商标分类 
商标转让 
您当前的位置： 丙型肝炎检查用试剂及检查方法
2021-02-01 16:02:56|
400|
起点商标网 专利名称：丙型肝炎检查用试剂及检查方法
技术领域：
本发明涉及丙型肝炎检查用试剂及检查方法。据最近研究，日本国内非甲非乙型肝炎患者估计约为200万人，其中丙型肝炎占90-95%。
成为丙型肝炎病因的病毒(以下简称为HCV)其构造被逐渐阐明，最近以检查HCV抗体(对HCV的抗体)存在与否为目的的试剂亦出现若干种市售品。
迄今为止实用化的HCV“标志”(marker)，已知有C-100-3抗原，相当于HCV的非结构区NS-3-4的一部分(SCI-ENCE244;359-362，1988)。由于使用C-100-3抗原为HCV标志，在世界上首先实现HCV抗体的分析。但以C-100-3抗原来筛检HCV感染者时，其阳性率为约70%，引起所剩30%成为假阴性的问题;另一方面亦有下述报告用C-100-3抗原所制的HCV抗体检出用ELISA(酶联免疫吸附试验，即一种利用酶连接免疫吸附剂的酶免疫测定)试剂盒实际筛检输血用血液时的阳性率达约1.5%，其中约半数为假阳性。
以后，有人提议，使用HCV核心区为抗原以提高HCV抗体检出率(查出率)，使感染得到早期检查。利用核心区蛋白抗原而制成的HCV抗体检出用试剂盒已被研究出若干种，相对于上述利用C-100-3抗原的试剂盒，被称为第二代试剂盒。有人尝试在核心区蛋白中设定一个相当于抗原决定基部分的合成肽，对此组合成相当于上述非结构区NS-3-4区中二个抗原决定基的合成肽，用以检出HCV抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88;3647-3651，1991)。照此方法，虽然特异性(专一性)可提高至高于利用C-100-3抗原的HCV标志，但由于它只准备一个在核心区的抗原决定基，因此无法检出对其他抗原决定基所产生的抗体，从而不能获得充分的检出率。
日本专利特开平3-139282号公报揭示若干与核心区的抗体有反应性的抗原决定基，虽然尚未达到实用化。将这些抗原决定基复合利用时或许可提高抗体的检出率，但可预料其特异性降低，且在经济上亦不利。
另一方面，迄今在HCV抗体检出上所利用的肽，由基因重组所获得者较多，因此有易于显现非特异反应的倾向。例如上述C-100-3抗原是利用它与超氧物歧化酶(以下简称为SOD)的融合蛋白而表达的基因重组产物，因此为了检查因对SOD部分反应而产生的假阳性，必须用免疫斑点法等进行追加试验，否则无法有效检出HCV抗体。
而且，若使用以T-7噬菌体媒介，由ARIMA＃14(后述)(其一部分与HCV核心区相似)表达所得的融合蛋白为抗原时，T-7噬菌体蛋白的抗体引起假阳性反应。在这种情况下，用T-7噬菌体蛋白来吸收非特异反应，以降低假阳性。
因此，使用基因重组所得的肽为抗原来筛检抗体时，必需对非特异反应有特殊的考虑。就目前情形而言，对付这样的非特异反应需要特殊操作，并且效果也多不足。从而需寻求一种对HCV抗体有高度反应性同时维持充分特异性的抗原。另一方面，除了上述起因于融合蛋白属性的非特异反应问题外，亦有基于抗原抗体反应的本质问题。即如前所述，若仅用在HCV核心区的一个抗原决定基作抗原，则会降低HCV抗体检出率，而利用复合抗原时虽然可提高检出率，却会增大非特异反应。一般而言，在利用某一抗原以检出抗体时，若为提高检出率而使用高反应性抗原，则易于随着反应性的提高使非特异反应增加而造成特异性降低(所谓“测量过度”(包含不应测出的测定值);反之，若提高抗原的特异性，可检出的抗体则减少(所谓漏检)。可满足这样相反条件的适当抗原目前尚未被人所知。
鉴于已有技术的上述情况，本发明的目的在于提供一种实用性强的检查用试剂，该试剂的肽所含氨基酸数目及肽的种类虽少，但却不必牺牲特异性即可提高HCV抗体检出率。
本发明的目的还在于提供检查方法。
本发明的目的可用下述手段来完成。即本发明为一种丙型肝炎检查用试剂，包括含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的一种或多种肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
本发明又是一种适于丙型肝炎的检查方法，即检出对于以下任一种肽具有反应性的抗体，这些肽是含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的一种或多种肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
