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2021-02-01 19:02:38|
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起点商标网 专利名称：一种球蛋白溶液的病毒灭活方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及病毒灭活技术，具体涉及生物制品免疫球蛋白溶 液中病毒灭活技术。
背景技术：
目前，对免疫球蛋白溶液中的病毒进行灭活的方法有有机溶剂/清洁剂法(S/D 法)、低PH法和D50法，下面表1是各种方法的病毒灭活效果和存在的不足。表1 各种方法的病毒灭活效果和存在的不足 当用Cohn法分离免疫球蛋白时，由于乙醇和低温的条件有抑制、清除和杀灭病原 微生物的作用，但该作用极其有限，故不能作为一种病毒灭活方法。当巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活时，回收率< 33%，因回收率过低，日趋紧张的 血源使得行业并没有采取巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活。随着血液制品在临床上的广泛应用，如何保证其安全性，已成为世界医药卫生界 乃至整个社会普遍关注的焦点。辛酸钠，别名正辛酸钠，英文名Sodium caprylate ；分子式CH3 (CH2) 6C00Na，辛 酸钠属于脂肪酸类，长期以来一直用于白蛋白溶液的稳定剂以及某些血浆蛋白的沉淀剂， 且已被证明是安全可靠的。现有技术[参见Biologicals，2003，31 (3) :213_221·]公开的辛酸盐病毒灭活技术方案为辛酸盐16mM，蛋白浓度10%，pH值4. 5，温度35°C，时间1小时，我们在实验室进 行了条件重现试验，并对回收率作了检测，检测结果显示该方案的蛋白质回收率小于10%， 蛋白质回收率过低，没有实用价值。血液制品对回收率的要求一直是生产血液制品各工艺可行性的标准，当巴斯灭活 法用于球蛋白溶液病毒灭活时，蛋白质回收率不得低于33%，但是日趋紧张的血源使得行 业并没有采取巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活，因此，现有技术公开的技术方案由于蛋白 质回收率过低，没有实用价值。
发明内容
本发明的任务是提供一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，使其具有简单、安全、快 捷、有效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性等特点。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤1. 一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤a.计算待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量，按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液 中蛋白质的重量比(mmol/g)为8 17mmol lg，优选为14 16mmol Ig的比例计算辛 酸钠的用量，按计算所得辛酸钠用量称取辛酸钠，将称取的辛酸钠加入二倍于待病毒灭活 球蛋白溶液体积的稀释液中充分溶解，配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 0 8. 5，优选5. 6 5. 8，将 调好PH值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液 与球蛋白溶液的混合液；C.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 3 5. 5，优选为4. 7 4. 9，置入振荡式水浴箱，30 士 1°C保持1. 5小时后取出，澄清过滤祛除辛 酸钠沉淀，滤液采用透析或超滤方法祛除残留的辛酸钠，检测滤液中残留的辛酸钠含量，使 透析液或超滤液中辛酸钠含量< 0. Olmmol。上述步骤a中所述的稀释液是0. 9 1. 8%的NaCl溶液，也可以用注射用水作稀 释液。在上述步骤c中，所述的检测滤液中残留的辛酸钠含量的方法是采用气相色谱法 检测。本发明方法的全部操作要求在验证合格的GMP车间进行。实验资料〈实验引用标准〉《中国生物制品规程》二〇〇〇年版中国生物制品标准化委员会《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》〈实验项目与目的〉1.生物活性的检测实验目的生物活性是生物制品的重要检测项目，生物活性是生物制品有效性的 重要依据，生物活性的检测就是为了观察该实验是否会对生物活性产生影响，即实验设计 的合理性。
2.蛋白质回收率的检测实验目的对于日趋紧张的血源和需求量日益增长的市场而言，蛋白质回收率的 检测目的是为了考察实验设计的可行性。3.蛋白质的稳定性试验结果实验目的蛋白质的稳定性试验是在一定的时间段内，对目的蛋白质的生物活性 及状态进行系列的动态观察，进一步证明目的蛋白质的生物活性的稳定性。4.回收率的优选实验目的提升该发明的实用价值。5.病毒验证实验目的按国家药品监督管理局关于《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验 证指导原则》对指示病毒进行病毒灭活验证，考察本发明的目的是否达到。6.常用于人免疫球蛋白病毒灭活方法的比较及讨论实验目的阐明在球蛋白病毒灭活领域本发明的优势，即病毒灭活方法简单、安 全、快捷、有效。<试验材料与方法>1.材料静注人免疫球蛋白，(免疫球蛋白由武汉生物制品研究所血液制剂室提供)。2.仪器和试剂检测抗-HBs效价试验盒由北京北方生物技术研究所生产；白喉抗体国家参考品 和白喉抗体诊断血球购自中国药品生物制品检定所。蛋白质的含量测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部凯氏定氮法。 BUCHI-K370凯氏定氮仪由瑞士 BUCHI厂家生产。UV-2550型紫外分光光度计由岛津公司生产。FM-2000型免疫计数仪产自西安。振荡式水浴箱，酸度计。3.生物活性的检测3. 1人免疫球蛋白IgG含量的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部IgG含量测定法(紫外分光光度法)。3. 2人免疫球蛋白分子大小的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部中分子排阻色谱法测定人免疫球蛋白 IgG单体加二聚体的含量。3. 3人免疫球蛋白纯度的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部中醋酸纤维薄膜电泳法。3. 4白喉抗体效价的测定根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中人免疫球蛋白抗体效价测定法进行 检测。3. 5抗HBS效价的测定根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中RIA法进行检测。抗HBs应不低于 6.OIU/glgG。3. 6抗补体活性的测定
