IL4RA抗体、基因、载体、宿主细胞和IL4RA拮抗剂的制作方法

il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂
技术领域
[0001]
本发明涉及抗体技术领域，特别涉及il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂。


背景技术：

[0002]
il-4(又称为b细胞刺激因子或bsf-1)具有广泛的生物学功能，其可以刺激t细胞，肥大细胞，粒细胞和巨核细胞的活化，同时可以诱导静息状态的b细胞中mhc-ii的表达，并通过刺激b细胞增强ige的分泌(reddy et al.(2000)j.immunol.164:1925-1933)。
[0003]
哮喘是一种呼吸道慢性炎症过敏性疾病，其发病率很高，且目前没有疗效特别好的药物。众所周知，il-4是一种th2型的细胞因子，其生物学活性是由其特定的细胞表面il-4受体介导的。il-4是由th2细胞分泌的细胞因子，其与il-13在过敏性哮喘疾病发展中扮演着重要的角色(zurawski g.et al.,immunol.today,vol.15:19-26(1994))。il-13和il-4这两个细胞因子具有显著的细胞结构相似性，且它们具有各自单独的受体的同时也共有某些受体成分。如il-4和il-13的的双重受体il-4r/il-13ra1，该受体包含il-4ra链和il-13ra1链，其主要表达在造血和非造血细胞上，包含肺上皮和平滑肌细胞。此外，il-4和il-13每个都各具有一个识别它们自己但是不识别另外一个的受体。如il-4的i型受体il-4r，其包含一个il-4ra链和一个常见的γ链，其与il-4特异性结合，il-4的i型受体il-4r专门表达在造血来源的细胞上。特异性针对il-13的受体是il-13ra2，其跟il-13具有特异性的高亲和力，但是其不可以进行下游信号的传导(caput d.et al.,j.biol.chern.,vol.271:16921(1996))。il4ra信号传导的拮抗剂因此将可用于治疗il4ra相关性疾病，如哮喘。


技术实现要素：

[0004]
有鉴于此，本发明提供了il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂。该il4ra抗体可特异性的与细胞表面hil4ra相结合，可作为il4ra信号传导的拮抗剂。
[0005]
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0006]
本发明提供了一种il4ra抗体，该il4ra抗体的重链包含seq id no：1所示序列的cdr1、seq id no：2所示序列的cdr2、seq id no：3所示序列的cdr3；
[0007]
il4ra抗体的轻链包含seq id no：4所示序列的cdr4、seq id no：5所示序列的cdr5、seq id no：6所示序列的cdr6。
[0008]
在本发明中，il4ra抗体的重链与轻链之间由linker连接，linker的氨基酸序列如seq id no：7所示。
[0009]
本发明还提供了一种il4ra抗体，il4ra抗体的氨基酸序列如seq id no：8所示。
[0010]
作为优选，il4ra抗体为人源化抗体。
[0011]
本发明还提供了编码上述il4ra抗体的基因，其碱基序列如seq id no：9所示。
[0012]
本发明还提供了一种载体，包括编码il4ra抗体的基因。
[0013]
作为优选，载体所用质粒为pcdna4/myc-hisa。
[0014]
本发明还提供了一种宿主细胞，包括上述的载体。
[0015]
作为优选，宿主细胞为hek293细胞。
[0016]
本发明还提供了一种il4ra抗体的制备方法，包括：将单链抗体scfv基因(seq id no：9所示)及igg1-fc基因融合后经hindiii与ecori双酶切克隆到载体pcdna4/myc-hisa中，进行克隆和质粒小提，提取后的质粒在hek293细胞中表达，通过protein a柱纯化。
[0017]
本发明还提供了一种il4ra拮抗剂，包括本发明提供的il4ra抗体。
[0018]
本发明提供了il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂。该il4ra抗体的重链包含seq id no：1所示序列的cdr1、seq id no：2所示序列的cdr2、seq id no：3所示序列的cdr3；il4ra抗体的轻链包含seq id no：4所示序列的cdr4、seq id no：5所示序列的cdr5、seq id no：6所示序列的cdr6。本发明具有的技术效果为：
[0019]
本发明的il4ra抗体可特异性的与细胞表面hil4ra相结合，可作为il4ra信号传导的拮抗剂，因此该抗体可用于治疗il4ra相关性疾病，如哮喘。
附图说明
[0020]
图1示抗il4ra抗体特性鉴定结果，1-1为空白对照，1-2为阴性对照，1-3为anti-hil4ra scfv抗体与细胞表面hil4ra相结合的流式细胞图。
具体实施方式
[0021]
本发明公开了il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
[0022]
本发明提供的il4ra抗体、基因、载体、宿主细胞和il4ra拮抗剂中所用试剂、仪器或材料均可由市场购得。
[0023]
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
[0024]