各氨基酸的缩写分别代表以下氨基酸Ala丙氨酸Leu亮氨酸
Arg精氨酸Lys赖氨酸Asn天冬酰胺Met甲硫氨酸Asp天冬氨酸Phe苯丙氨酸Cys半胱氨酸Pro脯氨酸Glu谷氨酸Ser丝氨酸Gln谷氨酰胺Thr苏氨酸Gly甘氨酸Trp色氨酸His组氨酸Tyr酪氨酸Ile异亮氨酸Val缬氨酸在序列1的10个氨基酸中，Xaa为任选的氨基酸，其选择自由度较大。其他部分的氨基酸在序列未被特定时并未显示高抗原性，但在Xaa部分存在某种程度的容许范围。例如在日本专利特开平3-139282号公报所发表的HCV核心区相当于序列1的部分序列中，Xaa为Leu，但在依照本发明的序列1中，Xaa不限于Leu，即使Lys，Arg亦显示高抗原性。更确切地说，Lys比Leu更合适。
本发明序列1-3所示肽的氨基酸序列虽然比公知(例如日本专利特开平3-139282号公报)的序列短得多，却显示与HCV核心区实际上1-3个抗原决定基相同的抗原机能。即利用HCV核心区中的一个序列(对应于序列1)、二个序列(序列1+序列2或3)或三个序列(序列1+2+3)抗原决定基构造的特定部分序列，将相应的肽用作抗原，可达到特异性与反应性的相容共存，即解决抗原抗体反应检出法的本质问题。又因不使用融合蛋白，从而可减少非特异反应。
以下详述本发明。本发明所需要的肽可利用化学合成品。含有序列1的肽可以举出序列1中添加数个-20个左右任选的氨基酸，或如后所述以间隙分子或载体蛋白修饰的肽。对序列1添加任选的氨基酸可分别对序列1的N末端、C末端单独施行。例如亦可以参照与序列1相对应的HCV核心区的若干公知序列而选定。但不限于这类公知序列。至于其他方法，例如亦可以使序列2或3所表示的肽与序列1的肽连接。在将序列1的肽与序列2或3连接时，在维持反应性上较佳的是，通过数个-20个左右任选的肽或后述载体蛋白等在氨基酸上予以结合。当然亦有可能仅由含序列1的肽来构成本发明。
其次，将序列1与序列2和/或序列3的肽予以组合，亦即在互相不连接而呈混合状态下同时用作抗原时，可获得比序列1或含它的肽单独使用时更好的结果。因为仅用一种肽有时出现检出率降低。在利用肽组合的情况下，最好能使序列1的肽与序列2和/或序列3的肽的用量比率为1∶2-2∶1。而且，在序列1与序列2、3组合使用时，最好分别结合载体蛋白或其他任选的肽等，然后再混合使用。关于这一点说明如下即序列1的Xaa可采用任选的氨基酸，因此可认为每一不同的Xaa拥有不同的抗原决定基，而Xaa不同的多种序列在Xaa以外的氨基酸序列共同的情况下可能具有不同的抗原决定基，因此与其使用多种序列1，不如合并使用互相在对应抗原决定基上显然不相同的序列1与序列2，这样容易提高检出率。但这并不排除多种序列1的使用，因为它有时可能有效。
本发明使用的肽，虽然可将肽分子直接利用于抗原抗体反应，但若预先使它与间隙分子或载体蛋白结合，则有可能生成反应性更优的试剂。例如使4-(N-顺丁烯二酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸磺丁二酰亚胺酯(以下简称为Sulfo-SMCC)、6-〔3-(2-吡啶二硫)丙酰胺〕己酸磺丁二酰亚胺酯(以下简称为Sulfo-LC-SPDP)、N-(ε-顺丁烯二酰亚胺己酰氧)丁二酰亚胺(以下简称为EMCS)等间隙分子共价结合于肽的N末端时，该肽与抗体的反应性则提高。
若通过此间隙分子使肽与人血清白蛋白(以下简称为HSA)、牛血清白蛋白(以下简称为BSA)等非活性载体蛋白结合，则可获得更好的结果。使肽与载体蛋白结合时，除肽侧的间隙分子外，亦可以在载体蛋白侧预先导入间隙分子。为了能尽量减少非特异反应，用作载体蛋白的蛋白最好能用从实际受试动物得到的蛋白。即若以人血清为试样，则宜使用HSA。
本发明有关的肽或其修饰物可以所适用的免疫分析系的形式提供。例如在抗原与固相树脂珠或容器壁结合的状态下与拟检出抗体进行反应的固相免疫测定法，是依靠物理吸附或化学结合使本发明有关的肽或其修饰物结合在固相载体上。在利用多种肽时，无论各肽以混合物同时结合于载体，或各肽各别结合于载体后再予以合并均可。这时，固相上的肽所捕获的HCV抗体可利用人·免疫球蛋白的抗体予以检出(“夹层技术”法)。作为人·免疫球蛋白的抗体，若使用能辨认“类别”(例如IgG，IgA，IgM……等)的抗体，则有可能按类别分开后检出HCV抗体。关于利用固相结合肽之免疫分析法，除了该夹层法外，还可举出一种利用标记抗体的竞争法(使标记抗体与待测抗体互相竞争的方法)。