根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中抗补体活性测定法。结论经武汉生物制品研究所质量保证部对上述各项检测，得出的试验检测结果 均符合2005年版《中华人民共和国药典》三部，检测说明目的蛋白质生物活性未受影响。4.蛋白质回收率的检测分别测定人免疫球蛋白在一定的病毒灭活参数条件的作用下蛋白质的含量与未 经五种参数处理前的蛋白质含量，未经五种参数处理的蛋白质含量与经五种参数处理后的 蛋白质含量的百分比值为该参数条件下的蛋白质的回收率。通过测定三批供试品中的总氮 含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量，来计算出蛋白质的含量。结论经武汉生物制品研究所质量保证部对蛋白质回收率的检测，得出的试验检 测结果说明，目的蛋白质回收率大于等于90%。5.蛋白质的稳定性试验结果20070501批、20070502批、20070503批，静注人免疫球蛋白经本发明提供的辛酸
钠病毒灭活后的长期稳定性结果分别见表2、表3、表4。(具体灭活操作过程见5.病毒灭 活)表220070501批静注人免疫球蛋白的稳定性 结论经武汉生物制品研究所质量保证部对目的蛋白稳定性的定期检测，结果全 部符合《中国药典》三部(2005版)的规定要求，说明经本发明方法处理过的目的蛋白其生 物活性的稳定性良好。表5 《中华人民共和国药典》2005年版三部稳定性试验结果对照表 6.回收率的优选表6当辛酸钠浓度为16mmol时 该组实验数据表明，温度的升高和时间的延长都会使蛋白质的浊度升高而对回收 率则无明显影响，辛酸盐溶液的PH7. 6时的回收率是50%，为该实验组最高回收率。表 7 分析当降低蛋白浓度至5. 5士0. 5%，温度的升高任然会对外观产生影响但对回 收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 8时的回收率是93%，为该实验组最高回收率。表8 分析继续降低蛋白浓度至2. 5士0. 5%，温度的升高和时间的延长还是会使蛋白 质的浊度升高对回收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 6时的回收率是80%，为 该实验组最高回收率。表 9
8 分析当蛋白浓度降至1.0士0.5%，温度的升高和时间的延长任会使蛋白质的浊 度升高而对回收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 5时的回收率是50%，为该实 验组最高回收率。结论从以上四组试验数据得出如下结论，无论待病毒灭活的球蛋白处于哪一种 浓度，辛酸钠溶液的PH是回收率的关键，而温度和时间主要影响球蛋白溶液的外观，而对 回收率的影响不是十分明显，关于辛酸钠溶液PH值的控制点，是本发明的创新之一。以下表10是当辛酸钠处于不同浓度时，不同的稀释液对回收率的影响，这是本发 明的创新之二。表 10 7.病毒灭活的验证由国家认可的病毒验证单位——华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重 点实验室动物病原分室分别进行伪狂犬病毒和猪细小病毒的灭活效果验证。7. 1指示病毒依据国家药品监督管理局关于《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原 则》的通知予以选择。7. 2 方法将长成单层的BHK-21传代细胞消化分散，移至96孔细胞培养板，待出现单层细胞 后，接种下列各实验组的材料。7. 3试验组设计及验证方法A:酸性样品对照即不含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品(酸性样品)+指示病毒。 试验中，在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升伪狂犬病毒加入到0. 9毫升不含辛酸钠的人免疫
9球蛋白半成品，共7管。在不同时间段测定病毒的毒价，目的是观察非辛酸钠因素对病毒的影响。B 中性样品即不含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品(中性样品)+指示病毒。试验 中，在每个灭菌EP管中，将0.1毫升病毒加入到0.9毫升人免疫球蛋白(pH值中性)半成 品中，共有7管。在不同时间段测定病毒的毒价，结合A组，排除不同pH球蛋白溶液对病毒 的作用。C:辛酸钠+人免疫球蛋白+病毒(试验组)在每个灭菌EP管中，将0.1毫升病 毒加入到0. 9毫升含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品中，共7管。在不同时间段测定病毒的 毒价，确定在设想状态下病毒的灭活效果。D:辛酸钠+人免疫球蛋白(酸性样品，无病毒)在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升 DMEM加入到0. 9毫升的试验样品中(不含病毒)，共7管。观察这试验样品对细胞的影响。E 指示病毒对照在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升病毒加入到0.9毫升DMEM培养 基中，共7管。在不同时间段测定病毒的毒价，观察温度本身是否对病毒有影响。将上述5个不同组的样品放入30 °的水浴锅中，在第0，5，10，30，70，90，120分钟， 在不同组样品中各取出1管，立即放入-80°冰箱中。从每一管中取出0. 1毫升样品，用0. 9ml DMEM培养基进行10倍系列稀释(至10_8 稀释度)，接种96孔细胞，每个稀释度接种8孔细胞。