利用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除PCR污染的方法与流程

利用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除pcr污染的方法
技术领域
[0001]
本发明属于生物技术分子生物学领域，具体涉及一种解决pcr反应体系及其配置液污染的方法。


背景技术：

[0002]
pcr是扩增富集目标dna片段的一种常用的方法，灵敏度极高。但由于环境、耗材、试剂等问题，pcr反应体系(包括pcr配置液)经常会遭到污染，从而出现假阳性结果。近年流行的高通量测序，可以通过测序获得大量序列信息，检测出环境中的痕量微生物。环境中的微生物无处不在，如果没有很好的解决pcr反应体系中残留的微生物基因组dna、以往实验所产生的pcr产物气溶胶等背景核酸污染的方法，会对高通量实验及数据分析造成一定程度的影响，尤其是对通过16s rdna、18s rdna pcr扩增的方法来研究环境中微生物的多样性的实验，这种污染更是无处不在。
[0003]
目前，防止pcr污染的方法中主要是采用ung酶(尿嘧啶-n-糖基化酶)技术和核酸酶降解残留dna。ung酶技术是利用ung酶能够选择性水解含有du的双链或单链dna中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的dna链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而消除存在于pcr体系中的外源dna污染。因此在pcr反应体系中添加dutp，从而扩增得到含有dutp的pcr产物，再进行后继pcr反应时，添加ung酶，孵育，即可除去du而阻止dna聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力，消除由pcr产物引起的污染。该方法的缺点是：dutp不是dna聚合酶的特异性底物，会大大降低pcr的效率；另外，带有du的pcr产物会增加后继分子实验的难度和繁琐程度。
[0004]
benzonase酶是来自serratia marcescens，经基因工程改进的核酸内切酶，是一种常用的、效果较好的核酸内切酶，它能降解所有形式(包括单链，双链，线性和环状)的dna和rna而没有蛋白裂解活性。在除去引物和模板的pcr反应体系中，加入一定浓度的benzonase酶，在适合的温度和时间内，benzonase酶充分发挥酶消化作用，将pcr反应体系内的外源微生物或气溶胶污染的dna去除。但benzonase酶极其稳定难灭活，即使是在95℃处理30min后，经benzonase酶处理后的pcr反应体系中还会存在少量benzonase酶活性，由于benzonase酶具有极高的核酸降解效率，少量benzonase酶的残留，也将导致pcr反应体系的dna模板降解，大大降低后继pcr扩增反应效率，甚至导致反应失败。因此添加常规的benzonase酶处理溶液中残留的核酸污染，其后继benzonase酶的灭活及去除，是非常困难的工作，常使用酚氯仿/异戊醇提取等非常严苛的方法灭活benzonase酶。
[0005]
传统采用常规的benzonase酶添加，降解残留核酸后，采用严苛灭活的方法除去benzonase酶。该方法需要对处理溶液逐一的加入benzonase酶，并逐一的进行灭活处理，很难对较大体积的溶液进行处理；该方法需分批次进行，但分批次处理后溶液间的均一性很难得到有效保证；另外，传统方法也无法实现benzonase酶的重复利用，实验成本高。
[0006]
因此迫切需要研发一种新的高效、稳定、可处理大体积溶液的方法来解决pcr体系(包括pcr配置液)污染的方法。


技术实现要素：

[0007]
本发明所要解决的技术问题在于，提供一种利用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除pcr污染的方法，解决pcr扩增过程中出现的外源微生物dna或pcr产物气溶胶污染问题，且不影响pcr扩增效率，也不会增加后继分子实验的难度和繁琐程度。
[0008]
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
[0009]
一种用磁珠-核酸酶过滤层析柱去除pcr污染的方法，包括如下步骤：
[0010]
(1)选取高载量氨基磁珠silica magnetic beads(-nh2)，产品名称magrose nh2，平均粒径1-300μm，可载基团含量为0～1000μmol/g，磁核材料为fe3o4，壳层为氧化硅材料，加入核酸酶提取液并在戊二醛反应30-300秒使核酸酶的配体经共价偶联结合到微球表面，合成得到磁珠-核酸酶复合体；再将磁珠-核酸酶复合体填装固定在内径10-40mm，长度200-500mm的层析柱中，得到磁珠-核酸酶过滤层析柱；
[0011]
(2)将去除了引物和模板的pcr反应体系以0.05-3ml/min流速循环经过磁珠-核酸酶过滤层析柱，在4-40℃下经核酸酶消化处理5秒～72小时，所述磁珠-核酸酶过滤层析柱中核酸酶的终浓度保持在10-9