在本发明中，所用抗原决定基实际上至多不过2个，所以在采用竞争法时有可能利用单克隆抗体作为标记抗体。在考虑固相上肽的配比及亲合力之下，将对所利用的肽有特异性的单克隆抗体适当混合于该肽，以用作标记抗体即可。
本发明有关的肽或其修饰亦可用作标记抗原。在这种情况下，可用(夹层法)固相化的人·免疫球蛋白的抗体或此抗体与(竞争法)固相化的HCV抗体组合起来构成免疫分析系。酶、发光物质、萤光物质、放射性同位素等公知物可被用作这种免疫分析系的标记物。通过适当的间隙分子、抗生物素-生物素结合等使这些标记物结合。
本发明有关的肽或其修饰物亦可与乳胶粒子等组合，以应用于粒子凝聚反应或凝聚抑制反应。
依照本发明的HCV检查用试剂或检查方法所需的包括稀释液，标记检出用基质，阳性对照物等各种成份，可适当地加以组合，以形成试剂盒的形式。例如将本发明有关的肽结合于固相树脂珠，并与标记的抗人IgG抗体组合，形成检定试剂盒。
本发明中含有序列-1的肽对HCV抗体有高度反应性，并且很难与其他抗体发生非特异性反应。该肽与序列-2和/或序列-3的肽组合时可进一步提高HCV抗体的检出率。本发明有关的肽为诸如从日本专利特开平3-139282号公报所示抗原决定基结构取出的部分序列或与它们有共同部分的序列。但比特开平3-139292号公报所示序列短很多，因此容易合成，又由于选择了对HCV抗体保持高度特异性的部分，因此可进行特异性很高的分析。
以下说明本发明的实施例。
实施例1.肽的合成用一肽合成装置(BIOSEARCH公司制造，9600型)合成依照本发明含有下述氨基酸序列的六种肽。序列1中Xaa为Leu、Lys、Arg的分别称为序列1a、1b、1c。序列1与其他氨基酸的结合点以·表示。
序列1aArgLeuGlyProArgLeuGlyArgArgPro序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys序列1a7(序列1a+7种氨基酸)ThrArg·ArgLeuGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaVal序列1b9(序列1b+9种氨基酸)ValValPro·ArgLysGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaValLys序列1c9(序列1c+9种氨基酸)ProThrArg·ArgArgGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaValLys合成按阶段性固相法进行。固相使用叔丁氧羰基氨酰基-4-(氧甲基)-Merrifield氏树脂(渡边化学工业公司制造)，氨基酸(L型)的氨基用叔丁氧羰基(以下称为t-BOC)加以保护。各氨基酸的侧链分别用下述保护基加以保护苏氨酸(Thr/T)、丝氨酸(Ser/S)邻苄基;
谷氨酸(Glu/E)γ-苄酯;
精氨酸(Arg/R);
-2-磺酰基;
赖氨酸(Lys/K)2-氯苄氧羰基，其他氨基酸的侧链无保护。
用三氟乙酸除去树脂上肽末端t-BOC氨基酸的t-BOC基后用N，N'-二异丙碳二亚胺使待偶联的下一个氨基酸的羧基活化，然后在室温下混合1-4小时以进行偶联反应。反应时间按氨基酸种类及组合情形而确定。未反应的游离氨基酸靠1-乙酰咪唑的乙酰化作用使之失活。
所需要的反应循环终了后，用三甲硅烷基三氟甲磺酸、苯基甲基硫醚、以及三氟乙酸去除保护基并使合成肽脱离树脂，用乙醚回收肽。所回收的肽用凝胶过滤予以粗提纯后，用ODS-80TM(含有水-乙腈、0.1%TFA)柱进行反相HPLC分析，分取其高峰流份。
实施例2.检查用试剂的配制(1)使用实施例1所合成的肽配制用于检测HCV抗体的五种试剂。试剂编号与所用序列编号的对应关系如下试剂-1a序列1a试剂-2序列2
试剂-3序列3试剂-1a7序列1a7试剂-1a7＊2序列1a7+序列2其中，序列2及序列3的使用目的在于观察序列2、序列3的单独效果，，为证实本发明试剂的效果供比较用。序列1a、1a7、2及3表示的肽由下述方法加以固相化。
用50mM碳酸缓冲液(pH9.6)使各合成肽抗原溶解至2.0μg/ml(若在2.0-5.0μg/ml浓度范围内，结果可获得相同的检出率)，按100μl分注于ELISA微量反应器(MAXISORPC12、Nunk公司制)的各孔中(每孔抗原量为0.2μg0.2μg/孔，以下同样)。