将接毒细胞置37°温箱孵化，每天观察和记录细胞病变。按照Reed-Munich 方法计算 TCID5tl.7. 4猪细小病毒(非脂包膜病毒)验证病毒对照组指示病毒经30°C作用后，其病毒滴度在0分钟、5分钟、10分钟、30分 钟、70分钟、90分钟、120分钟没有发生明显变化，在作用5分钟和10分钟后，病毒滴度提高 了一个 Log。阳性对照组人免疫球蛋白(酸性样品)+病毒；人免疫球蛋白(中性样品)+病毒 分别与细小病毒混合后，接种细胞，可观察到细胞病变，且酸性条件对照组和中性条件对照 组对病毒的作用相当，差别并不显著，排除不同PH球蛋白溶液对病毒的作用；与病毒对照 组相比，酸性条件和中性条件等处理组的病毒滴度仅平均下降0. 9个Log值。阴性对照组辛酸钠+人免疫球蛋白组，除了在10-1稀释度对细胞有毒性外，其他 稀释度的细胞均正常生长，总体评价辛酸钠和人免疫球蛋白对细胞没有损伤。试验组在辛酸钠和人免疫球蛋白共存的条件下，指示病毒毒力效价为 105 4TCID50/0. Iml的细小病毒能在瞬间被灭活，即使在病毒加入后立即接种PK-15细胞测 定TCID50，仍不能出现细胞病变，30°C作用后5分钟、10分钟，直至120分钟，接种细胞后各 组仍未出现细胞病变。表11不同实验组30°C作用后不同时间猪细小病毒效价测定 注试验组和阴性对照组中的“0”表示该组的细胞没有发生细胞病变，即TCID5tl记 为0.结论华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室病毒 验证结论；本发明提供的含有辛酸盐的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C条件下，试 验组结果显示猪细小病毒能迅速被完全灭活，接种细胞后未观察到细胞病变。7.5伪狂犬病毒(脂包膜病毒)验证病毒对照组结果与猪细小病毒类似，在作用5分钟和10分钟后病毒滴度提高了 一个 Log {to阳性对照组结果与猪细小病毒类似，与病毒对照组相比，酸性和中性条件处理组 的病毒亦仅下降一个Log值。阴性对照组细胞正常生长，说明病毒对照组和酸性及中性的阳性对照组出现的 细胞病变不是由辛酸钠和人免疫球蛋白产生的，总体评价辛酸钠和人免疫球蛋白对细胞没 有损伤。试验组在辛酸钠和人免疫球蛋白共存的条件下，指示病毒毒力效价为 107-4TCID50/0. Iml的伪狂犬病毒能在瞬间被灭活，即使在病毒加入后立即接种BHK-21细 胞测定TCID50，仍不能出现细胞病变，30°C作用后5分钟、10分钟，直至120分钟，接种细胞 后各组仍未出现细胞病变。表12不同实验组30°C作用后不同时间伪狂犬病毒效价测定
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注试验组和阴性对照组中的“0”表示该组的细胞没有发生细胞病变，即TCID5tl记 为0.结论华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室病毒 验证结论；武汉生物制品所提供的含有辛酸盐的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C 条件下，根据试验组结果显示伪狂犬病毒能迅速被完全灭活，接种细胞后未观察到细胞病变。表13与现在常用于人免疫球蛋白病毒灭活方法的比较
病毒降低量≥4Logs，表示该步骤灭活/去除病毒有效[参见国药监注〔2002〕 160号文件]根据世界卫生组织的相关规定，我国国家药品监督管理局已制定了《血液制品去 除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]，160号)。由此可见，加强血液 制品的安全性问题是血液制品永恒的主题，通过加入有效的病毒去除/灭活程序，在保障 血液制品的安全性上实为一个重要的环节。在血液制品的几种病毒灭活方法中，S/D法对脂包膜病毒的灭活效果亦较为理想， 但其也存在着一些局限性，如处理时间较长，灭活剂必须加以去除，对产品的回收率极生物 活性有一定的影响等。辛酸钠作为稳定剂用于白蛋白已有50多年的历史，其对人体的安全 性及耐受性已无可置疑[参见 RemingtonKM，Trejo, Buczynski G, etal. Inactivation of West Nile virus, vaccinia virus and viral surrogates for relevant and emergent viralpathogens in plasma-derived products. Vox Sang,2004,87 (1) ； 10-8.]本发明通过对灭活时的各种条件如温度、pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、孵放时 间进行了大量的研究，提供了具有实用价值的辛酸钠灭活病毒时的各种参数的最佳配比。 首先，通过生物生化等多个项目的检测，其结果显示，当选择16mM辛酸钠灭活病毒时，不 影响其目的蛋白的生物活性，高回收率。又经病毒灭活验证，该病毒灭活工艺对脂包膜病 毒如伪狂犬病毒的瞬间灭活率为6. 8Logs，对非脂包膜病毒如猪细小病毒的瞬间灭活率为 4. 5Logs，并且经过细胞三代盲传试验证明，病毒的确是被灭活而不是被抑制。实验证明，本发明提供的球蛋白溶液的病毒灭活方法，是一种简单、安全、快捷、有 效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性的球蛋白溶液病毒灭活方法。血液制品的安全性日益受到人们的关注，安全有效的血液制品不仅能提高使用者 的生存质量，而且能大大提高血液制品的市场竞争力。随着我国政府对人民健康的更加重 视，三步病毒灭活也将成为必然趋势。总之，在保证蛋白质的生物活性和回收率的条件下， 对病毒进行有效灭活，不失为国内血液制品病毒灭活的又一有效补充。
