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2021-02-01 17:02:59|
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起点商标网 专利名称：血调节肽的制作方法
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本发明涉及具有血调节活性并能用来抑制人和动物骨髓组织生成系统的新的肽。
种种调节信使和修饰基因起着骨髓组织生成的调节作用，例如菌落刺激因素、干扰素、和各种肽。下列文献报导，成熟粒细胞提取物在盖玻片培养中能特别地抑制人鼠骨髓组织生成细胞增生，参见Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，Foa P.，Metcalf D，Polli EE(eds)，Biological Regulation of Cell Proliferation (1986);Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos et al.，Proyr.Hemat.1∶341，14∶201(1986);Werner et al.，Experientia 42∶521(1986)，Rytomaa和Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968);Rytomaa et al.，Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp 106-138(1967)随后，它们证实了分子量小于3000道尔顿的因子能够导致可移植大鼠粒细胞白血病的消退，并能够抑制人的白血病细胞的生长。Paukovits等人从大鼠骨髓细胞中提取了类似的因子，并且证明了它抑制骨髓细胞滴定胸苷的摄入，参见Paukovits W.R.，Cell TissueKinet 4∶538-547(1971);Naturforsch 37∶1297(1982)，1979年Boll等人，Acta Haematologica 6∶130(1979)证实了大鼠粒细胞提取物对培养中的人的骨髓细胞的抑制效应，许多其它研究者证实了该粒细胞提取物粗品抑制啮齿动物骨髓细胞在体外产生g-CFUC和/或gm-CFUE。
该生物药剂被称为粒细胞抑素，从理论概念上说，它应当是一种分泌时在相同组织中作用的内生细胞增生抑制剂。由提取物粗品得到的材料是非种特异性的，但是高度组织特异性的。此外，还发现它是无毒的并具有可逆活性。
1982年，有人报导了一种在体外和体内都对骨髓组织生成细胞具有选择性抑制疚的合成血调节五肽，其中主要效应似乎是对于骨髓组织生成系细胞(CFU-gm)，参见Paukovits等人，Z.Naturforsch 37∶1297(1982)和美国专利4499081号。该肽被认为与天然存在的粒细胞抑制因子类似，天然存在的粒细胞抑制因子被发现微量存在于骨髓提取物中。
现在，我们从试管试验发现了某些对于骨髓组织生成细胞具有选择性抑制效应的合成肽。通过抑制细胞生成和尤其是粒细胞生成，这些肽趋于阻止非活动性细胞进入细胞分裂，从而易受到细胞毒性抗癌药的进攻。这些肽除了在采用细胞毒性药的治疗中提供保护功能之外，还可以用来阻止与骨髓组织生成系统有关的癌细胞增生，即骨髓白血病。
本发明包括用下文式(Ⅰ)表示的肽，它们具有血调节活性，可用来抑制血细胞生成。
该肽可用于放射和/或细胞素毒性药物治疗中，提供保护功能，还可以用来阻止与骨髓组织生成系统有关的癌细胞的增生，例如用来治疗骨髓白血病。该肽还可用于许多需要改变红细胞生成作用的临床情况。
该化合物也可与共同未决的美国专利申请071547730号(本文引为参考文献)所述的二聚体结合使用，在骨髓细胞中提供高低交替的活性峰。从而增加血细胞生成的自然24小时节律。这样，细胞生长抑制剂治疗便可以在低骨髓活性周期中进行，从而降低了骨髓损伤的危险，而再生将被后续的活性峰所促进。本发明也是一种药用组合物，它包括式(Ⅰ)化合物和药学上可接受的载体。
本发明还包括抑制动物(包括人)骨髓组织生成系统的方法，它包括给予需要治疗的动物以有效量的式(Ⅰ)化合物。
本发明肽可用式(Ⅰ)表示
式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸;
B是丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、胱氨酸或酪氨酸;
C是天冬氨酸或谷氨酸;
D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸或β丙氨酸;
X是酪氨酸或赖氨酸;
n是0或1;
E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或羧酸胺或其羟甲基衍生物。
R1，R4和R5各自是氢，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基;
R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基;
R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl;假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys;或其药学上可接受的盐。
本发明还包括本发明化合物的药学上可接受盐的复合物。应当注意到，式(Ⅰ)中E包括氨基酸或羧酰胺残基的终端羧基或其羟甲基衍生物，所述氨基酸是指甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、对氨基苯基丙氨酸，或者，E是-N(R1)-R2R3基团的酰胺基。
此处采用本领域常用的缩写和符号来描述肽ala＝丙氨酸pGlu＝焦谷氨酸Pro＝腈氨酸Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Tyr＝酪氨酸Pic＝吡啶甲酸Ppc＝L-2-哌啶酸Abu＝氨基丁酸Ppg＝炔丙基甘氨酸Gly＝甘氨酸Orn＝鸟氨酸P-(NH2)Phe＝对氨基苯基丙氨酸Hna＝2，6-二氨基-4-已酸Lys＝赖氨酸Cad＝尸胺根据常规的表示方法，氨基末端在左边;羧基末端在右边。所有手性氨基酸可以是D或L绝对构型。
氨基末端可通过乙酰化保护。保护基团的例子有叔丁氧羰基(t-Boc)、CH3CO和Ar-CO(Ar＝苄基或苯基)。
C-末端可以是羧基(像天然氨基酸一样)或羧酰胺(
)或羟甲基(-CH2-OH)。
优选的化合物是那些其中
A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;
B是谷氨酸或丝氨酸;
C是天冬氨酸;
D是氨基丁酸;
E是甘氨酸或赖氨酸;和n是0;
的化合物，并且手性氨基酸是L绝对构型。
特别优选的是pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)和Pic-Ser-Asp-Abu-Lys。本发明肽可采用固相技术[Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149(1964)]制备，或者可成功地采用本领域公知的溶液方法制备。下列文献提出了肽合成的一般方法，参见J.M.Stewart，J.D.Young，"Solid Phase Peptide Synthesis"，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)，M.Bodansky，Y.A.Klauser，M.A.Ondetti，"Peptide Synthesis"，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY.(1976).