在4℃温度下静置一夜后，用洗涤液(含有0.05%吐温-20的10mM磷酸缓冲液，pH7.2)300μl洗3次后，干燥，获得按各序列的试剂。再使用序列1a7及序列2所表示的肽按1∶1互相混合，以相同的操作吸附于微量滴定板(分注浓度0.2+0.2＝0.4μg/孔)而获得试剂。
另一方面准备按顺丁烯二酰亚胺法用过氧化酶标记的抗人·免疫球蛋白G单克隆抗体(含有0.1%BSA的磷酸缓冲液，以下简称为POD标记抗IgG抗体)及由四甲联苯胺0.17mg/ml、0.015%过氧化氢、以及0.125M柠檬酸缓冲液(pH4.2)所组成的发色基质液。
实施例3.HCV抗体的检出(1)以被怀疑有HCV感染的血清检样(20例)及正常人血清检样(10例)为试样，用试剂-1a、试剂-1a7、试剂-2、试剂-3、及试剂-1a7＊2进行ELISA。另对由公知肽B-1及ARIMA＊14(以下简称为N-14)配制的试剂亦进行分析以作比较。其中B-1、N-14的抗原浓度为0.1μg/孔。上述序列1a等的抗原浓度为0.2μg/孔，双方的差异是最适抗原浓度(即不致引起敏感度降低的经济浓度)不同所致，但均按各抗原的最适条件来配制这一点是不变的。
B-1相当于文献(J.Virology，65/3，p1105-，1991年)，所记载的HCV结构区氨基酸序列中从N末端起算的第10个-第122个氨基酸序列的肽，而ARIMA＃14据报告是作为HCV结构区中抗原决定基(BIOmedica6(2)，p26-，1991)的肽。同时，将使用市售HCV抗体检出用试剂盒(利用C-100-3抗原)所得的分析结果进行比较。另外，对一部分血清检样用免疫斑点法追加试验市售试剂盒(“RIBATest”，ORTHODIAGNOSTICS公司制造，商品名)进行确证试验。其操作如下在抗原固相化板的各孔分别加入检样稀释液(0.05%吐温-20，0.125%NaN3，10mM磷酸缓冲液pH7.2)200μl及血清检样20μl，在25℃下反应1小时。反应完成后，除去反应液，用洗涤液(0.05%吐温-20，10mM磷酸缓冲液pH7.2)300μl，洗5次，分别加入POD标记抗IgG抗体100μl，于25℃下反应1小时。反应完成后，除去反应液，用洗涤液300μl洗5次，加入发色基质液100μl后，在25℃下反应30分钟，用2N硫酸终止反应，测定450nm吸光度。结果如表1所示(表中，以P表示试剂)。在表1中，与免疫斑点法追加试验结果(表中，以RIBA表示)相比较，在市售品(表中以“C-100”表示)中出现相当多的假阳性，但试剂-1a7及试剂-1a7＊2均与RIBA充分一致，证实本发明的试剂-1a7及试剂-1a7＊2检出率高。又发现试剂-2及3也具有基本相等的作用，但与含有序列1的试剂-1a、-1a7、-1a7＊2对照比较时，有漏检的情况(检样No16，17)，证明若单独使用序列2及3，有时会发生漏检。亦证明，与试剂-1a、-1a7相比，试剂-1a7＊2使检出率更为提高。而与B-1一致或不一致，这本身并不代表检查用试剂的好坏，但一般而言，被怀疑有HCV感染的检样当B-1呈阳性时，产生阴性反应的试剂可认为检出率低。基于这一观点，试剂-1a、-1a7、-1a7＊2优于试剂-2、3及-N-14。
然后，对于HCV阳性检样，试用序列1a7及序列2进行抑制试验。将固相化所利用的序列1a7及序列2的肽10μg加入检样稀释液(200μl)中，以观察试剂-1a7及试剂-2的反应变化。结果如表2所示，HCV抗体阳性检样由于添加序列1a7的肽10μg而被完全抑制，证实其特异性高。另在序列2中亦发现HCV抗体阳性检样完全被抑制。以此而言，其特异性亦高。
实施例4.试剂的配制(2)将各种交联剂导入实施例1所合成的肽，以此作为抗原来配制试剂。
(1)将各种交联剂导入合成肽;