具体实施例方式实施例1取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 8. 5，灭活时pH 4. 9，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠；将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将步骤a配制的辛酸钠溶液的pH调至8. 5，将调好pH 值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋 白溶液的混合液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将步骤b配制的辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的 PH调至4. 8，置入振荡式水浴箱，30士 1 °C保持1. 5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀， 滤液采用透析方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使 透析液中辛酸钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率20%，物理外观呈微乳光。实施例2取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5. 5，灭活时pH 4. 7，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 5，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率50%，物理外观呈乳光。实施例3取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。
灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5.6，灭活时？!1 4. 8，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 6，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率80%，物理外观呈微乳光。实施例4取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5.8，灭活时？!1 4. 9，稀释液(0. 9% NaCL溶液)。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 8，，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 9，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率93%，物理外观呈微乳光。
权利要求
一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤a.计算待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量，按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比(mmol/g)为8～17∶1的比例计算辛酸钠的用量，按计算所得辛酸钠用量称取辛酸钠，将称取的辛酸钠加入二倍于待病毒灭活球蛋白溶液体积的稀释液中充分溶解，配制成辛酸钠溶液；b.用pH4.0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5.0～8.5，将调好pH值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液；c.用pH4.0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4.3～5.5，置入振荡式水浴箱，30±1℃保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析或超滤方法祛除残留的辛酸钠，检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液或超滤液中辛酸钠含量＜0.01mmol。
2.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤a中， 是按辛酸钠待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量=14 16mmol Ig的配比计算辛酸 钠的用量。
3.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，所述的稀释 液是注射用水。
4.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，所述的稀释 液是0.9 1.8%的NaCl溶液。
5.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在所述的步 骤b中，是用pH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 6 5. 8。
6.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在所述的步 骤c中，是用pH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7 4. 9。
7.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤c中， 所述的检测滤液中残留的辛酸钠含量的方法是采用气相色谱法检测。
8.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤b中 用PH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 8，在步骤c中用pH4. O的醋酸缓冲液将 辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的PH调至4. 9。
全文摘要
本发明提供了一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，本发明通过对病毒灭活时的各种条件如温度、pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、孵放时间进行了大量的研究，提供了具有实用价值的辛酸钠灭活病毒时的各种参数的最佳配比。实验证明，本发明提供的球蛋白溶液的病毒灭活方法，是一种简单、安全、快捷、有效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性的球蛋白溶液病毒灭活方法。
文档编号C07K16/00GK101927011SQ200910062779