它们可用来制备本发明肽，并作为参考文献并入本文。
每种氨基酸或肽都按照肽领域公知的方法予以适当保护。例如用α-氟烯基甲氧基羰基(α-fluoroenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)或叔丁氧羰基(t-Boc)来保持氨基较好，尤其在α位置。可将适当取代的苄酯基用于赖氨酸的ε-氨基和将适当取代的苄基分别用于Asp和Glu的β和γ羧基。苄酯基保护基团的适当取代是氯、溴、硝基或甲基的邻和/或对位取代，并用来改进保护基团的反应性。除叔丁氧羰基外，保护基团最好是那些不会被温和酸处理除去的基团。这些保护基团可用本领域公知的方法(例如催化氢化、液氨钠处理或HF处理)除去。
如果采用固相合成方法，则肽便由羧基末端开始顺序向肽的氨基末端联结而建立。固相合成由被护氨基酸与适当树脂的共价联结C末端开始，所述适当树脂的例子有二苯甲基胺树脂(BHA)、甲基二苯甲基胺树脂(MBHA)或氯甲基树脂(CMR)(均在美国专利4244946中一般性地提出)或苯基酸氨基甲基树脂(PAM)。如果欲使产物肽的羧基末端为羰酰胺的话，则应采用BHA或MBHA载体树脂。如果欲使产物肽羧基末端为羧基的话，则一般应使用ACMR或PAM树脂，尽管也可以用它来制备羧酰胺或酯。
α-氨基上的保护基团可通过温和的酸(即三氟乙酸)处理而除去。采用本领域公知的适当的去保护、中和和偶联环化方法不必分离中间产物，将氨基酸顺序加上，直至形成期望的肽。完成的肽可随后解封闭和/或以任何顺序与载体树脂分离。
用HF或HBr/乙酸处理树脂承载的肽使得肽与树脂分离，产生作为羧酸或羧酰胺的羧基末端氨基酸。
如果希望得到酯，可在三乙胺存在下用适当的醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苄醇)处理CMR或Pam树脂，使得肽从树脂上解离，直接制得酯。
本发明肽的酯还可以按常规方法由羧酸前体制得。通常在酸催化剂存在下，用醇处理羧酸。或者，可将羧酸转化为活化的酰基中间体，例如酰囟，再用醇处理，最好在碱存在下处理。
将肽从载体树脂中解离的较好的方法是在适当的阳离子清除剂(例如苯甲醚或二甲氧基苯)存在下，用无水HF处理树脂承载的肽。这一方法在除去所有保护基团(只有硫代烷基保护的硫例外)的同时，将肽从树脂中解离。用该方法从CMR和Pam树脂中水解的肽是羧酸，从BHA树脂分解得到的是羧酰胺。
肽末端氨基的修饰可按照本领域公知的方法进行烷基化或酰化。这些修饰可以在氨基酸进入肽之前进行，或者在肽被合成且末端氨基被释放之后，但在保护基除去之前对肽进行修饰。
通常，对游离氨基的酰化是在叔胺存在下，用相应烷基或芳基酸的酰囟、酸酐或活化酯进行的。一烷基化最方便的方法是在温和的还原剂(例如氰基硼氢化钠或氰基硼氢化锂)存在下，用适当的脂肪醛或酮将氨基还原烷基化。在碱存在下，用过量的烷基囟化物处理氨基可进行二烷基化。
肽的溶液合成是采用常规的用来生成酰胺键的方法进行的。通常可在催化剂[例如1-羟基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)]的存在下，用适当的偶合剂[例如N，N′-二环已基碳化二亚胺(DCC))]将带有游离羧基的保护的叔丁氧羰基氨基酸偶联到带有游离氨基的保护的氨基酸上。其它合适的方法有，例如生成保护的叔丁氧羰基氨基酸的游离羧基的活化酯、酸酐或酰囟，随后，可在碱存在下，与保护的氨基酸的游离胺反应。例如，在碱[如N-甲基吗啉，DMAP(二甲基氨基吡啶)或三烷基氨]存在下，在无水溶剂[如二氯甲烷或四氢呋喃(THF)]中，用氯甲酸异丁酯处理保护的丁氧羰基氨基酸或肽，生成“活化酸酐”，随后将其与另一保护的氨基酸或肽的游离胺反应。采用常规技术，可使得用该方法生成的肽在氨基或羧基末端选择性地去保护，并采用类似技术将其偶联在其它肽或氨基酸上。肽完全后，要采用前述方法除去保护基团，例如在钯或铂催化剂存在下氢化，在液氨、氢氟酸或碱中用钠处理。
如果最终的肽在去保护后含有碱性基团，便可制备酸加成盐。肽的酸加成盐是按标准方法，在适当溶剂中由固体化合物和稍微过量的酸制备的。所述酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸。乙酸盐形式特别有用。如果最终的肽含有酸性基团，则可制备阳离子盐。通常用稍微过量的含有适当阳离子的碱性试剂(例如氢氧化物、碳酸盐或烷氧化物)处理母体化合物。像Na+，K+，Ca++和NH+4之类的阳离子是药学上可接受盐中阳离子的例子。Na+和NH+4特别优选。
一般来说，为了产生抑制效果，将本发明肽向患者给药时，每70Kg体重注射日剂量范围是约0.5ng至约10mg，例如约5-500ng，口服日剂量范围是约50ng至约5mg，例如约0.1ng至1mg。如果采用灌注或类似方法给药，剂量范围是每70kg体重约0.005ng至约10mg，例如约0.03ng至1mg，连续6天。原则上最好使患者的细胞外流体的肽浓度为约10-15M至约10-5M。
本发明还有一个特征是提供包含上面定义的一种或多种式(Ⅰ)化合物或其生理学上可接受的盐作为活性成分以及药用载体或赋形剂的药用组合物。本发明组合物可以是例如适于口服、经鼻、非肠道或直肠给药的形式。
此外所用的术语“药用”包括本发明的兽医应用。本发明肽可制成胶囊剂、片剂或制成乳剂或糖浆供口服。可加入药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或使组合物便于制剂。液体载体包括蜂密、花生油、橄榄油、甘油、盐水和水。固体载体包括淀粉、乳糖、二水硫酸钙、白土、硬酯酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。载体还可以包括缓释物质，例如甘油-硬酯酸酯或甘油二硬脂酸酯，可单独或与腊一起使用。固体载体的量可以变化，但最好是每单位剂量在约20mg至约1g之间。药用制剂是按照制药的常规技术制备的，包括必要时经研磨，混合、刺粒和压制，制得片剂;或者研磨、混合、填装制得硬明胶胶囊。例如，将活性成分与惰性载体例如乳糖或山梨醇混合，将混合物装入明胶胶囊便可制得含一种或多种活性成分的胶囊剂。使用液体载体时，制剂将是糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水混悬液的形式。这样的液体制剂可直接口服或装入软明胶胶囊中。也可使用器官特异性载体体系。
或者，本发明肽或其衍生物的药用组合物也可制成冻干粉的溶液，供非肠道给药用。粉剂在使用前可加入适当的稀释或其它药学上可接受的载体而改变组成。液体制剂通常是缓冲的等渗的水溶液。适当稀释剂的例子是标准等渗盐水液、标准5%葡萄糖水溶液或缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。这样的制剂特别适合于非肠道给药，但亦可用于口服给药和装入计量剂量吸入器或喷雾器中供吹入用。最好再加入赋形剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯树胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠或柠檬酸钠。
就直肠给药而言，可将研磨的本发明肽粉末与赋形剂(例如可可油、甘油明胶或聚乙烯醇)混合，然后模制成栓剂。研磨的粉末也可与油状制剂、凝胶、膏剂或乳剂混合，使之成为缓冲液或非缓冲液，并经皮给药。
鼻用喷剂可类似地制成水溶液，装入带有气雾推进剂或带有手压装置的喷雾容器中。