u/ml～103u/ml之间；使存在于pcr反应体系中的外源微生物或气溶胶污染的dna消化干净；
[0012]
(3)经过步骤(2)处理后的pcr反应体系在70-98℃维持15秒-72小时，将反应液中残留的核酸酶灭活。
[0013]
其中，去除了引物和模板之前的常规pcr反应体系一般包括：pcr反应缓冲液，dntps，正向引物和反向引物，taq dna聚合酶及模板dna。去除了引物和模板的pcr反应体系包括pcr反应缓冲液，dntps，taq dna聚合酶，且不含有正向引物、反向引物、模板dna。处理后的pcr反应体系一般包括：pcr反应缓冲液，dntps，taq dna聚合酶。
[0014]
本发明提供解决pcr反应体系及其配置液污染的方法，其中，所述pcr配置液为配置pcr反应缓冲液所需的溶液，包括但不限定于缓冲液母液(常见10倍，5倍或2倍浓度)、超纯水、单独的镁离子溶液、pcr反应增强剂的溶液等。
[0015]
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述核酸酶在过滤层析柱内的终浓度为10-9
u/ml～103u/ml。酶浓度定义为：在30分钟内使
△
260值降低1.0(相当于完全消化37μg dna)的酶量定义为一个活性单位。
[0016]
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)中，所述磁珠-核酸酶过滤层析柱中核酸酶为benzonase、thymonuclease、deoxyribonuclease、aspergillus nuclease、deoxyribonuclease-1等具有类似作用的一种或多种核酸酶混合物。
[0017]
作为本发明优选的技术方案，步骤(2)中，消化处理温度为20-40℃，酶消化处理时间为30-60min。
[0018]
作为本发明优选的技术方案，步骤(3)中，将反应液中核酸酶灭活的温度是70-98℃，灭活处理时间为30-120min。
[0019]
具体的，向所述步骤(3)处理后的pcr反应体系中，添加相应的引物和模板，进行后续的pcr扩增。
[0020]
作为本发明优选的技术方案，所述的pcr污染是指存在于空气的微生物及气溶胶中含有的之前pcr反应中形成的、且与即将获得的pcr扩增产物相同的dna分子。
[0021]
作为本发明优选的技术方案，所述dntps为datp、dgtp、dctp、dttp、dutp任意一种
或五种脱氧核糖三磷酸的混合物。
[0022]
作为本发明优选的技术方案，所述磁珠-核酸酶过滤层析柱中核酸酶的终浓度是10-5
u/ml～102u/ml。
[0023]
具体的，本发明还提供前述方法在普通定性pcr、高通量测序实验、荧光定量pcr中的应用。
[0024]
经过广泛而深入的研究，本发明首次开发了一种在不改变pcr反应体系和pcr产物属性的情况下，利用磁珠-核酸酶过滤层析柱消除外源微生物基因组dna和pcr产物气溶胶对pcr反应体系及其配置液污染的方法。
[0025]
本发明操作简单，效果显著，既可以解决pcr反应体系中的外源微生物和pcr产物气溶胶造成的污染，又可以将处理后的反应体系中的核酸酶消除完全
[0026]
本发明的方法中，由于核酸酶是牢固交联固定在磁珠上，流经过滤层析柱的pcr反应体系中的dna与核酸酶在层析柱中发生反应，处理后的pcr反应体系中不存在或者存在及少量的核酸酶，经过高温灭活处理后，可以将pcr反应体系中的核酸酶完全灭活。
[0027]
本发明的方法中，由于核酸酶是交联固定在磁珠上，核酸酶损耗极小，可以实现磁珠-核酸酶过滤层析柱的重复使用，能降低实验成本。
[0028]
本发明的方法配合蠕动泵，能实现较大体积pcr反应体系在磁珠-核酸酶过滤层析柱中的循环过滤，自动化、高效率、低成本的去除pcr反应体系中的污染，并可根据溶液中核酸残留量的高低，调节蠕动泵流速的高低(较高浓度的核酸残留量，流速低，反应时间长，降解更充分；反之，流速较高，反应时间短)，确保达到较好的处理效果。
[0029]
经实验验证，本发明应用于普通定性pcr、荧光定量pcr时，均能有效减少pcr体系、外源微生物和气溶胶等污染源带来的背景污染。且本发明应用于微生物多样性高通量测序实验中，不仅可以将体系中的背景dna去除，而且处理体系样本与正对照样本得到的物种信息和丰度基本一致，可知经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理pcr体系的方法在高通量测序中有广阔的应用前景。
[0030]
经实验验证，本发明不会影响后续的pcr扩增，克服了ung酶技术大大降低pcr效率的问题，同时pcr反应体系经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理后的pcr反应体系中存在极少量的核酸酶，经过高温灭活处理后，可以将pcr反应体系中的核酸酶完全灭活，既克服了benzonase酶技术中benzonase酶无法完全灭活的问题，磁珠-核酸酶过滤层析柱中的核酸酶可以重复使用，克服了benzonase酶技术中benzonase酶无法实现重复利用的问题，降低了实验成本。