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者叶巨兵, 张智, 彭焱, 彭良俊, 方舸, 李策生, 纽泽春, 缪燕敏, 邹莉 申请人:武汉生物制品研究所
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及病毒灭活技术，具体涉及生物制品免疫球蛋白溶 液中病毒灭活技术。
背景技术：
目前，对免疫球蛋白溶液中的病毒进行灭活的方法有有机溶剂/清洁剂法(S/D 法)、低PH法和D50法，下面表1是各种方法的病毒灭活效果和存在的不足。表1 各种方法的病毒灭活效果和存在的不足 当用Cohn法分离免疫球蛋白时，由于乙醇和低温的条件有抑制、清除和杀灭病原 微生物的作用，但该作用极其有限，故不能作为一种病毒灭活方法。当巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活时，回收率< 33%，因回收率过低，日趋紧张的 血源使得行业并没有采取巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活。随着血液制品在临床上的广泛应用，如何保证其安全性，已成为世界医药卫生界 乃至整个社会普遍关注的焦点。辛酸钠，别名正辛酸钠，英文名Sodium caprylate ；分子式CH3 (CH2) 6C00Na，辛 酸钠属于脂肪酸类，长期以来一直用于白蛋白溶液的稳定剂以及某些血浆蛋白的沉淀剂， 且已被证明是安全可靠的。现有技术[参见Biologicals，2003，31 (3) :213_221·]公开的辛酸盐病毒灭活技术方案为辛酸盐16mM，蛋白浓度10%，pH值4. 5，温度35°C，时间1小时，我们在实验室进 行了条件重现试验，并对回收率作了检测，检测结果显示该方案的蛋白质回收率小于10%， 蛋白质回收率过低，没有实用价值。血液制品对回收率的要求一直是生产血液制品各工艺可行性的标准，当巴斯灭活 法用于球蛋白溶液病毒灭活时，蛋白质回收率不得低于33%，但是日趋紧张的血源使得行 业并没有采取巴斯灭活法用于球蛋白病毒灭活，因此，现有技术公开的技术方案由于蛋白 质回收率过低，没有实用价值。
发明内容
本发明的任务是提供一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，使其具有简单、安全、快 捷、有效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性等特点。实现本发明的技术方案是本发明提供的这种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤1. 一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤a.计算待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量，按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液 中蛋白质的重量比(mmol/g)为8 17mmol lg，优选为14 16mmol Ig的比例计算辛 酸钠的用量，按计算所得辛酸钠用量称取辛酸钠，将称取的辛酸钠加入二倍于待病毒灭活 球蛋白溶液体积的稀释液中充分溶解，配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 0 8. 5，优选5. 6 5. 8，将 调好PH值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液 与球蛋白溶液的混合液；C.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 3 5. 5，优选为4. 7 4. 9，置入振荡式水浴箱，30 士 1°C保持1. 5小时后取出，澄清过滤祛除辛 酸钠沉淀，滤液采用透析或超滤方法祛除残留的辛酸钠，检测滤液中残留的辛酸钠含量，使 透析液或超滤液中辛酸钠含量< 0. Olmmol。上述步骤a中所述的稀释液是0. 9 1. 8%的NaCl溶液，也可以用注射用水作稀 释液。在上述步骤c中，所述的检测滤液中残留的辛酸钠含量的方法是采用气相色谱法 检测。本发明方法的全部操作要求在验证合格的GMP车间进行。实验资料〈实验引用标准〉《中国生物制品规程》二〇〇〇年版中国生物制品标准化委员会《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》〈实验项目与目的〉1.生物活性的检测实验目的生物活性是生物制品的重要检测项目，生物活性是生物制品有效性的 重要依据，生物活性的检测就是为了观察该实验是否会对生物活性产生影响，即实验设计 的合理性。
2.蛋白质回收率的检测实验目的对于日趋紧张的血源和需求量日益增长的市场而言，蛋白质回收率的 检测目的是为了考察实验设计的可行性。3.蛋白质的稳定性试验结果实验目的蛋白质的稳定性试验是在一定的时间段内，对目的蛋白质的生物活性 及状态进行系列的动态观察，进一步证明目的蛋白质的生物活性的稳定性。4.回收率的优选实验目的提升该发明的实用价值。5.病毒验证实验目的按国家药品监督管理局关于《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验 证指导原则》对指示病毒进行病毒灭活验证，考察本发明的目的是否达到。6.常用于人免疫球蛋白病毒灭活方法的比较及讨论实验目的阐明在球蛋白病毒灭活领域本发明的优势，即病毒灭活方法简单、安 全、快捷、有效。<试验材料与方法>1.材料静注人免疫球蛋白，(免疫球蛋白由武汉生物制品研究所血液制剂室提供)。2.仪器和试剂检测抗-HBs效价试验盒由北京北方生物技术研究所生产；白喉抗体国家参考品 和白喉抗体诊断血球购自中国药品生物制品检定所。蛋白质的含量测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部凯氏定氮法。 BUCHI-K370凯氏定氮仪由瑞士 BUCHI厂家生产。UV-2550型紫外分光光度计由岛津公司生产。FM-2000型免疫计数仪产自西安。振荡式水浴箱，酸度计。3.生物活性的检测3. 1人免疫球蛋白IgG含量的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部IgG含量测定法(紫外分光光度法)。3. 2人免疫球蛋白分子大小的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部中分子排阻色谱法测定人免疫球蛋白 IgG单体加二聚体的含量。3. 3人免疫球蛋白纯度的测定参照《中华人民共和国药典》2005年版三部中醋酸纤维薄膜电泳法。3. 4白喉抗体效价的测定根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中人免疫球蛋白抗体效价测定法进行 检测。3. 5抗HBS效价的测定根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中RIA法进行检测。抗HBs应不低于 6.OIU/glgG。3. 6抗补体活性的测定