含有本发明化合物的剂量单元最好含1mg-100mg，例如，含0.1-50mg式(Ⅰ)肽或其盐。
本发明还有一个特征是提供抑制骨髓组织生成的方法，它包括给予宿主以有效量的上述定义的药用组合物。
按照本发明，服用本发明化合物时不会产生不可接受的毒性效应。
生物检定A.体外血细胞生成检定下述体外检定系统能够定量本发明化合物对粒细胞-巨噬细胞先组细胞(CFU-GM)在体外脉冲暴露后进入细胞循环的正向或逆向效应。在有适当血细胞生成因素存在的温和的琼脂培养条件下，粒细胞和巨噬细胞菌落可加以定量，并且可特别地由单CFU-GM的增生而产生。为了增生，CFU-GM必须进入细胞循环的S期。在用软琼脂培养前，将骨髓细胞暴露在3H-胸苷中消除了那些活性增生即在细胞循环的S-期的CFU-GM。该效应通过在琼脂检定中定量的总体CFU-GM菌落的减少而定量。与对照物相比，菌落数的减少或增加的程度分别提供了CFU-GM增生的刺激或抑制指数。
方法取股骨髓细胞，以6-9×106细胞/ml的浓度混悬于McCoy氏培养基，该培养基中还补充有10%胎牛血清、抗菌剂、必要的和非必要的氨基酸、MEM维生素、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸钠和碳酸氢钠。用1pg-1mg/ml最终浓度的本发明化合物将复制培养物博动2小时，并在7%CO2气氛在温湿空气中于37℃保温。保温后，用检定介质将培养物洗三次以除去肽，在560μCi的3H-胸苷(放射强度率＝20Ci/mMole)中暴露20分钟。暴露后，向每只试管中加0.5ml冷胸苷(1mg/ml贮存液)以停止反应。将培养物洗三次并置于CFU-GM琼脂检定中，浓度为每个处于上述介质中的培养物75000个细胞，并且含有被暴露在作为血细胞生成因子源的商陆分裂素中的脾细胞调节的0.3%琼脂和10%V/V介质。将培养物于37℃，7%CO2的湿气中保温5-7天，用显微镜将CFU-GM菌落计数。S-期的CFU-GM的百分数通过将3H-胸苷处理过的培养物菌落数目除以未处理的对照培养物菌落数目而得到。将这些值与由肽暴露的和未处理的细胞类似算得的数字比较。
B.过氧化物形成的测定多形核白细胞嗜中性白细胞(PMN)是抵抗包括C.albicans在内的许多病原体入侵的第一道防线。由治疗动物的体外PMN念珠菌活性的检定在测定C.albicans动物模型中治疗化合物的反应模式方面非常重要。在活化的PMN的呼吸突发中，氧还原的主要初始产生是过氧化物，而在呼吸突发中产生的各种氧基团对于入侵病原体是直接或间接细胞毒性的。因此，在刺激期间过氧化物生成和释放的测定对于吞噬细胞的氧化代谢和随后的杀灭有效性是重要的。
将化合物或对照物给予正常小鼠，每天腹膜内给药7天。从各个治疗动物身体收集周围血液并加以混合。用标准分离方法纯化PB-PMN(参见(Boyum，A.1968."Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human peripheral blood" Scand.J.Clin.Lab Invest.21∶77-89);
来自各不同组的细胞混悬液被规格化成含等量PMN/ml。就念珠菌检定而言，向一式四份含C.albicans酵母和10%标准小鼠血清的平衡盐溶液的试管中加入足量PB-PMN，使最终E∶T比值为10∶1。在对照试管中不加PB-PMN。将试管于37℃保温1小时。将巨噬细胞溶解，等分置于琼脂板上，将板保温48小时，这时将菌落形成单元(CFU)计数，并测定每个试样中CFU减少的百分数。
过氧化物歧化-可抑制过氧化物阴离子产生是在微量滴定计亚铁细胞色素C还原检定(1.5×105PB-PMN/池)中定量的，定量是在暴露于可溶性和颗粒状刺激物(相应为12-肉豆蔻酸13-乙酸大戟二萜醇酯(PMA)和血清调理的C.albicans)期间，在0.5%凝胶/平衡盐溶液中进行的。经1小时保温后，测定亚铁细胞色素C还原的摩尔数/池(四等份池/收集组)。在无任何刺激物的情况下测定过氧化物活性基线。在数据计算前，将PMA和Candida刺激活性修正，供自发产生过氧化物。每一治疗组的PB-PMN数据均表示为对照过氧化物的百分数，其中对照活性是从PBS/血清治疗的小鼠的PB-PMN观察到的。
下述实施例用来说明本发明。这些实施例决无限制本发明范围之意，只是用来说明如何制造和使用本发明化合物。
在实施例中，所有温度均为摄氏度。氨基酸分析在Dionex Autoion 100上进行。肽含量分析基于氨基酸分析。FAB质谱是在VGZAB质谱仪上用快速原子轰击进行的。所用缩写如下Abu＝氨基丁酸Ala＝丙氨酸Asp＝天冬氨酸t-Boc＝叔丁氧羰基Cad＝尸氨酸Cl-Z＝对氯苄氧羰基(乙＝苄氧羰基)DCC＝二环已基碳化二亚胺DCM＝二氯甲烷DIEA＝二异丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-)3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺Glu＝谷氨酸P-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基已酸HOBT＝羟基苯并三唑Lys＝赖氨酸NMP＝N-甲基吡咯烷酮Pic＝吡啶甲酸Pro＝脯氨酸Ppg＝炔丙基苷氨酸Gln＝谷酰胺
Gly＝甘氨酸Orn＝鸟氨酸实施例1(PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys)(SEQ ID NO. 1)C24H38N6O11M.W.585.6将800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.5mM，取代＝0.63mM/g)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。(Applied Biosystems型431A肽合成器用户手册，1-30版，1987年2月，分节号000066)。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.665g)，将肽树脂(1.2g)装入一解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用冰乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到220mg肽粗品。经柱(C-18“Bond Elute" 柱)色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(130mg)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.98(2)，Abu 1.12(1)，Lys 1.06(1)FAB/MS MH+587.5实施例2(Pic-Glu-Asp-Abu-Lys)C25H36N6O10M.W.580.6将800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.5mM，取代＝0.63m/M/g)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.665g)，将肽树脂(1.2g)装入-HF解离装置中，用10mlHF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用冰乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到251mg肽粗品。