(A)Sulfo-SMCC导入合成肽将Sulfo-SMCC(PIERCE公司制造)0.132mg与合成肽(序列1a7或2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后加以混合，将液量调整到0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(B)EMCS导入合成肽将EMCS(“同仁化学”公司制造)0.1mg溶于二甲基甲酰胺10μl，该溶液与合成肽(序列1a7或序列2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后加以混合，将液量调整至0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(C)Sulfo-LC-SPDP导入合成肽将Sulfo-LC-SPDP(PIERCE公司制造)0.15mg与合成肽(序列1a7或2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后予以混合，将液量调整到0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(D)DSS导入合成肽使DSS(PIERCE公司制造)0.2mg溶于二甲基甲酰胺50μl，与合成肽(序列1a7或2)0.5mg一起加入100mM磷酸缓冲液(pH7.5)0.15ml中，在40℃温度下搅拌8小时以进行反应后，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(2)固相化抗原的制备参照实施例2的方法制得导入上述(A)-(D)交联剂的各抗原实施例5.HCV抗体的检出(2)使用实施例4所制的试剂，试行HCV患者血清中抗体的ELISA法测定。同时进行上述实施例4所得各抗原的抑制试验。
(1)HCV患者血清中抗体的ELISA法测定使用上述实施例4(2)所制得的抗原固相化板，参照实施例3的方法测定HCV患者血清中的抗体。同时选择很多在肽单独时呈阴性(在B-1呈阳性)的检样，以观察交联剂的效果。
结果表示在表3及表4中。各合成肽的抗原性由于肽与交联剂结合而被增强，但增强效果按交联剂的种类而有所不同。Sulfo-SMCC、EMCS、以及Sulfo-LC-SPDP均显示同等程度有效，而DSS稍逊于前三者。尤其在导入有Sulfo-SMCC的序列1a7全然未发现任何漏检。而对于序列2，即使与交联剂结合亦无法完全防止漏检。一般而言，交联剂的增强效果在序列1a7表现得更显著。此外发现B-1抗体在阴性患者血清检样中与导入交联剂的抗原起反应的例子。
(2)抑制试验使用已导入Sulfo-SMCC的合成肽(序列1a7)测定抗体时，将合成肽、Sulfo-SMCC导入肽、Sulfo-SMCC、BSA(SIGMA化学公司制造)或B-1各10μg加入检样稀释液(200μl)中，观察反应的变化。结果列入表5。
结果，如检样N所示，B-1及导入Sulfo-SMCC的合成肽出现抑制，但合成肽本身或Sulfo-SMCC单独时未见抑制。由此证实，因交联剂的导入，使合成肽的反应性有明显的变化，而接近核心区全区域适用的抗原。
实施例6.试剂的配制(3)将实施例4所得导入各种交联剂的肽与载体蛋白结合作为抗原而进行试剂配制。
(1)Sulfo-SMCC交联剂导入肽抗原与载体蛋白的结合将BSA(SIGMA化学公司制造)或HSA(SIGMA化学公司制造)10mg溶于含有6M尿素的100mM EDTA溶液2ml中。加入正丁醇0.2ml及NaBH420mg，在25℃温度下搅拌30分钟后，滴加100mM NaH2PO41ml及丙酮0.4ml，以生成还原BSA溶液或还原HSA溶液。
在此溶液0.3ml中添加上述实施例4中被甘氨酸终止反应前的反应液(Sulfo-SMCC交联剂导入肽抗原，参照实施例4(1)(A))(0.1ml)，在4℃温度下搅拌8小时以进行反应后，添加50mMN-乙基顺丁烯二酰亚胺50μl以终止反应。然后用SEPHADEXG-50(PHARMACIA公司制造)进行纯化，获得结合于载体蛋白的Sulfo-SMCC交联剂导入合成肽(以下简称为BSA结合肽、HSA结合肽)。
(2)固相化抗原的制备参照实施例2的方法制成BSA结合肽、及HSA结合肽的固相化板。
实施例7.HCV抗体的检出(3)使用实施例6所制成的固相化板，参照实施例2的方法，将按B-1测定抗体结果显示阳性的HCV患者血清(54例)测定其中的抗体。结果列入表6。如表6所示，BSA结合肽与HSA结合肽均显示相同的结果。
表6BSA结合抗原HSA结合抗原肽阳性/检样阳性率(%)阳性/检样阳性率(%)序列1a753/5498.153/5498.1序列251/5494.451/5494.4同时，对于正常人血清，两者测定的结果如表7所示，BSA结合抗原出现约2%的非特异阳性，而HSA结合抗原并未出现非特异阳性。
