
±
26nm。
[0385]
用激光笔(λ＝650nm)照射装有溶液的玻璃瓶，用水作对照组，观察各组中产生的丁达尔效应，结果如图33所示。图33从左到右依次是胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l的化合物3水溶液，水。可以看到胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l化合物3水溶液均匀，有明显的丁达尔效应。
[0386]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l化合物水溶液各取7μl滴在铜网上，37℃烘箱中干燥，利用透射电镜观察各水溶液的形态，发现，化合物2在ph＝7.0水溶液在1
×
10-6
mmol/l浓度中形成的纳米颗粒均匀，粒径大小在40nm左右，如图34所示。
[0387]
(二)抗肿瘤胶束的逆转耐药的作用
[0388]
1.耐药细胞k562/adr培养参照性能测试1(二)。
[0389]
2.mtt法评价胶束对耐药肿瘤细胞毒性参照性能测试1(二)，区别在于将受试药物替换为实施例3制得的胶束1～5，所得ic50值的结果如图35所示。
[0390]
由图35可以看出，k562细胞测得阿霉素的ic50为0.75
±
0.18，k562/adr细胞测得阿霉素的ic50为73.25
±
7.21，耐药倍数97.67倍。在不同比例化合物3与adr混合制成的胶束中，随着化合物3比例的增加，逆转耐药倍数不断变化化合物3与adr以20:1混合制成的胶束3阿霉素的ic50最低为5.62
±
0.39，逆转耐药倍数为13.03倍。
[0391]
(三)化合物3对正常细胞l02的细胞毒作用
[0392]
测试方法参照性能测试1(四)，区别在于将受试药物替换成化合物3。所得细胞的存活率为93％左右。
[0393]
由以上数据可以看出，化合物3对正常细胞l02无明显毒性。
[0394]
(四)化合物3体外对血小板的影响
[0395]
测试方法参照性能测试1(八)，区别在于，实验分组：
[0396]
组a：290μl血小板生理盐水溶液+10μlns；
[0397]
组b：280μl血小板生理盐水溶液+10μl生理盐水+10μlaa；
[0398]
组c：280μl血小板生理盐水溶液+10μl化合物3+10μlaa。
[0399]
组a的原子力显微镜图如图36所示，组b的原子力显微镜图如图37所示，组c的原子力显微镜图如图38所示。
[0400]
由图36～38可以看出，化合物2具有抗血小板聚集的作用。
[0401]
(五)化合物3体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0402]
测试方法参照性能测试2(五)，区别在于，将受试药物的化合物2替换为化合物3，所得a549细胞拍照结果如图39所示，图39中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物320μm；a549/tax细胞拍照结果如图40所示，图40中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物320μm。
[0403]
所得受试药物体外抑制a549细胞迁移结果如表7所示，受试药物体外抑制a549/
tax细胞迁移结果如表8所示。
[0404]
表7受试药物体外抑制a549细胞迁移结果
[0405][0406]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds20μm组相比，p>0.05。
[0407]
表8受试药物体外抑制a549/tax细胞迁移结果
[0408][0409]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds20μm组相比，p>0.05。
[0410]
由表7和表8可以看出，化合物3能显著抑制a549细胞和a549/tax细胞的迁移。
[0411]
(六)化合物3体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0412]
测试方法参见性能测试1(十)，区别在于，将受试药物中的化合物1替换为化合物3。
[0413]
a549细胞拍照结果如图41所示，图31中，a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物3 20μm。受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性如表9所示。
[0414]
表9受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性
[0415][0416]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds组相比，p>0.05。
[0417]