经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(141mg)。(HPLC纯度97%)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.03(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未测到PicFAB/MS 581.1实施例3(Pic-Ser-Asp-Abu-Lys)C23H34N6O9M.W.538.56将850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.56mm树脂)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.038g)，将肽树脂(1.03g)装入-HF解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用三氟乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分三氟乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到298mg肽粗品。经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(178mg)。(HPLC纯度97%)氨基酸分析Asp 1.0(1)，Ser 0.88(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未测到Pic实施例4(PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys)(SEQ ID NO1)C33H47N7O13 M.W.749.77将850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.56mM)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.353g)，将肽树脂(1.3g)装入-HF解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用三氟乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分三氟乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到454mg肽粗品。将肽粗品(204.7mg)经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(95.2mg)。(HPLC纯度90%)。
PGlu+Glu 2.02(2)，Asp 1.0(1)，Tyr 0.94(1)，Lys 1.03(1)实施例5-11按照上述方法制备了下列肽实施例
5 P-Glu-Glu-Asp-Cys-Gly-OH6 PGlu-Glu-Asp-Ser-Gly7 Pic-Glu-Asp-Abu-Lys-OH8 Pic-Ser-Asp-Abu-Lys-OH9 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-OH10 PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys-OH11 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-Tyr-OH实施例12包含本发明化合物的药用制剂可制成多种形式，并且可含有众多的赋形剂。所述制剂的实例如下片剂/成分每片1.活性成分(式Ⅰ化合物) 40mg2.玉米淀粉 20mg3.藻朊酸 20mg4.藻朊酸钠 20mg5.硬脂酸镁 1.3mg2.3mg制片剂方法第一步将成分No.1，NO.2，No.3和No.4在适当的混合器/搅切器中混合第二步分次向第一步的混合物中加入足够的水，每次加水后都仔细混合。如此加水和混合，直至得到能制成湿颗粒的均匀物料。
第三步将湿物料通过8目(2.38mm)网筛的振荡制粒器。
第四步将湿粒在140°F(60℃)烘箱中烘干，直至干燥。
第五步用成分No.5润滑干燥的颗粒。
第六步将经润滑的颗粒在适当的压片机上压片。
非肠道制剂将适量式Ⅰ化合物在加热下溶于聚乙二醇中，可制得非肠道给药的药用组合物。然后用Ph Eur.注射水稀释(至100ml)。然后用0.22微米膜过滤消毒，并密封在消毒容器中。
权利要求
1.式(Ⅰ)化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，式(Ⅰ)如下式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸；B是丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、胱氨酸或酪氨酸；C是天冬氨酸或谷氨酸；D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸或β丙氨酸；X是酪氨酸或赖氨酸；n是0或1；E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或羧酰胺或其羟甲基衍生物。R1，R4和R5各自是氢，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基；R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基；R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl；假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys；该方法包括a)将被护氨基酸偶合，以形成下式的适当保护的化合物式中A、B、C、D、X和n的定义如上，[E′]是氯甲基、甲基二苯甲基胺、二苯甲基胺或苯基乙酰胺基甲基树脂，或者E是-N(R1)-R2R3或者是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或它们的羧酰胺或羟甲基衍生物；b)除去保护基团，必要时将肽从树脂中离解；并且c)可制成其药学上可接受的盐。
2.按权利要求1的方法，其中A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;B是谷氨酸或丝氨酸;C是天冬氨酸;D是氨基丁酸;E是甘氨酸或赖氨酸且n是0。
3.按权利要求1或2的方法，其中手性氨基酸是L绝对构型。
4.按权利要求1的方法，其中n是1，E是甘氨酸或赖氨酸。
5.按权利要求1的方法制备下列化合物之一;pic-Glu-Asp-Abu-LyspGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys(SEQ ID NO2)pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)Pic-Ser-Asp-Abu-Lys
6.将权利要求1定义的式(Ⅰ)化合物用于抑制骨髓组织生成系统药物的制造。
全文摘要
本发明涉及具有血调节活性并能用来抑制人和动物骨髓组织生成系统的新的肽。
