联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用的制作方法

[0001]
本发明属于生物化工技术领域，具体地说，涉及一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。


背景技术：

[0002]
1,3-丙二醇是一种重要的二元醇，主要用作单体与对苯二甲酸聚合生产新型的聚酯材料聚对苯二甲酸丙二醇脂(ptt)。1,3-丙二醇可以通过微生物发酵的方法，利用天然的微生物如克雷伯氏肺炎杆菌、丁酸梭菌等将甘油转化成1,3-丙二醇。由于克雷伯氏肺炎杆菌具有甘油代谢速率快、1,3-丙二醇产量高，能够耐受高浓度甘油和1,3-丙二醇，且发酵过程能在有氧条件下进行等特点，目前已被广泛应用于1,3-丙二醇的工业生产。
[0003]
目前利用克雷伯氏肺炎杆菌生产1,3-丙二醇主要存在的问题是发酵过程产生大量的副产物，如2,3-丁二醇，乳酸，丁二酸，乙醇，乙酸等，不但极大降低了1,3-丙二醇的得率同时使得后提取过程变的十分的复杂，极大增加了发酵及后提取过程的成本。因此，提高1,3-丙二醇的得率同时降低副产物的产量，对于降低1,3-丙二醇生产成本具有极其重要的意义。
[0004]
1,3-丁二醇是另外一种具有重要工业应用价值的二元醇，其可以被用作化妆品的溶剂，同时可以用作单体来合成聚酯、聚氨酯及生物增塑剂。同时光学纯的1,3-丁二醇可以用作医药中间体来合成许多药物。但化学法合成的1,3-丁二醇都是外消旋体，无法直接用作医药中间体。因此，利用生物法生产光学纯1,3-丁二醇具有重要应用价值。
[0005]
目前还没有任何报道能够直接利用微生物同时合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。