根据《中华人民共和国药典》2005年版三部中抗补体活性测定法。结论经武汉生物制品研究所质量保证部对上述各项检测，得出的试验检测结果 均符合2005年版《中华人民共和国药典》三部，检测说明目的蛋白质生物活性未受影响。4.蛋白质回收率的检测分别测定人免疫球蛋白在一定的病毒灭活参数条件的作用下蛋白质的含量与未 经五种参数处理前的蛋白质含量，未经五种参数处理的蛋白质含量与经五种参数处理后的 蛋白质含量的百分比值为该参数条件下的蛋白质的回收率。通过测定三批供试品中的总氮 含量以及经钨酸沉淀去除蛋白的供试品滤液中的非蛋白氮含量，来计算出蛋白质的含量。结论经武汉生物制品研究所质量保证部对蛋白质回收率的检测，得出的试验检 测结果说明，目的蛋白质回收率大于等于90%。5.蛋白质的稳定性试验结果20070501批、20070502批、20070503批，静注人免疫球蛋白经本发明提供的辛酸
钠病毒灭活后的长期稳定性结果分别见表2、表3、表4。(具体灭活操作过程见5.病毒灭 活)表220070501批静注人免疫球蛋白的稳定性 结论经武汉生物制品研究所质量保证部对目的蛋白稳定性的定期检测，结果全 部符合《中国药典》三部(2005版)的规定要求，说明经本发明方法处理过的目的蛋白其生 物活性的稳定性良好。表5 《中华人民共和国药典》2005年版三部稳定性试验结果对照表 6.回收率的优选表6当辛酸钠浓度为16mmol时 该组实验数据表明，温度的升高和时间的延长都会使蛋白质的浊度升高而对回收 率则无明显影响，辛酸盐溶液的PH7. 6时的回收率是50%，为该实验组最高回收率。表 7 分析当降低蛋白浓度至5. 5士0. 5%，温度的升高任然会对外观产生影响但对回 收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 8时的回收率是93%，为该实验组最高回收率。表8 分析继续降低蛋白浓度至2. 5士0. 5%，温度的升高和时间的延长还是会使蛋白 质的浊度升高对回收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 6时的回收率是80%，为 该实验组最高回收率。表 9
8 分析当蛋白浓度降至1.0士0.5%，温度的升高和时间的延长任会使蛋白质的浊 度升高而对回收率则无明显影响，该组在辛酸盐溶液的PH5. 5时的回收率是50%，为该实 验组最高回收率。结论从以上四组试验数据得出如下结论，无论待病毒灭活的球蛋白处于哪一种 浓度，辛酸钠溶液的PH是回收率的关键，而温度和时间主要影响球蛋白溶液的外观，而对 回收率的影响不是十分明显，关于辛酸钠溶液PH值的控制点，是本发明的创新之一。以下表10是当辛酸钠处于不同浓度时，不同的稀释液对回收率的影响，这是本发 明的创新之二。表 10 7.病毒灭活的验证由国家认可的病毒验证单位——华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重 点实验室动物病原分室分别进行伪狂犬病毒和猪细小病毒的灭活效果验证。7. 1指示病毒依据国家药品监督管理局关于《血液制品去除/灭活病毒技术方法及验证指导原 则》的通知予以选择。7. 2 方法将长成单层的BHK-21传代细胞消化分散，移至96孔细胞培养板，待出现单层细胞 后，接种下列各实验组的材料。7. 3试验组设计及验证方法A:酸性样品对照即不含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品(酸性样品)+指示病毒。 试验中，在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升伪狂犬病毒加入到0. 9毫升不含辛酸钠的人免疫
9球蛋白半成品，共7管。在不同时间段测定病毒的毒价，目的是观察非辛酸钠因素对病毒的影响。B 中性样品即不含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品(中性样品)+指示病毒。试验 中，在每个灭菌EP管中，将0.1毫升病毒加入到0.9毫升人免疫球蛋白(pH值中性)半成 品中，共有7管。在不同时间段测定病毒的毒价，结合A组，排除不同pH球蛋白溶液对病毒 的作用。C:辛酸钠+人免疫球蛋白+病毒(试验组)在每个灭菌EP管中，将0.1毫升病 毒加入到0. 9毫升含辛酸钠的人免疫球蛋白半成品中，共7管。在不同时间段测定病毒的 毒价，确定在设想状态下病毒的灭活效果。D:辛酸钠+人免疫球蛋白(酸性样品，无病毒)在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升 DMEM加入到0. 9毫升的试验样品中(不含病毒)，共7管。观察这试验样品对细胞的影响。E 指示病毒对照在每个灭菌EP管中，将0. 1毫升病毒加入到0.9毫升DMEM培养 基中，共7管。在不同时间段测定病毒的毒价，观察温度本身是否对病毒有影响。将上述5个不同组的样品放入30 °的水浴锅中，在第0，5，10，30，70，90，120分钟， 在不同组样品中各取出1管，立即放入-80°冰箱中。从每一管中取出0. 1毫升样品，用0. 9ml DMEM培养基进行10倍系列稀释(至10_8 稀释度)，接种96孔细胞，每个稀释度接种8孔细胞。将接毒细胞置37°温箱孵化，每天观察和记录细胞病变。按照Reed-Munich 方法计算 TCID5tl.7. 4猪细小病毒(非脂包膜病毒)验证病毒对照组指示病毒经30°C作用后，其病毒滴度在0分钟、5分钟、10分钟、30分 钟、70分钟、90分钟、120分钟没有发生明显变化，在作用5分钟和10分钟后，病毒滴度提高 了一个 Log。阳性对照组人免疫球蛋白(酸性样品)+病毒；人免疫球蛋白(中性样品)+病毒 分别与细小病毒混合后，接种细胞，可观察到细胞病变，且酸性条件对照组和中性条件对照 组对病毒的作用相当，差别并不显著，排除不同PH球蛋白溶液对病毒的作用；与病毒对照 组相比，酸性条件和中性条件等处理组的病毒滴度仅平均下降0. 