文档编号C07K7/02GK1088935SQ9310047
公开日1994年7月6日 申请日期1993年1月2日 优先权日1993年1月2日
发明者P·K·巴特纳加, W·F·哈夫曼 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司
技术领域：
本发明涉及具有血调节活性并能用来抑制人和动物骨髓组织生成系统的新的肽。
种种调节信使和修饰基因起着骨髓组织生成的调节作用，例如菌落刺激因素、干扰素、和各种肽。下列文献报导，成熟粒细胞提取物在盖玻片培养中能特别地抑制人鼠骨髓组织生成细胞增生，参见Metcalf，Cell，43∶5(1985);Baserga R.，Foa P.，Metcalf D，Polli EE(eds)，Biological Regulation of Cell Proliferation (1986);Nicola et al.，J.Cell Physiol.128∶501(1986)，Zoumbos et al.，Proyr.Hemat.1∶341，14∶201(1986);Werner et al.，Experientia 42∶521(1986)，Rytomaa和Kivieniemi Cell Tissue Kinet 1∶329-340(1968);Rytomaa et al.，Control of Cellular Growth in Adult Organisms pp 106-138(1967)随后，它们证实了分子量小于3000道尔顿的因子能够导致可移植大鼠粒细胞白血病的消退，并能够抑制人的白血病细胞的生长。Paukovits等人从大鼠骨髓细胞中提取了类似的因子，并且证明了它抑制骨髓细胞滴定胸苷的摄入，参见Paukovits W.R.，Cell TissueKinet 4∶538-547(1971);Naturforsch 37∶1297(1982)，1979年Boll等人，Acta Haematologica 6∶130(1979)证实了大鼠粒细胞提取物对培养中的人的骨髓细胞的抑制效应，许多其它研究者证实了该粒细胞提取物粗品抑制啮齿动物骨髓细胞在体外产生g-CFUC和/或gm-CFUE。
该生物药剂被称为粒细胞抑素，从理论概念上说，它应当是一种分泌时在相同组织中作用的内生细胞增生抑制剂。由提取物粗品得到的材料是非种特异性的，但是高度组织特异性的。此外，还发现它是无毒的并具有可逆活性。
1982年，有人报导了一种在体外和体内都对骨髓组织生成细胞具有选择性抑制疚的合成血调节五肽，其中主要效应似乎是对于骨髓组织生成系细胞(CFU-gm)，参见Paukovits等人，Z.Naturforsch 37∶1297(1982)和美国专利4499081号。该肽被认为与天然存在的粒细胞抑制因子类似，天然存在的粒细胞抑制因子被发现微量存在于骨髓提取物中。
现在，我们从试管试验发现了某些对于骨髓组织生成细胞具有选择性抑制效应的合成肽。通过抑制细胞生成和尤其是粒细胞生成，这些肽趋于阻止非活动性细胞进入细胞分裂，从而易受到细胞毒性抗癌药的进攻。这些肽除了在采用细胞毒性药的治疗中提供保护功能之外，还可以用来阻止与骨髓组织生成系统有关的癌细胞增生，即骨髓白血病。
本发明包括用下文式(Ⅰ)表示的肽，它们具有血调节活性，可用来抑制血细胞生成。
该肽可用于放射和/或细胞素毒性药物治疗中，提供保护功能，还可以用来阻止与骨髓组织生成系统有关的癌细胞的增生，例如用来治疗骨髓白血病。该肽还可用于许多需要改变红细胞生成作用的临床情况。
该化合物也可与共同未决的美国专利申请071547730号(本文引为参考文献)所述的二聚体结合使用，在骨髓细胞中提供高低交替的活性峰。从而增加血细胞生成的自然24小时节律。这样，细胞生长抑制剂治疗便可以在低骨髓活性周期中进行，从而降低了骨髓损伤的危险，而再生将被后续的活性峰所促进。本发明也是一种药用组合物，它包括式(Ⅰ)化合物和药学上可接受的载体。
本发明还包括抑制动物(包括人)骨髓组织生成系统的方法，它包括给予需要治疗的动物以有效量的式(Ⅰ)化合物。
本发明肽可用式(Ⅰ)表示
式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸;
B是丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、胱氨酸或酪氨酸;
C是天冬氨酸或谷氨酸;
D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸或β丙氨酸;
X是酪氨酸或赖氨酸;
n是0或1;
E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或羧酸胺或其羟甲基衍生物。
R1，R4和R5各自是氢，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基;
R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基;
R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl;假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys;或其药学上可接受的盐。
本发明还包括本发明化合物的药学上可接受盐的复合物。应当注意到，式(Ⅰ)中E包括氨基酸或羧酰胺残基的终端羧基或其羟甲基衍生物，所述氨基酸是指甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、对氨基苯基丙氨酸，或者，E是-N(R1)-R2R3基团的酰胺基。
此处采用本领域常用的缩写和符号来描述肽ala＝丙氨酸pGlu＝焦谷氨酸Pro＝腈氨酸Glu＝谷氨酸Asp＝天冬氨酸Tyr＝酪氨酸Pic＝吡啶甲酸Ppc＝L-2-哌啶酸Abu＝氨基丁酸Ppg＝炔丙基甘氨酸Gly＝甘氨酸Orn＝鸟氨酸P-(NH2)Phe＝对氨基苯基丙氨酸Hna＝2，6-二氨基-4-已酸Lys＝赖氨酸Cad＝尸胺根据常规的表示方法，氨基末端在左边;羧基末端在右边。所有手性氨基酸可以是D或L绝对构型。
氨基末端可通过乙酰化保护。保护基团的例子有叔丁氧羰基(t-Boc)、CH3CO和Ar-CO(Ar＝苄基或苯基)。
C-末端可以是羧基(像天然氨基酸一样)或羧酰胺(
)或羟甲基(-CH2-OH)。
优选的化合物是那些其中
A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;
B是谷氨酸或丝氨酸;
C是天冬氨酸;
D是氨基丁酸;
E是甘氨酸或赖氨酸;和n是0;
的化合物，并且手性氨基酸是L绝对构型。
特别优选的是pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)和Pic-Ser-Asp-Abu-Lys。本发明肽可采用固相技术[Merrifield，J.Am.Chem.Soc.85，2149(1964)]制备，或者可成功地采用本领域公知的溶液方法制备。下列文献提出了肽合成的一般方法，参见J.M.Stewart，J.D.Young，"Solid Phase Peptide Synthesis"，Pierce Chemical Company，Rockford，IL(1984)，M.Bodansky，Y.A.Klauser，M.A.Ondetti，"Peptide Synthesis"，John Wiley& Sons，Inc.，New York，NY.(1976).