由表9可以看出，化合物3能显著抑制a549细胞的侵袭。
[0418]
实施例4(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸的制备
[0419]
(一)制备boc-leu-val-obzl
[0420]
此处参见实施例1(一)中boc-leu-val-obzl的制备。
[0421]
(二)制备hcl
·
leu-val-obzl
[0422]
此处参见实施例1(二)中hcl
·
leu-val-obzl的制备。
[0423]
(三)制备boc-his(boc)-leu-val-obzl
[0424]
将1.4g(3.94mmol)boc-his(boc)、0.75g(3.93mmol)edc、0.53g(3.93mmol)hobt于茄瓶中，加入搅拌子加入30ml乙腈和四氢呋喃混合溶剂，冰浴下活化20min，称取1.35g
(3.79mmol)hcl
·
leu-val-obzl加入20ml乙腈溶解于另一茄瓶中，并加入nmm 1ml调ph至9。然后将两反应液混合，反应12小时，tlc(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)监测反应，原料点消失。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入乙酸乙酯，超声得到浅黄色混悬液，加入少量蒸馏水，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各萃洗3遍。用无水na2so4干燥2小时，利用水泵减压过滤，除去无水na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用乙酸乙酯和石油醚进行硅胶柱层析分离(乙酸乙酯：石油醚1：2)，得到目标产物，白色固体，称重1.5g，产率60.24％。
[0425]
esi-ms(m/e):658[m+h]
+
，mp 69.5-71.8℃；[α]
25d
＝-39.99(c＝0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝8.14(m,2h),7.80(d,j＝8.3hz,1h),7.35(m,5h),7.18(s,1h),5.12(m,2h),4.39(t,j＝7.5hz,1h),4.19(m,2h),2.77(qd,j＝15.1,7.0hz,2h),2.03(m,1h),1.81(s,1h),1.55(s,9h),1.39(m,2h),1.34(s,9h),1.29(s,1h),0.83(m,12h)。
[0426]
(四)制备2hcl
·
his-leu-val-obzl
[0427]
向盛有1.5g(2.28mmol)boc-his(boc)-leu-val-obzl于茄瓶中，加入搅拌子，冰浴搅拌下缓慢滴加15ml氯化氢-乙酸乙酯溶液(4m)，并置干燥管，冰浴搅拌下反应10小时后终止反应。tlc监测(乙酸乙酯/石油醚1：1，rf＝0.4)原料点消失终止反应。用水泵将反应液减压抽干，残留物加入20ml乙酸乙酯溶解，再减压抽干，重复磨洗3遍，得到白色固体，称重1.1g，产率91.67％。
[0428]
esi-ms(m/e):458[m+h]
+
，mp 116.7-118.3℃；[α]
25d
＝-42.71(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝9.04(d,j＝1.3hz,1h),8.54(d,j＝8.1hz,1h),7.37(m,5h),5.17(s,1h),5.10(dd,j＝12.1,7.8hz,2h),4.31(m,h),4.02(q,j＝7.2hz,1h),3.29(d,j＝6.0hz,2h),2.0(m,2h),1.91(s,2h),1.71(dt,j＝12.5,7.2hz,1h),1.55(s,1h),1.42(dtd,j＝19.8,10.2,5.4hz,2h),1.17(t,j＝7.1hz,1h),0.87(dd,j＝6.6,4.3hz,12h)。
[0429]
(五)制备(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯
[0430]
称取0.43g(2.5mmol)癸酸、0.48g(2.5mmol)edc、0.34g(2.5mmol)hobt于茄瓶中，加入搅拌子加入10ml dnf，冰浴下活化20min；将1.1g(2.08mmol)2hcl
·
phe-leu-val-obzl于另一茄瓶加入10ml dmf溶解，并加入nmm 1ml调ph至9。将两反应液混合，反应12小时，溶液浑浊，tlc监测反应(ch2cl2:ch3oh＝10：1，rf＝0.3)，原料点消失，终止反应。用旋转蒸发仪去除有机溶剂，得到浅黄色粘稠样物，加入蒸馏水分散残留的dmf，超声得到浅黄色混悬液，加入乙酸乙酯萃取，溶液澄清分层。将混合溶液转移至分液漏斗，将下层液体弃去，保留上层乙酸乙酯层，依次用饱和nahco3、饱和nacl、饱和khso4、饱和nacl、饱和nahco3、饱和nacl各萃洗3遍。用无水na2so4干燥2小时,利用水泵减压过滤,除去无水na2so4，滤液用旋转蒸发仪蒸干。用ch2cl2/ch3oh进行硅胶柱层析分离(ch2cl2：ch3oh＝10：1)，得到目标产物，紫外很弱的白色固体，称重0.62g，产率48.82％。