[0031]
本发明的方法选择磁珠-核酸酶过滤层析柱，主要是该过滤层析柱中的核酸酶能降解所有形式(包括单链，双链，线性和环状)的dna和rna而没有蛋白裂解活性，既消除了核酸污染，又不会对dna聚合酶造成影响，且在广泛条件范围具有很高的特异性。并且通过磁珠与核酸酶交联，可以将核酸酶很好的固定在层析柱中，既可以实现核酸酶对pcr反应体系中dna的消化作用，又可以减少核酸酶流入到处理后的pcr反应体系中，实现核酸酶的完全灭活。
附图说明
[0032]
图1是本发明实施例2中16s rdna v3-v4区pcr扩增电泳图。其中a1、a2、a3、a4、a5、a6为样本，b1、b2、b3、b4、b5、b6为其负对照，为去除引物和模板的常规pcr反应体系，其中a1和b1、a2和b2的pcr反应体系不经过任何处理，a3和b3、a4和b4的pcr反应体系经过
benzonase酶处理、a5和b5、a6和b6的pcr反应体系经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理。m为dna marker。
[0033]
图2是本发明实施例2中放置12h后的pcr扩增产物的电泳图。
[0034]
图3为a1、a2、a3、a4、a5、a6、b1、b2、b3、b4、b5、b6中的微生物在门水平的群落结构组成图。
[0035]
图4为a1、a2、a3、a4、a5、a6、b1、b2、b3、b4、b5、b6中的微生物在属水平的群落结构组成图。
[0036]
图5是本发明实施例4中real-time qpcr扩增曲线图。
具体实施方式
[0037]
下面将对本发明型的技术方案进行清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例是本发明型的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明型保护的范围。
[0038]
实施例1利用磁珠-核酸酶过滤层析柱对pcr反应体系进行预处理
[0039]
利用蠕动泵，将去除引物和模板的常规pcr反应体系在合适的温度和时间内以0.05-3ml/min流速循环流经磁珠-核酸酶过滤层析柱，之后将处理好的pcr反应体系在高温下维持一段时间，将反应液中残留的核酸酶灭活。将处理好的pcr反应体系分装在96孔板中，后续的处理在pcr仪中进行。
[0040]
常规pcr反应体系的具体信息参见表1，去除了引物和模板的常规pcr反应体系参见表2，磁珠-核酸酶过滤层析柱所需的处理条件参见表3。
[0041]
表1常规pcr反应体系
[0042]
成分浓度taq dna聚合酶5u10
×
酶缓冲液5μldntps100μmol/l模板dna1ng-100ng正向引物200nm反向引物200nm双蒸水补至50μl
[0043]
表2去除了引物和模板的常规pcr反应体系
[0044][0045]
[0046]
表3磁珠-核酸酶过滤层析柱处理条件
[0047][0048]
如表3所示，具体处理步骤如下：
[0049]
(1)去除了引物和模板的常规pcr反应体系，经过磁珠-核酸酶过滤层析柱的流速为0.05-3ml/min；
[0050]
(2)磁珠-核酸酶过滤层析柱中的核酸酶终浓度为10-5
u/ml～10u2/ml，其在20-40℃下30-60min内可充分发挥酶消化作用，可将存在于pcr反应体系中的外源微生物或气溶胶污染的dna消化干净；
[0051]
(3)经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理后的pcr反应体系在70-98℃下维持30-120min，将反应液中残留的核酸酶灭活；
[0052]
(4)添加正向引物、反向引物和模板dna进行后续的pcr扩增。
[0053]
实施例2：本发明和benzonase酶处理技术分别在普通定性pcr中的应用及评估
[0054]
benzonase酶处理技术为目前常用的一种解决pcr反应体系污染的方法，该处理技术操作可以参照说明书部分。
[0055]
选取样本a，把其随机分为6份，分别为a1、a2、a3、a4、a5、a6；另外选取去除引物和模板的常规pcr反应体系，随机分为6份，分别为b1、b2、b3、b4、b5、b6，作为a1、a2、a3、a4、a5、a6的负对照。其中a1和b1、a2和b2的pcr反应体系不经过任何处理，a3和b3、a4和b4的pcr反应体系经过benzonase酶处理、a5和b5、a6和b6的pcr反应体系经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理。其中磁珠-核酸酶过滤层析柱处理操作可以参照实施例1，benzonase酶处理操作可以参照说明书部分。处理后，加入模板和引物，分别对6样本和6个负对照的16s rdna v3-v4区进行pcr扩增，32个循环，将一部分pcr产物立刻进行电泳检测结果如图1所示。另一部分pcr扩增产物放于4℃冰箱放置12h后，再进行电泳检测，检测结果如图2所示。
[0056]