它们可用来制备本发明肽，并作为参考文献并入本文。
每种氨基酸或肽都按照肽领域公知的方法予以适当保护。例如用α-氟烯基甲氧基羰基(α-fluoroenylmethyloxycarbonyl，Fmoc)或叔丁氧羰基(t-Boc)来保持氨基较好，尤其在α位置。可将适当取代的苄酯基用于赖氨酸的ε-氨基和将适当取代的苄基分别用于Asp和Glu的β和γ羧基。苄酯基保护基团的适当取代是氯、溴、硝基或甲基的邻和/或对位取代，并用来改进保护基团的反应性。除叔丁氧羰基外，保护基团最好是那些不会被温和酸处理除去的基团。这些保护基团可用本领域公知的方法(例如催化氢化、液氨钠处理或HF处理)除去。
如果采用固相合成方法，则肽便由羧基末端开始顺序向肽的氨基末端联结而建立。固相合成由被护氨基酸与适当树脂的共价联结C末端开始，所述适当树脂的例子有二苯甲基胺树脂(BHA)、甲基二苯甲基胺树脂(MBHA)或氯甲基树脂(CMR)(均在美国专利4244946中一般性地提出)或苯基酸氨基甲基树脂(PAM)。如果欲使产物肽的羧基末端为羰酰胺的话，则应采用BHA或MBHA载体树脂。如果欲使产物肽羧基末端为羧基的话，则一般应使用ACMR或PAM树脂，尽管也可以用它来制备羧酰胺或酯。
α-氨基上的保护基团可通过温和的酸(即三氟乙酸)处理而除去。采用本领域公知的适当的去保护、中和和偶联环化方法不必分离中间产物，将氨基酸顺序加上，直至形成期望的肽。完成的肽可随后解封闭和/或以任何顺序与载体树脂分离。
用HF或HBr/乙酸处理树脂承载的肽使得肽与树脂分离，产生作为羧酸或羧酰胺的羧基末端氨基酸。
如果希望得到酯，可在三乙胺存在下用适当的醇(例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或苄醇)处理CMR或Pam树脂，使得肽从树脂上解离，直接制得酯。
本发明肽的酯还可以按常规方法由羧酸前体制得。通常在酸催化剂存在下，用醇处理羧酸。或者，可将羧酸转化为活化的酰基中间体，例如酰囟，再用醇处理，最好在碱存在下处理。
将肽从载体树脂中解离的较好的方法是在适当的阳离子清除剂(例如苯甲醚或二甲氧基苯)存在下，用无水HF处理树脂承载的肽。这一方法在除去所有保护基团(只有硫代烷基保护的硫例外)的同时，将肽从树脂中解离。用该方法从CMR和Pam树脂中水解的肽是羧酸，从BHA树脂分解得到的是羧酰胺。
肽末端氨基的修饰可按照本领域公知的方法进行烷基化或酰化。这些修饰可以在氨基酸进入肽之前进行，或者在肽被合成且末端氨基被释放之后，但在保护基除去之前对肽进行修饰。
通常，对游离氨基的酰化是在叔胺存在下，用相应烷基或芳基酸的酰囟、酸酐或活化酯进行的。一烷基化最方便的方法是在温和的还原剂(例如氰基硼氢化钠或氰基硼氢化锂)存在下，用适当的脂肪醛或酮将氨基还原烷基化。在碱存在下，用过量的烷基囟化物处理氨基可进行二烷基化。
肽的溶液合成是采用常规的用来生成酰胺键的方法进行的。通常可在催化剂[例如1-羟基苯并三唑(HOBT)或二甲基氨基吡啶(DMAP)]的存在下，用适当的偶合剂[例如N，N′-二环已基碳化二亚胺(DCC))]将带有游离羧基的保护的叔丁氧羰基氨基酸偶联到带有游离氨基的保护的氨基酸上。其它合适的方法有，例如生成保护的叔丁氧羰基氨基酸的游离羧基的活化酯、酸酐或酰囟，随后，可在碱存在下，与保护的氨基酸的游离胺反应。例如，在碱[如N-甲基吗啉，DMAP(二甲基氨基吡啶)或三烷基氨]存在下，在无水溶剂[如二氯甲烷或四氢呋喃(THF)]中，用氯甲酸异丁酯处理保护的丁氧羰基氨基酸或肽，生成“活化酸酐”，随后将其与另一保护的氨基酸或肽的游离胺反应。采用常规技术，可使得用该方法生成的肽在氨基或羧基末端选择性地去保护，并采用类似技术将其偶联在其它肽或氨基酸上。肽完全后，要采用前述方法除去保护基团，例如在钯或铂催化剂存在下氢化，在液氨、氢氟酸或碱中用钠处理。
如果最终的肽在去保护后含有碱性基团，便可制备酸加成盐。肽的酸加成盐是按标准方法，在适当溶剂中由固体化合物和稍微过量的酸制备的。所述酸的例子有盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、乙酸、马来酸、琥珀酸或甲磺酸。乙酸盐形式特别有用。如果最终的肽含有酸性基团，则可制备阳离子盐。通常用稍微过量的含有适当阳离子的碱性试剂(例如氢氧化物、碳酸盐或烷氧化物)处理母体化合物。像Na+，K+，Ca++和NH+4之类的阳离子是药学上可接受盐中阳离子的例子。Na+和NH+4特别优选。
一般来说，为了产生抑制效果，将本发明肽向患者给药时，每70Kg体重注射日剂量范围是约0.5ng至约10mg，例如约5-500ng，口服日剂量范围是约50ng至约5mg，例如约0.1ng至1mg。如果采用灌注或类似方法给药，剂量范围是每70kg体重约0.005ng至约10mg，例如约0.03ng至1mg，连续6天。原则上最好使患者的细胞外流体的肽浓度为约10-15M至约10-5M。
本发明还有一个特征是提供包含上面定义的一种或多种式(Ⅰ)化合物或其生理学上可接受的盐作为活性成分以及药用载体或赋形剂的药用组合物。本发明组合物可以是例如适于口服、经鼻、非肠道或直肠给药的形式。
此外所用的术语“药用”包括本发明的兽医应用。本发明肽可制成胶囊剂、片剂或制成乳剂或糖浆供口服。可加入药学上可接受的固体或液体载体以增强或稳定组合物，或使组合物便于制剂。液体载体包括蜂密、花生油、橄榄油、甘油、盐水和水。固体载体包括淀粉、乳糖、二水硫酸钙、白土、硬酯酸镁或硬脂酸、滑石粉、果胶、阿拉伯树胶、琼脂或明胶。载体还可以包括缓释物质，例如甘油-硬酯酸酯或甘油二硬脂酸酯，可单独或与腊一起使用。固体载体的量可以变化，但最好是每单位剂量在约20mg至约1g之间。药用制剂是按照制药的常规技术制备的，包括必要时经研磨，混合、刺粒和压制，制得片剂;或者研磨、混合、填装制得硬明胶胶囊。例如，将活性成分与惰性载体例如乳糖或山梨醇混合，将混合物装入明胶胶囊便可制得含一种或多种活性成分的胶囊剂。使用液体载体时，制剂将是糖浆、酏剂、乳剂或水性或非水混悬液的形式。这样的液体制剂可直接口服或装入软明胶胶囊中。也可使用器官特异性载体体系。
或者，本发明肽或其衍生物的药用组合物也可制成冻干粉的溶液，供非肠道给药用。粉剂在使用前可加入适当的稀释或其它药学上可接受的载体而改变组成。液体制剂通常是缓冲的等渗的水溶液。适当稀释剂的例子是标准等渗盐水液、标准5%葡萄糖水溶液或缓冲的乙酸钠或乙酸铵溶液。这样的制剂特别适合于非肠道给药，但亦可用于口服给药和装入计量剂量吸入器或喷雾器中供吹入用。最好再加入赋形剂，例如聚乙烯基吡咯烷酮、明胶、羟基纤维素、阿拉伯树胶、聚乙二醇、甘露糖醇、氯化钠或柠檬酸钠。
就直肠给药而言，可将研磨的本发明肽粉末与赋形剂(例如可可油、甘油明胶或聚乙烯醇)混合，然后模制成栓剂。研磨的粉末也可与油状制剂、凝胶、膏剂或乳剂混合，使之成为缓冲液或非缓冲液，并经皮给药。
鼻用喷剂可类似地制成水溶液，装入带有气雾推进剂或带有手压装置的喷雾容器中。
含有本发明化合物的剂量单元最好含1mg-100mg，例如，含0.1-50mg式(Ⅰ)肽或其盐。
本发明还有一个特征是提供抑制骨髓组织生成的方法，它包括给予宿主以有效量的上述定义的药用组合物。
按照本发明，服用本发明化合物时不会产生不可接受的毒性效应。
生物检定A.体外血细胞生成检定下述体外检定系统能够定量本发明化合物对粒细胞-巨噬细胞先组细胞(CFU-GM)在体外脉冲暴露后进入细胞循环的正向或逆向效应。在有适当血细胞生成因素存在的温和的琼脂培养条件下，粒细胞和巨噬细胞菌落可加以定量，并且可特别地由单CFU-GM的增生而产生。为了增生，CFU-GM必须进入细胞循环的S期。在用软琼脂培养前，将骨髓细胞暴露在3H-胸苷中消除了那些活性增生即在细胞循环的S-期的CFU-GM。该效应通过在琼脂检定中定量的总体CFU-GM菌落的减少而定量。与对照物相比，菌落数的减少或增加的程度分别提供了CFU-GM增生的刺激或抑制指数。