技术实现要素：

[0006]
本发明的目的是提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌及其应用。
[0007]
本发明构思如下：通过在克雷伯氏菌(如克雷伯氏肺炎杆菌)中引入1,3-丁二醇的生物合成途径，实现了在同一发酵过程同时生产两种具有重要工业价值的二元醇，使得两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。同时由于1,3-丁二醇与2,3-丁二醇竞争代谢底物且二者的分离十分困难，本发明通过阻断2,3-丁二醇的合成途径，完全消除了2,3-丁二醇的合成。本发明进一步通过敲除ldha基因，adhe基因，mdh基因，消除了乳酸、乙醇、丁二酸的合成，使得重组克雷伯氏肺炎杆菌主要合成1,3-丙二醇和1,3-丁二醇两种产物，极大简化了后续提取的过程。
[0008]
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述重组菌是将phaa、phab、bld和yqhd基因通过质粒导入克雷伯氏菌(klebsiella)中或通过基因工程手段整合到克雷伯氏菌染色体上而成。
[0009]
其中，所述phaa基因为乙酰coa酰基转移酶基因，来源于cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(a)或(b)的基因：
[0010]
(a)由seq id no:3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0011]
(b)seq id no:3所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(a)衍生的蛋白质。
[0012]
所述phab基因为3-氧酰基-(酰基载体蛋白)还原酶基因，来源于cupriavidus necator，其为编码如下蛋白质(c)或(d)的基因：
[0013]
(c)由seq id no:4所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014]
(d)seq id no:4所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(c)衍生的蛋白质。
[0015]
所述bld基因来源于clostridium saccharoperbutylacetonicum，其编码蛋白的氨基酸序列如seq id no:1或2所示。
[0016]
所述yqhd基因为醇脱氢酶基因，来源于大肠杆菌(escherichia coli)，其为编码如下蛋白质(e)或(f)的基因：
[0017]
(e)由seq id no:6所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0018]
(f)seq id no:6所示序列经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等功能的由(e)衍生的蛋白质。
[0019]
优选地，所述克雷伯氏菌为克雷伯肺炎杆菌(klebsiella pneumoniae)，更优选保藏号为cgmcc no.7824的克雷伯肺炎杆菌acr30。公众可以通过中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(cgmcc)获得菌株acr30。
[0020]
所述重组菌可按如下方法构建得到：phaa、phab基因经密码子优化后，与bld、yqhd基因一起构建到表达载体上，用重组载体转化克雷伯氏菌，筛选阳性转化子。
[0021]
优选地，密码子优化的phaa-phab操纵子的序列如seq id no:5所示。
[0022]
更优选地，所述重组菌的构建如下：将bld-yqhd-phaab串联基因表达盒构建到ptrc99a质粒上，用重组质粒转化克雷伯氏菌(如acr30)，筛选阳性转化子。
[0023]
其中，bld-yqhd-phaab串联基因表达盒的序列如seq id no:9和10所示。
[0024]
第二方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌，所述联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组菌是以上述重组菌作为出发菌株，利用基因工程手段对出发菌株进行改造，得到的细胞内nadph供给增强的工程菌。
[0025]
优选地，通过增强出发菌株中与nadph生物合成途径相关的基因，来提高细胞内nadph的供给。
[0026]
更优选地，所述与nadph生物合成途径相关的基因为pntab基因，核苷酸序列如下：
[0027]
i)seq id no:7所示的核苷酸序列；
[0028]
ii)seq id no:7所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0029]
iii)在严格条件下与seq id no:7所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0030]
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0031]
本发明中，所述增强的途径选自以下1)～6)，或任选的组合：
[0032]
1)通过导入具有所述基因的质粒而增强；
[0033]
2)通过增加染色体上所述基因的拷贝数而增强；
[0034]
3)通过改变染色体上所述基因的启动子序列而增强；
[0035]
4)通过将强启动子与所述基因可操作地连接而增强；
[0036]
5)通过导入增强子而增强；
[0037]
6)通过使用具有编码高活性的相应酶或蛋白质的基因或等位基因而增强。
[0038]
第三方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的重组克雷伯氏菌，所述重组克雷伯氏菌是以上述重组菌作为出发菌株，通过弱化出发菌株中与2,3-丁二醇合成途径相关的基因，获得的基因弱化菌株。
[0039]
所述与2,3-丁二醇合成途径相关的基因为budrabc基因，核苷酸序列如下：
[0040]
i)seq id no:8所示的核苷酸序列；
[0041]
ii)seq id no:8所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；
[0042]
iii)在严格条件下与seq id no:8所示序列杂交且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列，所述严格条件为在含0.1％sds的0.1
×
sspe或含0.1％sds的0.1
×
ssc溶液中，在65℃下杂交，并用该溶液洗膜；或
[0043]
iv)与i)、ii)或iii)的核苷酸序列具有90％以上同源性且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列。
[0044]
第四方面，本发明提供一种高产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的工程菌，所述工程菌是以上述重组菌，或者上述重组克雷伯氏菌作为原始菌株，通过弱化原始菌株中ldha、adhe、mdh基因中的至少一种基因，获得的基因弱化菌株；所述弱化包括敲除或降低基因的表达。
[0045]
ldha、adhe、mdh基因编码蛋白的氨基酸序列分别如seq id no:11-13所示。
[0046]
优选地，弱化原始菌株中ldha、adhe和mdh基因。
[0047]
本发明中，所述弱化包括敲除或降低相应基因的表达。
[0048]
进一步地，所述弱化是指利用同源重组的方法敲除相应基因。
[0049]
第五方面，本发明提供上述重组菌，或上述重组克雷伯氏菌，或上述工程菌，在发酵联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇中的应用。
[0050]
第六方面，本发明提供一种联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的方法，包括在发酵培养基中对上述重组菌，或上述重组克雷伯氏菌，或上述工程菌进行培养以生产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇。
[0051]
可选地，所述发酵培养基为：甘油20g/l,k2hpo
4 6g/l，kh2po
4 3g/l，nacl 0.5g/l，nh4cl 1g/l，mgso
4 0.5g/l,cacl
2 15mg/l,酵母粉2g/l,氨苄青霉素100mg/l，以水配制。
[0052]
培养条件为：37℃，200rpm，控制溶氧低于10％的饱和溶氧值。
[0053]
利用本发明提供的克雷伯氏菌工程菌，同时实现两种高附加值的二元醇(1,3-丙二醇和1,3-丁二醇)的生产，且两种二元醇相对于底物甘油的得率超过0.6g/g，远远大于单独生产1,3-丙二醇或1,3-丁二醇过程的收率。目标产物分离过程更加简化，从而极大提高整个生产过程的经济效益。
pntab的1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量分别达到7.2g/l和2.8g/l，而其他副产物的产量大大减少。而对照菌株acr30不能合成1,3-丁二醇，其主要产物为1,3-丙二醇和2,3-丁二醇，产量分别为6.8g/l和2.4g/l，同时还生产大量有机酸。