根据电泳图1结果可见，a1、a2的负对照b1、b2出现明显条带，经benzonase酶处理的a3、a4的负对照b3、b4和经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理的a5、a6的负对照b5、b6检测不到条带。
[0057]
从电泳结果可初步得知，benzonase酶和磁珠-核酸酶过滤层析柱均可以除去体系和气溶胶等污染源带来的背景污染。
[0058]
根据电泳图2结果可知，a1、a2、b1、b2均出现明显条带，经benzonase酶处理的a3、a4条带明显变弱，而经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理的a5、a6的条带跟之前相似。pcr扩增产物在4℃放置12h后，a3、a4的条带变弱说明pcr反应体系经过benzonase酶处理后，及时经过一定时间的高温灭活，benzonase酶依然存在，会对pcr扩增产物造成一定影响。
[0059]
实施例3：本发明在高通量测序实验中的应用
[0060]
选取实施例2中的样本，a1、a2、a3、a4、a5、a6，及其负对照b1、b2、b3、b4、b5、b6(即去除引物和模板的常规pcr反应体系)，其中a1、a2、b1、b2的pcr反应体系均未经过任何处
理，a3、a4、b3、b4的pcr反应体系经过了benzonase酶处理，a5、a6、b5、b6的pcr反应体系经过了磁珠-核酸酶过滤层析柱处理，具体处理措施详见实例1和实例2。对实施例2中的16s rdna v3-v4区pcr扩增产物进行高通量文库构建。之后利用illumina miseq进行高通量测序，之后通过生物信息学分析，得到不同分类水平上物种的种类和相对丰度，图3和图4分别展示了在门和属水平上微生物的群落组成图。
[0061]
由图3、图4可知，a1、a2、a3、a4、a5、a6样本中的微生物种类和相对丰度在门和属水平上基本相似，没有显著性差异，说明benzonase酶和磁珠-核酸酶过滤层析柱处理均不会对样本中微生物群落结构造成影响。但对于负对照来说，b3、b4和b5、b6的微生物的种类在门和属水平上均小于b1、b2的微生物种类，说明benzonase酶和磁珠-核酸酶过滤层析柱可以消除体系中背景污染的部分微生物种类。
[0062]
该实例说明该磁珠-核酸酶过滤层析柱可应用于高通量测序技术中，不影响样本中微生物的群落结构。
[0063]
实施例4：本发明在荧光定量pcr(real-time qpcr)中的应用
[0064]
选取实施例2中的样本，a1、a2、a3、a4、a5、a6，及其负对照b1、b2、b3、b4、b5、b6(即去除引物和模板的常规pcr反应体系)，其中a1、a2、b1、b2的pcr反应体系均未经过任何处理，a3、a4、b3、b4的pcr反应体系经过了benzonase酶处理，a5、a6、b5、b6的pcr反应体系经过了磁珠-核酸酶过滤层析柱处理。具体处理措施详见实施例1和实施例2。对实施例2中的16s rdna v3-v4区进行real-time qpcr扩增。
[0065]
各个样本的定量结果如表4所示，其扩增曲线如图5所示。
[0066]
表4 real-time qpcr ct值
[0067]
samplect值a120.2a220.3a320.48a420.52a520.78a620.83b123.52b223.58b326.88b427.21b530.48b630.51
[0068]
实验结果显示，未处理的样本a1和a2、经过benzonase酶处理的a3和a4、磁珠-核酸酶过滤层析柱处理的样本a5、a6的ct值基本一致，没有显著改变，说明benzonase酶和磁珠-核酸酶过滤层析柱处理均对样本扩增没有显著影响。
[0069]
从表4和图5可以看出，a1、a2、a3、a4、a5、a6均在20个循环开始起峰，未经处理的负对照pcr反应体系b1和b2在23个循环起峰，经过benzonase酶处理的负对照pcr反应体系b3
和b4在27个循环起峰，经过磁珠-核酸酶过滤层析柱处理的负对照pcr反应体系b5、b6在30个循环起峰，说明经过benzonase酶和磁珠-核酸酶过滤层析柱处理能有效去除常规pcr反应体系负对照中外源微生物和气溶胶等污染源带来的背景污染，并且磁珠-核酸酶过滤层析柱处理的效果好于benzonase酶处理。
[0070]
由以上实施例可知，本发明对pcr反应体系的处理方法，可以很好得解决pcr反应体系中外源微生物和气溶胶等造成的污染问题，并且可以解决benzonase酶处理后pcr反应体系中核酸酶无法完全灭活的难题，并且由于磁珠-核酸酶过滤层析柱可以重复使用，解决了benzonase酶无法重复使用的问题，降低了实验成本。
[0071]
综上所述，上述各实施例仅为本发明型的较佳实施例而已，并不用以限定本发明型的保护范围，凡在本发明型的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，皆应包含在本发明型的保护范围内。

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