ICOS抗体、基因、载体、宿主细胞和ICOS拮抗剂的制作方法

icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂
技术领域
[0001]
本发明涉及抗体技术领域，特别涉及icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂。


背景技术：

[0002]
t细胞活化除了需要tcr-cd3提供的第一信号，还需要由抗原提呈细胞或者靶细胞表面的共刺激分子与t细胞表面的相应的协同刺激分子受体相互作用而产生的第二信号。icos是cd28家族的第三个成员，属于免疫球蛋白超家族，仅表达于活化的t细胞，故称为诱导共刺激分子(hutloff a.et al.nature,1999,397:263-266.)。其配体icosl(又称为b7h2，gl50)是b7家族成员，与b7-1/b7-2有较高的同源性(ling v.et al.j.immunol,2000,164:1653-1657.)，主要表达于b细胞、单核细胞、apc和内皮细胞表面。研究表明，icos具有正向刺激t细胞作用，可以促进t细胞活化和增殖，ifnγ、tnfα、il2、il4、il13等细胞因子分泌，促进t细胞功能的发挥(hutloff a.et al.nature,1999,397:263-266.dong c.etal.2001,409:97-101.)，促进b细胞分化发育和抗体分泌(dong c,et al.j.immunol,2001,166:3659-3662.)等。
[0003]
越来越多证据表明，抗icos抗体在与免疫检查点抑制剂ctla4阻断剂联合用药，在小鼠肿瘤模型和临床治疗中可以取得良好的抗肿瘤效果。在缺乏icos或icosl的小鼠黑色素瘤肿瘤模型中，抗ctla4抗体的抗肿瘤能力减弱(fut,et al.cancer res.2011,71(16):5445-54.)，而在正常小鼠中，icos信号活化加强了黑素瘤中抗ctla4的抗肿瘤能力(fan x,et al.j exp med.2014,211(4):715-25.)。在临床试验中，观测到在使用ipilimumab(抗ctla4单抗)治疗后，在晚期黑色素瘤和膀胱癌等病人中，cd4t细胞的icos表达上调，且分泌大部分肿瘤特异性ifnγ的cd4t细胞为icos阳性，icos阳性的cd4t持续升高与病人的生存率相关(fan x,et al.j exp med.2014,211(4):715-725.liakou ci,et al.proc natl acad sciusa.2008,105(39):14987-92.)。另一个抗体ctla4抗体tremelimumab在乳腺癌病人的临床试验表明，icos阳性的cd4t细胞与预后相关，icos是ctla4阻断后的免疫活化信号(vonderheide rh,et al.clin cancer res.2010,16(13):3485-94.)。icos信号传导的拮抗剂因此将可用于治疗icos相关性疾病，如癌症。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供了icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂。该icos抗体可特异性的与细胞表面hicos相结合，可作为icos信号传导的拮抗剂。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种icos抗体，该icos抗体的重链包含seq id no：1所示序列的cdr1、seq id no：2所示序列的cdr2、seq id no：3所示序列的cdr3；
[0007]
icos抗体的轻链包含seq id no：4所示序列的cdr4、seq id no：5所示序列的cdr5、seq id no：6所示序列的cdr6。
[0008]
在本发明中，icos抗体的重链与轻链之间由linker连接，linker的氨基酸序列如seq id no：7所示。
[0009]
本发明还提供了一种icos抗体，icos抗体的氨基酸序列如seq id no：8所示。
[0010]
作为优选，icos抗体为人源化抗体。
[0011]
本发明还提供了编码上述icos抗体的基因，其碱基序列如seq id no：9所示。
[0012]
本发明还提供了一种载体，包括编码icos抗体的基因。
[0013]
作为优选，载体所用质粒为pcdna4/myc-hisa。
[0014]
本发明还提供了一种宿主细胞，包括上述载体。
[0015]
作为优选，宿主细胞为hek293细胞。
[0016]
本发明还提供了一种icos抗体的制备方法，包括：将单链抗体scfv基因(seq id no：9所示)及igg1-fc基因融合后经hindiii与ecori双酶切克隆到载体pcdna4/myc-hisa中，进行克隆和质粒小提，提取后的质粒在hek293细胞中表达，通过protein a柱纯化。
[0017]
本发明还提供了一种icos拮抗剂，包括本发明提供的icos抗体。
[0018]
本发明提供了icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂。该icos抗体的重链包含seq id no：1所示序列的cdr1、seq id no：2所示序列的cdr2、seq id no：3所示序列的cdr3；icos抗体的轻链包含seq id no：4所示序列的cdr4、seq id no：5所示序列的cdr5、seq id no：6所示序列的cdr6。本发明具有的技术效果为：