[0065]
表1引入13-丁二醇合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响
[0066][0067][0068]
实施例2敲除2,3-丁二醇合成途径提高1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量
[0069]
上述改造实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，但是同时还是积累了较多的副产物，尤其是2,3-丁二醇与1,3-丁二醇沸点接近，难以分离。为此通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中的2,3-丁二醇合成途径budrabc基因(seq id no:8)，完全消除2,3-丁二醇的合成。
[0070]
以克雷伯氏肺炎杆菌acr30的基因组为模板以bud-up-f(atcgtatgtcttggatttaa)和bud-up-r(taataaaaaaagctctgacatggct cgaagcagctccagcctacagcgccatttt)为引物进行pcr，获得budrabc基因(seq id no:8)上游约1.0kb的dna片段并进行pcr产物纯化。以克雷伯氏肺炎杆菌acr30的基因组为模板以bud-down-f(gtcgacggatccccggaatattccctgtctcttgatcttcgcggcgccagcg)和bud-down-r(aaagcctcgcggtactgttt)为引物进行pcr，获得budrabc基因(seq id no:8)下游约1.0kb的dna片段并进行pcr产物纯化。以质粒pij773(journal of industrial microbiology 39(8):1219-26)为模板，以apr-f(aaaatggcgctgtaggctggagctgcttcg)和apr-r(agagacagggaatattccggggatccgtcgac)为引物进行pcr，获得安普霉素抗性基因约1.4kb的dna片段并进行pcr产物纯化。以上面获得的三段pcr产物进行重叠pcr，获得约3.4kb的dna片段并进行pcr产物纯化。
[0071]
将包含有red重组系统的质粒pdk-red(journal of industrial microbiology 39(8):1219-26)电转入克雷伯氏肺炎杆菌acr30中，获得的菌株命名为acr30/pdk-red。将上述获得的3.4kb重叠pcr产物电转到克雷伯氏肺炎杆菌acr30/pdk-red，在带有50mg/l安普霉素的lb平板上筛选带有抗性的菌株。进一步利用flp酶消除安普霉素抗性，将正确的菌株命名为acr30：δbudrabc。将质粒ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab电转入acr30：δbudrabc，获得的菌株命名为acr30：δbudrabc/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab。将该菌株与对照菌株acr30/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果如表2所示，通过阻断2,3-丁二醇的
合成途径，acr30：δbudrabc/ptrc99a-phaab-bld(l273t)-yqhd-pntab完全不产2,3-丁二醇，同时1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量提高到了7.3g/l和3.2g/l。
[0072]
表2敲除2,3-丁二醇合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响
[0073][0074]
实施例3阻断副产物合成进一步提高1,3-丙二醇和1,3-丁二醇产量
[0075]
上述改造实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，同时完全消除难以分离的2,3-丁二醇的合成，但仍然产生较多的副产物。为此通过敲除克雷伯氏肺炎杆菌中的乳酸合成基因ldha、乙醇合成基因adhe，丁二酸合成基因mdh，极大降低副产物的合成，提高了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量，简化了后提取工艺。
[0076]
利用red重组系统，采用与实施例2相同的方法，以克雷伯氏肺炎杆菌acr30的基因组为模板，分别以引物ldha-up-f(tcacccgggcgatttcacagtc)、ldha-up-r(aagacttttctccagtgattatacc)和ldha-down-f(cgcctttcccttttgtgctcct)、ldha-down-r(tggttcggcaattggcatgtgc)扩增ldha上下游约1000bp片段，以引物adhe-up-f(aattaccaggagcgggggat)、adhe-up-r(ccaacagcgatagcatcgcg)和adhe-down-f(aatgctctcctgataatgtta)、adhe-down-r(cgatgctctcccggaccgccg)扩增adhe上下游约1000bp片段，以引物mdh-up-f(gtcatccccggcgatactgc)、mdh-up-r(cctaaactccttattatggttaatttagg)和mdh-down-f(tctcgccctaacagaagagc)、mdh-down-r(gaagcttaattttccctaatttaggc)扩增mdh上下游约1000bp片段，并分别与实施例2中的安普霉素抗性基因融合，将融合片段电转入acr30：δbudrabc中用于敲除ldha基因，adhe基因，mdh基因，获得重组菌分别命名为acr30：δbudrabcδldha，acr30：δbudrabcδadhe，acr30：δbudrabcδmdh。进一步利用red重组系统同时敲除acr30：δbudrabc中的ldha基因，adhe基因以及mdh基因，获得的重组菌株命名为acr30：δbudrabcδldhaδadheδmdh。将质粒ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab分别电转入上述四株菌株，获得重组菌分别命名为acr30：δbudrabcδldha/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab，acr30：δbudrabcδadhe/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab，acr30：δbudrabcδmdh/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab，acr30：δbudrabcδldhaδadheδmdh/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab将上述四株菌与对照菌株acr30：δbudrabc/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果如表3所示，通过阻断副产物的合成，1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量都获得了提高。acr30：δbudrabcδldhaδadheδmdh/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab的1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的产量提高到了7.5g/l和4.8g/l，两种二元醇的转化率超过0.6g/g甘
油，其他副产物的产量都大大降低，极大简化了分离工艺，具有重要的经济价值。
[0077]
表3阻断副产物合成途径对克雷伯氏肺炎杆菌发酵的影响
[0078][0079]
实施例4利用产酸克雷伯氏菌联产1,3-丙二醇和1,3-丁二醇
[0080]
将实施例1中构建的质粒ptrc99a-bld-yqhd-phaab、ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab、ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab电转入产酸克雷伯氏菌m5al中(购自中国工业微生物菌种保藏中心)，获得的重组菌命名为m5al/ptrc99a-bld-yqhd-phaab、m5al/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab、m5al/ptrc99a-bld(l273t)-yqhd-phaab-pntab。将该菌株与对照菌m5al进行发酵，发酵条件与实施例1相同，48h检测发酵产物的浓度。结果见表4，说明在产酸克雷伯氏菌中引入本发明构建的1,3-丁二醇合成途径，同样实现了1,3-丙二醇和1,3-丁二醇的联产，并降低副产物乳酸、2,3-丁二醇的合成。
[0081]
表4引入1，3-丁二醇合成途径对产酸克雷伯氏菌发酵的影响
[0082][0083]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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