实施例1：重组人il4ra的表达和egfp细胞制备
[0025]
根据蛋白数据库uniprot上人il4ra的氨基酸序列(p24394)，得到人il4ra胞外结构域的氨基酸序列(即p24394中第1位残基至232位残基)；il4ra的氨基酸序列如下(其中下划线部分为胞外段)：
[0026]
mgwlcsgllfpvsclvllqvassgnmkvlqeptcvsdymsistcewkmngptncstelrllyqlvfllseahtcipennggagcvchllmddvvsadnytldlwagqqllwkgsfkpsehvkprapgnltvhtnvsdtllltwsnpyppdnylynhltyavniwsendpadfriynvtylepslriaastlksgisyrarvrawaqcynttwsewspstkwhnsyrepfeqhlllgvsvscivilavcllcyvsitkikkewwdqipnparsrlvaiiiqdaqgsqwekrsrgqepakcphwkncltkllpcflehnmkrdedphkaakempfqgsgksawcpveisktvlwpesisvvrcvelfeapveceeeeeveeekgsfcaspessrddfqegregivarlteslfldllgeenggfcqqdmgescllppsgstsahmpwdefpsagpkeappwgkeqplhlepsppasptqspdnltctetplviagnpayrsfsnslsqspcprelgpdpllarhleevepempcvpqlsepttvpqpepetweqilrrnvlqhgaaaapvsaptsgyqefvhaveqggtqasavvglgppgeagykafssllassavspekcgfgassgeegykpfqdlipgcpgdpapvpvplftfgldrepprspqsshlpssspehlglepgek
vedmpkpplpqeqatdplvdslgsgivysaltchlcghlkqchgqedggqtpvmaspccgcccgdrssppttplrapdpspggvpleaslcpaslapsgisekskssssfhpapgnaqsssqtpkivnfvsvgptymrvs
[0027]
其碱基序列如下：
[0028]
atggggtggctttgctctgggctcctgttccctgtgagctgcctggtcctgctgcaggtggcaagctctgggaacatgaaggtcttgcaggagcccacctgcgtctccgactacatgagcatctctacttgcgagtggaagatgaatggtcccaccaattgcagcaccgagctccgcctgttgtaccagctggtttttctgctctccgaagcccacacgtgtatccctgagaacaacggaggcgcggggtgcgtgtgccacctgctcatggatgacgtggtcagtgcggataactatacactggacctgtgggctgggcagcagctgctgtggaagggctccttcaagcccagcgagcatgtgaaacccagggccccaggaaacctgacagttcacaccaatgtctccgacactctgctgctgacctggagcaacccgtatccccctgacaattacctgtataatcatctcacctatgcagtcaacatttggagtgaaaacgacccggcagatttcagaatctataacgtgacctacctagaaccctccctccgcatcgcagccagcaccctgaagtctgggatttcctacagggcacgggtgagggcctgggctcagtgctataacaccacctggagtgagtggagccccagcaccaagtggcacaactcctacagggagcccttcgagcagcacctcctgctgggcgtcagcgtttcctgcattgtcatcctggccgtctgcctgttgtgctatgtcagcatcaccaagattaagaaagaatggtgggatcagattcccaacccagcccgcagccgcctcgtggctataataatccaggatgctcaggggtcacagtgggagaagcggtcccgaggccaggaaccagccaagtgcccacactggaagaattgtcttaccaagctcttgccctgttttctggagcacaacatgaaaagggatgaagatcctcacaaggctgccaaagagatgcctttccagggctctggaaaatcagcatggtgcccagtggagatcagcaagacagtcctctggccagagagcatcagcgtggtgcgatgtgtggagttgtttgaggccccggtggagtgtgaggaggaggaggaggtagaggaagaaaaagggagcttctgtgcatcgcctgagagcagcagggatgacttccaggagggaagggagggcattgtggcccggctaacagagagcctgttcctggacctgctcggagaggagaatgggggcttttgccagcaggacatgggggagtcatgccttcttccaccttcgggaagtacgagtgctcacatgccctgggatgagttcccaagtgcagggcccaaggaggcacctccctggggcaaggagcagcctctccacctggagccaagtcctcctgccagcccgacccagagtccagacaacctgacttgcacagagacgcccctcgtcatcgcaggcaaccctgcttaccgcagcttcagcaactccctgagccagtcaccgtgtcccagagagctgggtccagacccactgctggccagacacctggaggaagtagaacccgagatgccctgtgtcccccagctctctgagccaaccactgtgccccaacctgagccagaaacctgggagcagatcctccgccgaaatgtcctccagcatggggcagctgcagcccccgtctcggcccccaccagtggctatcaggagtttgtacatgcggtggagcagggtggcacccaggccagtgcggtggtgggcttgggtcccccaggagaggctggttacaaggccttctcaagcctgcttgccagcagtgctgtgtccccagagaaatgtgggtttggggctagcagtggggaagaggggtataagcctttccaagacctcattcctggctgccctggggaccctgccccagtccctgtccccttgttcacctttggactggacagggagccacctcgcagtccgcagagctcacatctcccaagcagctccccagagcacctgggtctggagccgggggaaaaggtagaggacatgccaaagcccccacttccccaggagcaggccacagacccccttgtggacagcctgggcagtggcattgtctactcagcccttacctgccacctgtgcggccacctgaaacagtgtcatggccaggaggatggtggccagacccctgtcatggccagtccttgctgtggctgctgctgtggagacaggtcctcgccccctacaacccccctgagggccccagacccctctccaggtggggttccactggaggccagtctgtgtccggcctccctggcaccctcgggcatctcagagaagagtaaatcctcatcatccttccatcctgcccctggcaatgctcagagctcaagccagacccccaaaatcgtgaactttgtctccgtgggacccacatacatgagggtctcttag
[0029]
根据蛋白数据库uniprot上人免疫球蛋白gamma(γ)1(igg1)的恒定区氨基酸序列(p01857)，得到人igg1-fc的结构域氨基酸序列(即p01857中第104位残基至330位残基)。igg1-fc氨基酸序列如下：
[0030]
dkthtcppcpapellggpsvflfppkpkdtlmisrtpevtcvvvdvshedpevkfnwyvdgvevhnaktkpreeqynstyrvvsvltvlhqdwlngkeykckvsnkalpapiektiskakgqprepqvytlppsrdeltknqvsltclvkgfypsdiavewesngqpennykttppvldsdgsfflyskltvdksrwqqgnvfscsvmhealhnhytqkslslspgk
[0031]
其碱基序列如下：
[0032]
gacaaaactcacacatgcccaccgtgcccagctccggaactcctgggcggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaacagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgttggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaa
[0033]
利用dnaworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码dna序列得到hil4ra-fc融合蛋白的基因。
[0034]
根据蛋白数据库uniprot上信息得到增强型绿色荧光蛋白egfp氨基酸序列(c5mky7)、人il4ra的氨基酸序列(p24394)，egfp氨基酸序列如下：mvskgeelftgvvpilveldgdvnghkfsvsgegegdatygkltlkficttgklpvpwptlvttltygvqcfsrypdhmkqhdffksampegyvqertiffkddgnyktraevkfegdtlvnrielkgidfkedgnilghkleynynshnvyimadkqkngikvnfkirhniedgsvqladhyqqntpigdgpvllpdnhylstqsalskdpnekrdhmvllefvtaagitlgmdelyk
[0035]
其碱基序列如下：
[0036]
atggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaag
[0037]
利用dnaworks在线工具(http://helixweb.nih.gov/dnaworks/)设计对应的编码dna序列得到hil4ra与egfp融合蛋白的基因，hil4ra-egfp的基因。通过人工合成的方式得到其dna片段。合成好的基因序列分别经fermentas公司的hindiii与ecori双酶切亚克隆到商业化载体pcdna4/myc-hisa(invitrogen,v863-20)中，测序验证构建质粒的准确性，获得重组质粒dna即：pcdna4-hil4ra-fc和pcdna4-hil4ra-egfp。
[0038]