9个Log值。阴性对照组辛酸钠+人免疫球蛋白组，除了在10-1稀释度对细胞有毒性外，其他 稀释度的细胞均正常生长，总体评价辛酸钠和人免疫球蛋白对细胞没有损伤。试验组在辛酸钠和人免疫球蛋白共存的条件下，指示病毒毒力效价为 105 4TCID50/0. Iml的细小病毒能在瞬间被灭活，即使在病毒加入后立即接种PK-15细胞测 定TCID50，仍不能出现细胞病变，30°C作用后5分钟、10分钟，直至120分钟，接种细胞后各 组仍未出现细胞病变。表11不同实验组30°C作用后不同时间猪细小病毒效价测定 注试验组和阴性对照组中的“0”表示该组的细胞没有发生细胞病变，即TCID5tl记 为0.结论华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室病毒 验证结论；本发明提供的含有辛酸盐的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C条件下，试 验组结果显示猪细小病毒能迅速被完全灭活，接种细胞后未观察到细胞病变。7.5伪狂犬病毒(脂包膜病毒)验证病毒对照组结果与猪细小病毒类似，在作用5分钟和10分钟后病毒滴度提高了 一个 Log {to阳性对照组结果与猪细小病毒类似，与病毒对照组相比，酸性和中性条件处理组 的病毒亦仅下降一个Log值。阴性对照组细胞正常生长，说明病毒对照组和酸性及中性的阳性对照组出现的 细胞病变不是由辛酸钠和人免疫球蛋白产生的，总体评价辛酸钠和人免疫球蛋白对细胞没 有损伤。试验组在辛酸钠和人免疫球蛋白共存的条件下，指示病毒毒力效价为 107-4TCID50/0. Iml的伪狂犬病毒能在瞬间被灭活，即使在病毒加入后立即接种BHK-21细 胞测定TCID50，仍不能出现细胞病变，30°C作用后5分钟、10分钟，直至120分钟，接种细胞 后各组仍未出现细胞病变。表12不同实验组30°C作用后不同时间伪狂犬病毒效价测定
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注试验组和阴性对照组中的“0”表示该组的细胞没有发生细胞病变，即TCID5tl记 为0.结论华中农业大学动物医学院农业微生物学国家重点实验室动物病原分室病毒 验证结论；武汉生物制品所提供的含有辛酸盐的人免疫球蛋白溶液，在酸性PH和30士 1°C 条件下，根据试验组结果显示伪狂犬病毒能迅速被完全灭活，接种细胞后未观察到细胞病变。表13与现在常用于人免疫球蛋白病毒灭活方法的比较
病毒降低量≥4Logs，表示该步骤灭活/去除病毒有效[参见国药监注〔2002〕 160号文件]根据世界卫生组织的相关规定，我国国家药品监督管理局已制定了《血液制品去 除/灭活病毒技术方法及验证指导原则》(国药监注[2002]，160号)。由此可见，加强血液 制品的安全性问题是血液制品永恒的主题，通过加入有效的病毒去除/灭活程序，在保障 血液制品的安全性上实为一个重要的环节。在血液制品的几种病毒灭活方法中，S/D法对脂包膜病毒的灭活效果亦较为理想， 但其也存在着一些局限性，如处理时间较长，灭活剂必须加以去除，对产品的回收率极生物 活性有一定的影响等。辛酸钠作为稳定剂用于白蛋白已有50多年的历史，其对人体的安全 性及耐受性已无可置疑[参见 RemingtonKM，Trejo, Buczynski G, etal. Inactivation of West Nile virus, vaccinia virus and viral surrogates for relevant and emergent viralpathogens in plasma-derived products. Vox Sang,2004,87 (1) ； 10-8.]本发明通过对灭活时的各种条件如温度、pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、孵放时 间进行了大量的研究，提供了具有实用价值的辛酸钠灭活病毒时的各种参数的最佳配比。 首先，通过生物生化等多个项目的检测，其结果显示，当选择16mM辛酸钠灭活病毒时，不 影响其目的蛋白的生物活性，高回收率。又经病毒灭活验证，该病毒灭活工艺对脂包膜病 毒如伪狂犬病毒的瞬间灭活率为6. 8Logs，对非脂包膜病毒如猪细小病毒的瞬间灭活率为 4. 5Logs，并且经过细胞三代盲传试验证明，病毒的确是被灭活而不是被抑制。实验证明，本发明提供的球蛋白溶液的病毒灭活方法，是一种简单、安全、快捷、有 效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性的球蛋白溶液病毒灭活方法。血液制品的安全性日益受到人们的关注，安全有效的血液制品不仅能提高使用者 的生存质量，而且能大大提高血液制品的市场竞争力。随着我国政府对人民健康的更加重 视，三步病毒灭活也将成为必然趋势。总之，在保证蛋白质的生物活性和回收率的条件下， 对病毒进行有效灭活，不失为国内血液制品病毒灭活的又一有效补充。
具体实施例方式实施例1取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 8. 5，灭活时pH 4. 9，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠；将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将步骤a配制的辛酸钠溶液的pH调至8. 5，将调好pH 值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋 白溶液的混合液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将步骤b配制的辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的 PH调至4. 8，置入振荡式水浴箱，30士 1 °C保持1. 5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀， 滤液采用透析方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使 透析液中辛酸钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率20%，物理外观呈微乳光。实施例2取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5. 5，灭活时pH 4. 7，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 5，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率50%，物理外观呈乳光。实施例3取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。
灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5.6，灭活时？!1 4. 8，稀释液为0.9% NaCL溶液。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 6，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率80%，物理外观呈微乳光。实施例4取由武汉生物制品研究所提供的静注人免疫球蛋白400ml，参照《中华人民共和国 药典》2005年版三部凯氏定氮法测定蛋白质的含量。检测结果蛋白质的含量为11. 8%。灭活参数辛酸钠浓度16mmol，待灭活蛋白质溶液100ml，灭活时间1. 5小时，灭活 温度30 士 1°C，辛酸钠溶液pH 5.8，灭活时？!1 4. 9，稀释液(0. 9% NaCL溶液)。灭活步骤a.计算辛酸钠的用量按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比 (mmol/g)为 16 1 的比例计算辛酸钠的用量为=IOOmlXll. 8% X 166X16/1000 = 31.3 克，称取31. 3克辛酸钠，将称取的辛酸钠加入200ml浓度为0. 9%的NaCL溶液中充分溶解， 配制成辛酸钠溶液；b.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 8，，将调好pH值的辛酸钠溶 液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合 液；c.用pH4. 0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 9，置 入振荡式水浴箱，30士 1°C保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析 方法祛除残留的辛酸钠，采用气相色谱法检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液中辛酸 钠含量< 0. Olmmol,即完成病毒灭活，回收率93%，物理外观呈微乳光。
权利要求
一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，包括以下步骤a.计算待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量，按辛酸钠与待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的重量比(mmol/g)为8～17∶1的比例计算辛酸钠的用量，按计算所得辛酸钠用量称取辛酸钠，将称取的辛酸钠加入二倍于待病毒灭活球蛋白溶液体积的稀释液中充分溶解，配制成辛酸钠溶液；b.用pH4.0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5.0～8.5，将调好pH值的辛酸钠溶液加入待病毒灭活的球蛋白溶液中，边加边搅拌，配制成辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液；c.用pH4.0的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4.3～5.5，置入振荡式水浴箱，30±1℃保持1.5小时后取出，澄清过滤祛除辛酸钠沉淀，滤液采用透析或超滤方法祛除残留的辛酸钠，检测滤液中残留的辛酸钠含量，使透析液或超滤液中辛酸钠含量＜0.01mmol。
2.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤a中， 是按辛酸钠待病毒灭活球蛋白溶液中蛋白质的量=14 16mmol Ig的配比计算辛酸 钠的用量。
3.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，所述的稀释 液是注射用水。
4.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，所述的稀释 液是0.9 1.8%的NaCl溶液。
5.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在所述的步 骤b中，是用pH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 6 5. 8。
6.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在所述的步 骤c中，是用pH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的pH调至4. 7 4. 9。
7.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤c中， 所述的检测滤液中残留的辛酸钠含量的方法是采用气相色谱法检测。
8.根据权利要求1所述的用于球蛋白溶液病毒灭活的方法，其特征在于，在步骤b中 用PH4. O的醋酸缓冲液将辛酸钠溶液的pH调至5. 8，在步骤c中用pH4. O的醋酸缓冲液将 辛酸钠溶液与球蛋白溶液的混合液的PH调至4. 9。
全文摘要
本发明提供了一种球蛋白溶液的病毒灭活方法，本发明通过对病毒灭活时的各种条件如温度、pH值、辛酸盐浓度、蛋白质浓度、孵放时间进行了大量的研究，提供了具有实用价值的辛酸钠灭活病毒时的各种参数的最佳配比。实验证明，本发明提供的球蛋白溶液的病毒灭活方法，是一种简单、安全、快捷、有效、蛋白质回收率高、且不影响目的蛋白质生物活性的球蛋白溶液病毒灭活方法。
文档编号C07K16/00GK101927011SQ200910062779
公开日2010年12月29日 申请日期2009年6月23日 优先权日2009年6月23日
发明者叶巨兵, 张智, 彭焱, 彭良俊, 方舸, 李策生, 纽泽春, 缪燕敏, 邹莉 申请人:武汉生物制品研究所
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