[0019]
本发明的icos抗体可特异性的与细胞表面hicos相结合，可作为icos信号传导的拮抗剂，因此该抗体可用于治疗icos相关性疾病，如癌症。
附图说明
[0020]
图1示抗icos抗体特性鉴定结果，1-1为空白对照，1-2为阴性对照，1-3为anti-hicos scfv抗体与细胞表面hicos相结合的流式细胞图。
具体实施方式
[0021]
本发明公开了icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0022]
本发明提供的icos抗体、基因、载体、宿主细胞和icos拮抗剂中所用试剂、仪器和材料均可由市场购得。
[0023]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0024]
实施例1：重组人icos的表达和egfp细胞制备
[0025]
根据蛋白数据库uniprot上人icos的氨基酸序列(q9y6w8)，得到人icos胞外结构域的氨基酸序列(即q9y6w8中第1位残基至140位残基)；icos的氨基酸序列如下(其中下划线部分为胞外段)：
[0026]
mksglwyfflfclrikvltgeingsanyemfifhnggvqilckypdivqqfkmqllkggqilcdltktkgsgntvsikslkfchsqlsnnsvsfflynldhshanyyfcnlsifdpppfkvtltggylhiyesqlccqlkfwlpig
caafvvvcilgcilicwltkkkysssvhdpngeymfmravntakksrltdvtl
[0027]
其碱基序列如下：
[0028]
atgaagtcaggcctctggtatttctttctcttctgcttgcgcattaaagttttaacaggagaaatcaatggttctgccaattatgagatgtttatatttcacaacggaggtgtacaaattttatgcaaatatcctgacattgtccagcaatttaaaatgcagttgctgaaaggggggcaaatactctgcgatctcactaagacaaaaggaagtggaaacacagtgtccattaagagtctgaaattctgccattctcagttatccaacaacagtgtctctttttttctatacaacttggaccattctcatgccaactattacttctgcaacctatcaatttttgatcctcctccttttaaagtaactcttacaggaggatatttgcatatttatgaatcacaactttgttgccagctgaagttctggttacccataggatgtgcagcctttgttgtagtctgcattttgggatgcatacttatttgttggcttacaaaaaagaagtattcatccagtgtgcacgaccctaacggtgaatacatgttcatgagagcagtgaacacagccaaaaaatctagactcacagatgtgaccctataa
[0029]
根据蛋白数据库uniprot上人免疫球蛋白gamma(γ)1(igg1)的恒定区氨基酸序列(p01857)，得到人igg1-fc的结构域氨基酸序列(即p01857中第104位残基至330位残基)。igg1-fc氨基酸序列如下：
[0030]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0031]
其碱基序列如下：
[0032]
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagctccggaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
[0033]
利用dnaworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码dna序列得到hicos-fc融合蛋白的基因。
[0034]
根据蛋白数据库uniprot上信息得到增强型绿色荧光蛋白egfp氨基酸序列(c5mky7)、人icos的氨基酸序列(q9y6w8)，egfp氨基酸序列如下：mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk
[0035]
其碱基序列如下：
[0036]
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagcc
gctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
[0037]
利用dnaworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码dna序列得到hicos与egfp融合蛋白的基因，hicos-egfp的基因。通过人工合成的方式得到其dna片段。合成好的基因序列分别经fermentas公司的hindiii与ecori双酶切亚克隆到商业化载体pcdna4/myc-hisa(invitrogen,v863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒dna即：pcdna4-hicos-fc和pcdna4-hicos-egfp。