将相关的egfp重组质粒转染到hek293(atcc,crl-1573
tm
)细胞中，转染48h后通过
荧光激活信号分选(facs)确认hil4ra的表达。
[0039]
将pcdna4-hil4ra-fc瞬时转染至hek293细胞用于蛋白生产。将重组表达质粒用freestyle293培养基稀释并加入转化所需pei(polyethylenimine)溶液，将每组质粒/pei混合物分别加入细胞悬液中，放置在37℃，10％co2，90rpm中培养；培养5～6天后，收集瞬时表达培养上清液，通过proteina亲和层析法，初步纯化得到hil4ra-fc蛋白样品，用于以下各实施例。得到的蛋白样品利用sds-page进行初步的检测，可以清晰的看到目的条带。
[0040]
实施例2：从酵母展示文库中筛选抗il4ra抗体、克隆表达
[0041]
采用酵母展示技术筛选针对人il4ra的全人抗体。通过克隆来自50个健康人的pbmc的igm和igg cdna中的vh和vl基因，构建scfv酵母展示文库(vh和vl中间的连接序列是gilgsggggsggggsggggs连接肽，库容为5
×
108。将10倍库容的酵母库复苏，诱导酵母表面表达抗体，用100nm生物素化的hil4ra-fc抗原利用磁珠分选的方式富集二次，然后用生物素化的hil4ra-fc做流式分选再富集两次。得到的酵母涂板，挑取单克隆。单克隆酵母经扩增和诱导表达后用生物素化的hil4ra-fc染色分析，确定阳性酵母。将经过facs确认的酵母克隆进行酵母菌落pcr和测序，pcr引物为：
[0042]
sequence-f：cgtagaatcgagaccgaggaga；
[0043]
sequence-r：ctggtggtggtggttctgctagc；
[0044]
测序的引物为sequence-r。得到测序结果后用bioedit软件对序列进行比对分析。
[0045]
将上述得到的单链抗体scfv基因及前述的人igg1-fc基因融合后经fermentas公司的hindiii与ecori双酶切克隆到商业化载体pcdna4/myc-hisa中，按照分子克隆的标准操作进行克隆和质粒小提。提取后的质粒在hek293细胞中瞬时表达，并通过protein a柱纯化。anti-hil4rascfv抗体的氨基酸序列如seq id no：8所示(vh-linker-vl，波浪线部分是cdr，下划线是linker)：
[0046]
qvqlveseaevrkpgasvkvsckasgytftwvrqapgqglewmgrvtmtrdtstsidymelsslrfedtavyycvrrvtmtrdtstsidymelsslrfedtavyycvrwgqgtlvtvssgilgsggggsggggsggggsqsvliqpasvsgspgqsitiscwyqqhpgkapklmiywyqqhpgkapklmiygvpdrfsgsksgntasltisglqpedeadyycfgggtkvtvl
[0047]
其碱基序列如seq id no：9所示：
[0048]
caggtgcagcttgtggagtctgaggctgaggtgaggaagcctggggcctcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcaccacctactatatgaactgggtgcgacaggcccctggacaagggcttgagtggatgggaataatcagccctaggggtgacaggactgtctacgcaccgaagttccagggcagagtcaccatgaccagggacacgtccacgagtatagattacatggaactgagcagcctgagatttgaggacacggccgtgtattactgtgtgagaggtgatactggtaaccggataaagggagagtttgacctttggggccagggaaccctggtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagtctgttctgattcagcctgcctccgtgtctgggtctcctggacagtcgatcaccatctcctgcactggaacgagcggtgacgttggtggttataactatgtctcctggtaccaacagcacccaggcaaagcccccaaactcatgatttatgaggtcagtaagcggccctcaggggtccctgatcgcttctctggctccaagtcgggaaacacggcctccctgaccatctctgggctgcagcctgaggacgaggctgattattactgcttctcctacagacatactattagttctttcgtcttcggcggagggaccaaggtcac
cgtccta
[0049]
实施例3：抗il4r抗体特性鉴定(与il4r结合鉴定-facs法)
[0050]
取hil4ra-egfp细胞，重悬于0.5％pbs-bsabuffer中，加入上述纯化后2μg的anti-hil4rascfv抗体，同时设置相关对照，阴性对照为2μg的higg1蛋白。二抗为ebioscience的anti-hig-pe。染色完毕后流式细胞仪进行检测。以此方法鉴定能结合细胞表面hil4ra抗原的抗体。如图1所示，anti-il4ra11#可以与细胞表面hil4ra相结合，而阴性对照不能够与细胞表面hil4ra相结合。
[0051]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

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