一种细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法与流程

[0001]
本发明属于细胞技术领域，具体为一种细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法。


背景技术：

[0002]
鳞状上皮细胞癌抗原(scc，squamous cell carcinoma antigen)是一种特异性很好而且是最早用于诊断鳞癌的肿瘤标志物。它最是kato等于1977年从子宫颈鳞状上皮中分离出来的鳞状上皮相关抗原ta-4的亚单位，是一种分子量为48kd的糖蛋白。它包括两个基因scca1和scca2。scca1和scca2有98％的同源性，分别编码92％同源性的中性scca1和酸性scca2糖蛋白，但主要是前者。前者主要存在于非疾病状态下的鳞状上皮，亦或在鳞状细胞癌组织中呈现高表达，后者表达的主要部位在肿瘤周围，同时对于鳞状细胞癌患者，其血清也存在scca2。虽高度同源，但作用有较大差异。scca1针对木瓜蛋白酶起抑制作用，其中蛋白激酶通过影响catl、s、和k(组织蛋白酶)的功能，而scca2是针对糜蛋白酶样蛋白激酶(catg)起抑制作用，对catg介导引起的炎症反应进行抑制。
[0003]
scc广泛存在于不同器官的正常组织中(含量极微)和恶性病变的上皮细胞中。scc在正常的鳞状上皮细胞中抑制细胞调亡和参与鳞状上皮层的分化，在肿瘤细胞中参与肿瘤的生长,它有助于所有鳞状上皮细胞起源癌的诊断和监测，例如：子宫颈癌、肺癌(非小细胞肺癌)、头颈部癌、食管癌以及外阴部鳞状细胞癌等。现在临床上一般多使用酶联免疫吸附试验检测总scc。scc-ag在健康人血清中的质量浓度≤1.5ng/ml。