表7BSA结合抗原HSA结合抗原肽阳性/检样阳性率(%)阳性/检样阳性率(%)序列1a77/2592.71/2590.39序列27/2592.71/2590.39此外，以同一方式用公知肽(B-1及N-14)试剂进行同一检样的分析，比较两者的结果。
实施例8.HCV抗体的检出(4)将实施例1所合成的序列1b9及1c9按实施例4及6诱导以下所示抗原(HSA结合抗原)，参照实施例2的方法将其在微量反应器(在孔中加样时抗原浓度为0.5μg/孔)敏化以试行被怀疑有HCV感染的患者检样(105例)中HCV抗体的检出(ELISA法)。结果列于表8，其总计数列于表9。
虽然有若干反应性差异，但确证具有大致相同的反应性。
序列1b9间隙分子(Sulfo-SMCC)-HSA(称为1b9-HSA)。
序列1c9间隙分子(Sulfo-SMCC)-HSA(称为1b9-HSA)。
表9被怀疑有丙型肝炎的105例检样(本发明品间的比较)
实施例9.HCV抗体的检出(5)分别准备序列1b9及序列3通过间隙分子(Sulfo-SMCC)与HSA结合的抗原。然后将它们按1∶1掺配以制备一试剂(称为P1b9＊3)，参照实施例2的方法使其在微量反应器(分注浓度0.5+0.5＝1.0μg/孔)敏化，以试行检测各种检样中的HCV抗体(ELISA法，一部分RIA法)。另外以同一方式用公知肽(B-1及N-14)的试剂进行上述各种检样的分析，比较两者的结果。
除上述被怀疑有HCV感染的检样外，亦使用B-1阳性检样(139例)、RF阳性检样(50例)，及正常人检样(100例)。
在此使用RF阳性检样是基于下述考虑即由于RF是风湿病因子且成为HCV感染假阳性的原因，受到RF干涉而变为阳性者易于发生非特异反应。
试验结果分别列入表10(被怀疑有HCV感染的检样)、表13(B-1阳性检样)、表16(RF阳性检样)、及表19(正常检样)。按各检样群将各表总计后列入表11、12(与表10相对应)、表14、15(与表13相对应)、表17、18(与表16相对应)及表20(与表19相对应)。在被怀疑有HCV感染的检样中，发现N-14呈阴性的变为P1b9＊3阳性，而P1b9＊3的检出率高于B-1(表10-12)。表13-15是以B-1阳性检样为基准对P1b9＊3与N-14进行比较，由这些表可明确得知P1b9＊3的检出率高于N-14。另发现在RF阳性检样中，B-1由于敏感度高而极易受RF干扰的影响，而P1b9＊3与N-14同样程度地，不太受到RF干扰的影响(表16-18)。此外，在正常检样中，P1b9＊3、B-1及N-14均未检出阳性，而发现B-1检出倾向大(吸光度较高)，易于形成“测量过度”，但P1b9＊3的检出倾向小于B-1而与N-14相差不大(表19)。又，由表19的结果算出界限值(判定阴阳性之基准)P1b9＊3为0.319，B-1为0.445，而N-14为0.037。
由此表明，本发明由肽组合的P1b9＊3在HCV抗体的检出率或特异性上胜过N-14而与B-1相等或超过B-1。
从实施例的结果亦可得知，本发明的HCV抗体检测试剂在检出率和特异性上均优。
按本发明序列1所示的肽，因构成该肽的氨基酸少，由化学合成即可获得该肽，因而可排除基因重组所制肽抗原较多发生的非特异反应。并且用1-2种肽即可达到充分的检出率，因此在经济上亦有利。
此外，依照本发明的肽由于导入Sulfo-SMCC所代表的交联剂，与原来“无交联剂”的肽相比，可提高对HCV核心抗体的反应性。而且，若通过所导入的交联剂与诸如HSA等血清蛋白(作为载体蛋白)结合，则可获得良好反应性并可抑制非特异反应。
如上所述，依照本发明可实现HCV感染的早期而且正确的检查。
〔序列表〕[序列表]序列编号:1序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形(拓扑):直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:2序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:3序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:4序列长度:11序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg1510序列编号:5序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn1510Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys15序列编号:6序列长度:17序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Thr