方法取股骨髓细胞，以6-9×106细胞/ml的浓度混悬于McCoy氏培养基，该培养基中还补充有10%胎牛血清、抗菌剂、必要的和非必要的氨基酸、MEM维生素、丝氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丙酮酸钠和碳酸氢钠。用1pg-1mg/ml最终浓度的本发明化合物将复制培养物博动2小时，并在7%CO2气氛在温湿空气中于37℃保温。保温后，用检定介质将培养物洗三次以除去肽，在560μCi的3H-胸苷(放射强度率＝20Ci/mMole)中暴露20分钟。暴露后，向每只试管中加0.5ml冷胸苷(1mg/ml贮存液)以停止反应。将培养物洗三次并置于CFU-GM琼脂检定中，浓度为每个处于上述介质中的培养物75000个细胞，并且含有被暴露在作为血细胞生成因子源的商陆分裂素中的脾细胞调节的0.3%琼脂和10%V/V介质。将培养物于37℃，7%CO2的湿气中保温5-7天，用显微镜将CFU-GM菌落计数。S-期的CFU-GM的百分数通过将3H-胸苷处理过的培养物菌落数目除以未处理的对照培养物菌落数目而得到。将这些值与由肽暴露的和未处理的细胞类似算得的数字比较。
B.过氧化物形成的测定多形核白细胞嗜中性白细胞(PMN)是抵抗包括C.albicans在内的许多病原体入侵的第一道防线。由治疗动物的体外PMN念珠菌活性的检定在测定C.albicans动物模型中治疗化合物的反应模式方面非常重要。在活化的PMN的呼吸突发中，氧还原的主要初始产生是过氧化物，而在呼吸突发中产生的各种氧基团对于入侵病原体是直接或间接细胞毒性的。因此，在刺激期间过氧化物生成和释放的测定对于吞噬细胞的氧化代谢和随后的杀灭有效性是重要的。
将化合物或对照物给予正常小鼠，每天腹膜内给药7天。从各个治疗动物身体收集周围血液并加以混合。用标准分离方法纯化PB-PMN(参见(Boyum，A.1968."Isolation of mononuclear cells and granulocytes from human peripheral blood" Scand.J.Clin.Lab Invest.21∶77-89);
来自各不同组的细胞混悬液被规格化成含等量PMN/ml。就念珠菌检定而言，向一式四份含C.albicans酵母和10%标准小鼠血清的平衡盐溶液的试管中加入足量PB-PMN，使最终E∶T比值为10∶1。在对照试管中不加PB-PMN。将试管于37℃保温1小时。将巨噬细胞溶解，等分置于琼脂板上，将板保温48小时，这时将菌落形成单元(CFU)计数，并测定每个试样中CFU减少的百分数。
过氧化物歧化-可抑制过氧化物阴离子产生是在微量滴定计亚铁细胞色素C还原检定(1.5×105PB-PMN/池)中定量的，定量是在暴露于可溶性和颗粒状刺激物(相应为12-肉豆蔻酸13-乙酸大戟二萜醇酯(PMA)和血清调理的C.albicans)期间，在0.5%凝胶/平衡盐溶液中进行的。经1小时保温后，测定亚铁细胞色素C还原的摩尔数/池(四等份池/收集组)。在无任何刺激物的情况下测定过氧化物活性基线。在数据计算前，将PMA和Candida刺激活性修正，供自发产生过氧化物。每一治疗组的PB-PMN数据均表示为对照过氧化物的百分数，其中对照活性是从PBS/血清治疗的小鼠的PB-PMN观察到的。
下述实施例用来说明本发明。这些实施例决无限制本发明范围之意，只是用来说明如何制造和使用本发明化合物。
在实施例中，所有温度均为摄氏度。氨基酸分析在Dionex Autoion 100上进行。肽含量分析基于氨基酸分析。FAB质谱是在VGZAB质谱仪上用快速原子轰击进行的。所用缩写如下Abu＝氨基丁酸Ala＝丙氨酸Asp＝天冬氨酸t-Boc＝叔丁氧羰基Cad＝尸氨酸Cl-Z＝对氯苄氧羰基(乙＝苄氧羰基)DCC＝二环已基碳化二亚胺DCM＝二氯甲烷DIEA＝二异丙基乙胺EDC＝(N-乙基-N′-)3-二甲氨基丙基)碳化二亚胺Glu＝谷氨酸P-Glu＝焦谷氨酸Tyr＝酪氨酸Hna＝二氨基已酸HOBT＝羟基苯并三唑Lys＝赖氨酸NMP＝N-甲基吡咯烷酮Pic＝吡啶甲酸Pro＝脯氨酸Ppg＝炔丙基苷氨酸Gln＝谷酰胺
Gly＝甘氨酸Orn＝鸟氨酸实施例1(PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys)(SEQ ID NO. 1)C24H38N6O11M.W.585.6将800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.5mM，取代＝0.63mM/g)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。(Applied Biosystems型431A肽合成器用户手册，1-30版，1987年2月，分节号000066)。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.665g)，将肽树脂(1.2g)装入一解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用冰乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到220mg肽粗品。经柱(C-18“Bond Elute" 柱)色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(130mg)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.98(2)，Abu 1.12(1)，Lys 1.06(1)FAB/MS MH+587.5实施例2(Pic-Glu-Asp-Abu-Lys)C25H36N6O10M.W.580.6将800mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.5mM，取代＝0.63m/M/g)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.665g)，将肽树脂(1.2g)装入-HF解离装置中，用10mlHF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用冰乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到251mg肽粗品。经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(141mg)。(HPLC纯度97%)。
氨基酸分析Asp 1.0(1)，Glu 1.03(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未测到PicFAB/MS 581.1实施例3(Pic-Ser-Asp-Abu-Lys)C23H34N6O9M.W.538.56将850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.56mm树脂)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.038g)，将肽树脂(1.03g)装入-HF解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用三氟乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分三氟乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到298mg肽粗品。经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(178mg)。(HPLC纯度97%)氨基酸分析Asp 1.0(1)，Ser 0.88(1)，Abu 1.12(1)，Lys 1.17(1).