技术实现要素：

[0004]
本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法。
[0005]
本发明采用的技术方案如下：一种细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法，所述细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法包括以下步骤：
[0006]
s1:先进行单抗4h8的制备；根据genbank上的人scca1和scca2基因以及蛋白序列(登录号：nm_006919.3，np_008850.1，xm_011526138.1，xp_011524440.1)，综合分析二者相对同源的序列，并考虑免疫源性分析，亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选采用scc蛋白序列(seq id no:1)；
[0007]
s2:将scc抗原多肽与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射；
[0008]
s3:采用间接elisa法测定免疫血清效价；取50μg scc抗原多肽溶解于10ml 0.05m ph9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜；
[0009]
s4:用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％bsa 10mm pbs进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37
℃1h，pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次后；
[0010]
s5:同上洗板后，tmb显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2m h2so4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价
[0011]
s6:杂交瘤的制备
[0012]
取血清效价大于1:105的小鼠，融合前3天，取scc抗原多肽与等体积的pbs混匀后，以每只50μg/500μl的量腹腔注射balb/c待融合小鼠进行加强免疫；无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0按1：1的比例混合，1000g室温离心5min，弃上清，
[0013]
s7:用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(peg，mw4000，sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000g室温离心5min，弃上清，加入hat培养液(次黄嘌呤(h)、氨基喋呤(a)和胸腺嘧啶核苷(t)(hat，sigma))轻轻重悬细胞，
[0014]
s8:将细胞分至96孔板中，每孔200μl；培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半hat培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换ht培养液(次黄嘌呤(h)和胸腺嘧啶核苷(t)(ht，sigma))培养；
[0015]
s9:筛选分泌抗scc单克隆抗体的杂交瘤细胞
[0016]
间接elisa法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性
[0017]
s10:腹水的制备和纯化
[0018]
将杂交瘤细胞株4h8以1
×
106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的balb/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水；采用亲和色谱法protein g sepharose fast flow纯化单克隆抗体，以sds-page测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上
[0019]
在一优选的实施方式中，所述步骤s1中，多肽序列为抗原。该多肽序列由bl21(de3)菌株进行蛋白表达，纯化后获得scc抗原多肽。
[0020]
在一优选的实施方式中，所述步骤s2中，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。
[0021]
在一优选的实施方式中，所述步骤s3中，过夜后使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，用10mm pbs含1％bsa封闭液100μl/孔，37℃封闭2h。
[0022]
在一优选的实施方式中，所述步骤s4中，洗板三次后加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg(sigma,inc.)，100μl/孔37℃30min。
[0023]
在一优选的实施方式中，所述步骤s9中，最后获得稳定分泌抗scc单克隆抗体细胞株，标记为4h8；将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存。
[0024]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是：
[0025]
1、本发明中，本发明提供了分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株保藏号为cctcc no：c2019315，其能够稳定分泌高效价的抗鳞状上皮细胞癌抗原的单克隆抗体。用本发明提供的鳞状上皮细胞癌抗原抗体研制的免疫试剂可以精确地测定血清样本中的鳞状上皮细
胞癌抗原，能够同时检测scca1、scca2，具有高灵敏度、准确性，与市场上在售进口试剂检测结果具有高度相关性，可以代替进口抗体，降低了生产成本。
具体实施方式
[0026]
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0027]
一种细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法，所述细胞癌抗原杂交瘤细胞株及其单克隆抗体的应用方法包括以下步骤：
[0028]
s1:先进行单抗4h8的制备；根据genbank上的人scca1和scca2基因以及蛋白序列(登录号：nm_006919.3，np_008850.1，xm_011526138.1，xp_011524440.1)，综合分析二者相对同源的序列，并考虑免疫源性分析，亲疏水性及表面可及性分析，最终筛选采用scc蛋白序列(seq id no:1)，步骤s1中，多肽序列为抗原。该多肽序列由bl21(de3)菌株进行蛋白表达，纯化后获得scc抗原多肽；
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s2:将scc抗原多肽与弗氏完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后，皮下多点注射6-8周龄雌性balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，三周后抗原与弗氏不完全佐剂按1:1混匀500μl乳化后皮下多点注射，步骤s2中，每只小鼠抗原接种剂量为50μg，间隔三周后50μg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次；
[0030]
s3:采用间接elisa法测定免疫血清效价；取50μg scc抗原多肽溶解于10ml 0.05m ph9.6磷酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯96孔板，100μl/孔，4℃过夜，步骤s3中，过夜后使用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，用10mm pbs含1％bsa封闭液100μl/孔，37℃封闭2h；
[0031]
s4:用pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠免疫血清用含1％bsa 10mm pbs进行10-2～10-8倍稀释，加入96孔板，100μl/孔37℃1h，pbs(含有0.05％(v/v)tween-20)洗板三次后，步骤s4中，洗板三次后加入1：10000倍稀释辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠igg(sigma,inc.)，100μl/孔37℃30min；
[0032]
s5:同上洗板后，tmb显色，100μl/孔，室温避光10min，加50μl/孔2m h2so4终止反应，测450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作为阴性对照，以测定值与对照值得比≥2.1为阳性来判断免疫血清的效价
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s6:杂交瘤的制备
[0034]
取血清效价大于1:105的小鼠，融合前3天，取scc抗原多肽与等体积的pbs混匀后，以每只50μg/500μl的量腹腔注射balb/c待融合小鼠进行加强免疫；无菌取小鼠脾脏，制成脾细胞悬液与对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞株sp2/0按1：1的比例混合，1000g室温离心5min，弃上清，
[0035]
s7:用手指轻弹离心管底部，使沉淀松散，离心管置于37℃水浴中，将在37℃水浴保温的50％聚乙二醇(peg，mw4000，sigma)用滴管一滴滴加入离心管中，边滴边摇动离心管，1min内滴完，滴完后静置2min，每隔1min加入37℃预热的无血清1640培养基1ml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml来终止聚乙二醇的作用，细胞混合物1000g室温离心5min，弃上清，加入
hat培养液(次黄嘌呤(h)、氨基喋呤(a)和胸腺嘧啶核苷(t)(hat，sigma))轻轻重悬细胞，
[0036]
s8:将细胞分至96孔板中，每孔200μl；培养三天后，观察细胞融合情况，更换一半hat培养液，连续数日，直至有克隆形成，融合后七天更换ht培养液(次黄嘌呤(h)和胸腺嘧啶核苷(t)(ht，sigma))培养；
[0037]
s9:筛选分泌抗scc单克隆抗体的杂交瘤细胞
[0038]
间接elisa法筛选细胞培养上清，选择效价较高的阳性克隆杂交瘤细胞进行亚克隆化，并用有限稀释法连续克隆化2-3次，直至到100％细胞阳性，步骤s9中，最后获得稳定分泌抗scc单克隆抗体细胞株，标记为4h8；将克隆化后阳性率达100％的细胞扩增培养后液氮冻存
[0039]
s10:腹水的制备和纯化
[0040]
将杂交瘤细胞株4h8以1
×
106/只的量注入液体石蜡预处理的8-10周龄的balb/c雌性小鼠腹腔，饲养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水；采用亲和色谱法protein g sepharose fast flow纯化单克隆抗体，以sds-page测定单克隆抗体的纯度，纯度达到90％以上。
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需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个
……”
限定的要素，并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
[0042]
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

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