[0431]
esi-ms(m/e):612[m+h]
+
，610[m-h]-mp 155.5-156.5℃；[α]
25d
＝-39.9(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝7.88(dd,j＝23.5,8.0hz,2h),7.35(m,5h),5.12(m,2h),4.45(m,2h),4.20(dd,j＝8.0,6.5hz,1h),2.80(m,2h),2.10(m,3h),1.46(dq,j＝18.8,6.5hz,5h),1.23(dd,j＝6.7,3.7hz,14h),0.84(m,15h)。
[0432]
(六)制备(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸
[0433]
将0.62g(1.01mmol)(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸苄酯加入30ml甲醇溶解，加入钯碳65mg，使用三通管连接反应瓶和氢气袋,先用真空水泵抽走反应液中的空气，然后通入氢气,如此反复3次,确保茄瓶内排除空气布满氢气，室温搅拌6小时，tlc监测反应(ch2cl2/ch3oh＝10：1，rf＝0.3)，原料点消失，终止反应，将钯碳过滤，滤液用旋转蒸发仪蒸干,称重0.48g，产率90.79％。
[0434]
esi-ms(m/e):520[m-h]-，mp 173.7-175.4℃；[α]
25d
＝-60.02(c 0.1,ch3oh)。1h nmr(300mhz,dmso-d6):δ/ppm＝7.94(m,1h),7.52(d,j＝1.1hz,1h),6.74(d,j＝1.1hz,1h),4.47(ddd,j＝7.9,6.6,3.9hz,1h),4.35(ddd,j＝9.0,7.5,4.0hz,1h),4.11(dd,j＝7.2,4.0hz,2h),2.81(m,2h),2.06(dd,j＝8.5,6.5hz,3h),1.50(m,3h),1.42(t,j＝7.3hz,3h),1.22(t,j＝5.2hz,14h),0.84(dd,j＝12.2,6.5hz,15h)。
[0435]
13
c nmr(75mhz,dmso-d6):δ/ppm＝172.64,172.06,170.90,134.42,133.11,117.02,57.14,40.35,35.21,31.26,29.81,29.25,28.74,25.16,24.00,23.11,22.06,21.60,19.07,18.07,13.91。
[0436]
本实施例总产率为18.43％。
[0437]
将(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸制成胶束
[0438]
胶束1：称取1mg(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0439]
胶束2：称取5.2mg(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0440]
胶束3：称取10.4mg(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0441]
胶束4：称取20.8mg(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0442]
胶束5：称取31.2mg(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸和1.16mg阿霉素与200ml茄瓶中，加入10ml二氯甲烷溶解，用旋转蒸发仪制成薄膜，加入乙醇5ml，300w功率下超声30min，加入蒸馏水100ml，400w功率下超声20min，冻干，得到红色疏松粉末。
[0443]
性能测试4
[0444]
(一)(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸及其抗肿瘤胶束的纳米自主装特性
[0445]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l(s)-癸酰-组氨酰-亮氨酰-缬氨酸(简称化合物4)的水溶液，300w功率下超声30min，连续7天利用纳米粒度仪测量粒径大小和zeta电位，观察粒径变化。测量结果如图42所示，图42中(a)为化合物4的zeta电位和粒径大小，(b)为粒径变化图。由图42可以看出，化合物4在ph＝7的1
×
10-6