氨基酸分析未测到Pic实施例4(PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys)(SEQ ID NO1)C33H47N7O13 M.W.749.77将850mg BOC-Lys(Cl-Z)-PAM树脂(0.56mM)装入一个ABI型430A肽合成器中。按照制造商所建议的标准协议，每种氨基酸用2mM，合成了目标肽。合成完全后，用DCM洗涤树脂肽并干燥之(1.353g)，将肽树脂(1.3g)装入-HF解离装置中，用10ml HF和1ml苯甲醚于-15℃解离2小时。除去HF后，用乙醚将树脂充分洗涤，用三氟乙酸提取肽。用旋转蒸发器除去大部分三氟乙酸，残余物用水稀释并冷冻干燥。得到454mg肽粗品。将肽粗品(204.7mg)经C-18“Bond Elute”
柱色谱提纯，用乙腈/水/三氟乙酸(TFA)缓冲液洗脱，得纯肽(95.2mg)。(HPLC纯度90%)。
PGlu+Glu 2.02(2)，Asp 1.0(1)，Tyr 0.94(1)，Lys 1.03(1)实施例5-11按照上述方法制备了下列肽实施例
5 P-Glu-Glu-Asp-Cys-Gly-OH6 PGlu-Glu-Asp-Ser-Gly7 Pic-Glu-Asp-Abu-Lys-OH8 Pic-Ser-Asp-Abu-Lys-OH9 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-OH10 PGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys-OH11 PGlu-Glu-Asp-Abu-Lys-Tyr-OH实施例12包含本发明化合物的药用制剂可制成多种形式，并且可含有众多的赋形剂。所述制剂的实例如下片剂/成分每片1.活性成分(式Ⅰ化合物) 40mg2.玉米淀粉 20mg3.藻朊酸 20mg4.藻朊酸钠 20mg5.硬脂酸镁 1.3mg2.3mg制片剂方法第一步将成分No.1，NO.2，No.3和No.4在适当的混合器/搅切器中混合第二步分次向第一步的混合物中加入足够的水，每次加水后都仔细混合。如此加水和混合，直至得到能制成湿颗粒的均匀物料。
第三步将湿物料通过8目(2.38mm)网筛的振荡制粒器。
第四步将湿粒在140°F(60℃)烘箱中烘干，直至干燥。
第五步用成分No.5润滑干燥的颗粒。
第六步将经润滑的颗粒在适当的压片机上压片。
非肠道制剂将适量式Ⅰ化合物在加热下溶于聚乙二醇中，可制得非肠道给药的药用组合物。然后用Ph Eur.注射水稀释(至100ml)。然后用0.22微米膜过滤消毒，并密封在消毒容器中。
权利要求
1.式(Ⅰ)化合物及其药学上可接受的盐的制备方法，式(Ⅰ)如下式中A是吡啶甲酸、焦谷氨酸、脯氨酸或L-2-哌啶酸；B是丝氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、苏氨酸、胱氨酸或酪氨酸；C是天冬氨酸或谷氨酸；D是氨基丁酸、丙氨酸、炔丙基甘氨酸、甘氨酸、丝氨酸、胱氨酸或β丙氨酸；X是酪氨酸或赖氨酸；n是0或1；E是-N(R1)-R2R3或E是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或羧酰胺或其羟甲基衍生物。R1，R4和R5各自是氢，C1-5烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基；R2是C1-6烷基、苯基、萘基或C5-7环烷基；R3是-NR4R5或吖丙啶基、吡咯烷基、咪唑基、吡咯基、哌啶基、哌嗪基、吗啉基、吡咯烷基或Pyrralinyl；假定式(Ⅰ)化合物不是P-Glu-Glu-Asp-Cys-Lys；该方法包括a)将被护氨基酸偶合，以形成下式的适当保护的化合物式中A、B、C、D、X和n的定义如上，[E′]是氯甲基、甲基二苯甲基胺、二苯甲基胺或苯基乙酰胺基甲基树脂，或者E是-N(R1)-R2R3或者是甘氨酸、赖氨酸、鸟氨酸、酪氨酸、对氨基苯基丙氨酸或它们的羧酰胺或羟甲基衍生物；b)除去保护基团，必要时将肽从树脂中离解；并且c)可制成其药学上可接受的盐。
2.按权利要求1的方法，其中A是焦谷氨酸或吡啶甲酸;B是谷氨酸或丝氨酸;C是天冬氨酸;D是氨基丁酸;E是甘氨酸或赖氨酸且n是0。
3.按权利要求1或2的方法，其中手性氨基酸是L绝对构型。
4.按权利要求1的方法，其中n是1，E是甘氨酸或赖氨酸。
5.按权利要求1的方法制备下列化合物之一;pic-Glu-Asp-Abu-LyspGlu-Glu-Asp-Abu-Tyr-Lys(SEQ ID NO2)pGlu-Glu-Asp-Abu-Lys(SEQ ID NO1)Pic-Ser-Asp-Abu-Lys
6.将权利要求1定义的式(Ⅰ)化合物用于抑制骨髓组织生成系统药物的制造。
全文摘要
本发明涉及具有血调节活性并能用来抑制人和动物骨髓组织生成系统的新的肽。
文档编号C07K7/02GK1088935SQ9310047
公开日1994年7月6日 申请日期1993年1月2日 优先权日1993年1月2日
发明者P·K·巴特纳加, W·F·哈夫曼 申请人:史密丝克莱恩比彻姆公司
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