[0038]
将相关的egfp重组质粒转染到hek293(atcc,crl-1573tm)细胞中，转染48h后通过荧光激活信号分选(facs)确认hicos的表达。
[0039]
将pcdna4-hicos-fc瞬时转染至hek293细胞用于蛋白生产。将重组表达质粒用freestyle293培养基稀释并加入转化所需pei(polyethylenimine)溶液，将每组质粒/pei混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％co2，90rpm中培养；培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过proteina亲和层析法，初步纯化得到hicos-fc蛋白样品，用于以下各实施例。得到的蛋白样品利用sds-page进行初步的检测，可以清晰的看到目的条带。
[0040]
实施例2：从酵母展示文库中筛选抗icos抗体、克隆表达
[0041]
采用酵母展示技术筛选针对人icos的全人抗体。通过克隆来自50个健康人的pbmc的igm和igg cdna中的vh和vl基因，构建scfv酵母展示文库(vh和vl中间的连接序列是gilgsggggsggggsggggs连接肽，库容为5
×
108。将10倍库容的酵母库复苏，诱导酵母表面表达抗体，用100nm生物素化的hicos-fc抗原利用磁珠分选的方式富集二次，然后用生物素化的hicos-fc做流式分选再富集两次。得到的酵母涂板，挑取单克隆。单克隆酵母经扩增和诱导表达后用生物素化的hicos-fc染色分析，确定阳性酵母。将经过facs确认的酵母克隆进行酵母菌落pcr和测序，pcr引物为：
[0042]
sequence-f：cgtagaatcgagaccgaggaga；
[0043]
sequence-r：ctggtggtggtggttctgctagc；
[0044]
测序的引物为sequence-r。得到测序结果后用bioedit软件对序列进行比对分析。
[0045]
将上述得到的单链抗体scfv基因及前述的人igg1-fc基因融合后经fermentas公司的hindiii与ecori双酶切克隆到商业化载体pcdna4/myc-hisa中，按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在hek293细胞中瞬时表达，并通过protein a柱纯化。anti-hicosscfv抗体的氨基酸序列如seq id no：8所示(vh-linker-vl，波浪线部分是cdr，下划线是linker)：
[0046]
[0047][0048]
其碱基序列如seq id no：9所示：
[0049]
caggtccagctggtgcagtctggggctgaagtggagaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgtaaggcttctggataccccttcactggctatgctctgcattgggtgcgccaggcccccggacaaaggcttgagtggatgggatggatcacccctggcaatggaaacacaaaatattcacagaagttccagggccgagtcacctttaccagggacacatccgcgagcacagcctacatggagttgagccccctgagacctgaagacacggctgtgtattactgtgcgagagcgctgcgggcatattgtactggtaccaactgctttgggggggcctttgattcctggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcaatcaccctcggtgtcagtggccccaggacagacggccaagattacctgtggaggaaacaatattggaagtaaaagtgtgcactggtatcaacagaggccaggccaggcccctgtggtggtcgtctatgatgatagcgaccggccctcagggatccctgagcgattctctggctccaactctgagaacacggccacccttaccatcagcagggtcgaagccggggatgaggccgactattattgtcaggtgtgggatagtagtagtcatcagggagtgttcggaggaggcacccagctgaccgtcctc
[0050]
实施例3：抗icos抗体特性鉴定(与icos结合鉴定-facs法)
[0051]
取hicos-egfp细胞，重悬于0.5％pbs-bsabuffer中，加入上述纯化后2μg的anti-hicos scfv抗体，同时设置相关对照，阴性对照为2μg的higg1蛋白。二抗为ebioscience的anti-hig-pe。染色完毕后流式细胞仪进行检测。以此方法鉴定能结合细胞表面hicos抗原的抗体。如图1所示，anti-icos19-2-1可以与细胞表面hicos相结合，而阴性对照不能够与细胞表面hicos相结合。
[0052]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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