mmol/l的水溶液中粒径相对比较稳定，粒径大小为180～250nm。
[0446]
用激光笔(λ＝650nm)照射装有溶液的玻璃瓶，用水作对照组，观察各组中产生的
丁达尔效应，结果如图43所示。图43从左到右依次是胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l的化合物4水溶液，水。可以看到胶束3(0.01g/l)，1
×
10-6
mmol/l化合物4水溶液均匀，有明显的丁达尔效应。
[0447]
用ph＝7的蒸馏水配置1
×
10-5
mmol/l、1
×
10-6
mmol/l、1
×
10-7
mmol/l化合物水溶液各取7μl滴在铜网上，37℃烘箱中干燥，利用透射电镜观察各水溶液的形态，发现，化合物4在ph＝7.0水溶液在1
×
10-5
mmol/l浓度中形成的纳米颗粒均匀，粒径大小在40nm左右，如图44所示，图44中(a)和(b)分别为不同放大倍率下的透射电镜图。
[0448]
(二)抗肿瘤胶束的逆转耐药的作用
[0449]
1.耐药细胞k562/adr培养参照性能测试1(二)。
[0450]
2.mtt法评价胶束对耐药肿瘤细胞毒性参照性能测试1(二)，区别在于将受试药物替换为实施例4制得的胶束1～5，所得ic50值的结果如图45所示。
[0451]
由图45可以看出，k562细胞测得阿霉素的ic50为0.75
±
0.18，k562/adr细胞测得阿霉素的ic50为73.25
±
7.21，耐药倍数97.67倍。在不同比例化合物4与adr混合制成的胶束中，随着化合物4比例的增加，逆转耐药倍数不断变化。化合物4与adr20:1混合制成的胶束3阿霉素的ic50最低为9.83
±
0.79，逆转耐药倍数为7.45倍。
[0452]
(三)化合物4对正常细胞l02的细胞毒作用
[0453]
测试方法参照性能测试1(四)，区别在于将受试药物替换成化合物4。所得细胞的存活率如图46所示。
[0454]
由图46可以看出，化合物3对正常细胞l02无明显毒性。
[0455]
(四)化合物4体外对血小板的影响
[0456]
测试方法参照性能测试1(八)，区别在于，实验分组：
[0457]
组a：290μl血小板生理盐水溶液+10μlns；
[0458]
组b：280μl血小板生理盐水溶液+10μl生理盐水+10μlaa；
[0459]
组c：280μl血小板生理盐水溶液+10μl化合物4+10μlaa。
[0460]
组a的原子力显微镜图如图47所示，组b的原子力显微镜图如图48所示，组c的原子力显微镜图如图49所示。
[0461]
由图47～49可以看出，化合物2具有抗血小板聚集的作用。
[0462]
(五)化合物4体外抗肿瘤细胞迁移活性
[0463]
测试方法参照性能测试2(五)，区别在于，将受试药物的化合物2替换为化合物4，所得a549细胞拍照结果如图50所示，图50中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物420μm；a549/tax细胞拍照结果如图51所示，图51中a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物420μm。
[0464]
所得受试药物体外抑制a549细胞迁移结果如表10所示，受试药物体外抑制a549/tax细胞迁移结果如表11所示。
[0465]
表10受试药物体外抑制a549细胞迁移结果
[0466][0467]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds20μm组相比，p>0.05。
[0468]
表11受试药物体外抑制a549/tax细胞迁移结果
[0469][0470]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds20μm组相比，p>0.05。
[0471]
由表10和表11可以看出，化合物4能显著抑制a549细胞和a549/tax细胞的迁移。
[0472]
(六)化合物4体外抗肿瘤细胞侵袭活性
[0473]
测试方法参见性能测试1(十)，区别在于，将受试药物中的化合物1替换为化合物4。
[0474]
a549细胞拍照结果如图52所示，图52中，a为pbs；b为rgds 20μm；c为化合物420μm。受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性如表12所示。
[0475]
表12受试药物体外抑制a549细胞侵袭活性
[0476][0477]
注：n＝9，经过t检验，a：与pbs组相比，p<0.01；b：与rgds组相比，p>0.05。
[0478]
由表12可以看出，化合物4能显著抑制a549细胞的侵袭。
[0479]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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