Arg Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg1510Pro Ala Leu Met Ala Val15序列编号:7序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Val Val Pro Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg1510Arg Pro Ala Leu Met Ala Val Lys15序列编号:8序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Pro The Arg Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg1510Arg Pro Ala Leu Met Ala Val Lys1权利要求
1.一种丙型肝炎检查用试剂，其特征在于包括含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
2.如权利要求1所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于序列1中Xaa为选自Leu、Lys及Arg所组成的一组中的氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于其中的肽与间隙分子和/或载体蛋白结合。
4.如权利要求3所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于其中所述载体蛋白为人·血清白蛋白。
5.一种丙型肝炎的检查方法，其特征在于检出对以下任一种肽具有反应性的抗体，所述肽为含有序列1Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的肽或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg序列3Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr AsnArg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys的肽所得的复合肽。
全文摘要
一种利用肽为抗原以检查丙型肝炎抗体的试剂，该肽包含一具有HCV结构区抗原决定基的特定序列Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro(其中Xaa最好能表示Leu、Lys或Arg)为必需肽。该试剂可特异地以高检出率检出HCV结构区的抗体，可实现HCV感染的早期且正确的检查。所需要的肽由化学合成即可容易地制备。
文档编号C07K7/06GK1078805SQ9310360
公开日1993年11月24日 申请日期1993年3月25日 优先权日1992年3月26日
发明者石桥嘉一郎, 伊藤正雄, 吉田巌, 高见泽昭久, 柴谷武尔 申请人:荣研化学株式会社, 财园法人阪大微生物病研究会田边制药株式会社
技术领域：
本发明涉及丙型肝炎检查用试剂及检查方法。据最近研究，日本国内非甲非乙型肝炎患者估计约为200万人，其中丙型肝炎占90-95%。
成为丙型肝炎病因的病毒(以下简称为HCV)其构造被逐渐阐明，最近以检查HCV抗体(对HCV的抗体)存在与否为目的的试剂亦出现若干种市售品。
迄今为止实用化的HCV“标志”(marker)，已知有C-100-3抗原，相当于HCV的非结构区NS-3-4的一部分(SCI-ENCE244;359-362，1988)。由于使用C-100-3抗原为HCV标志，在世界上首先实现HCV抗体的分析。但以C-100-3抗原来筛检HCV感染者时，其阳性率为约70%，引起所剩30%成为假阴性的问题;另一方面亦有下述报告用C-100-3抗原所制的HCV抗体检出用ELISA(酶联免疫吸附试验，即一种利用酶连接免疫吸附剂的酶免疫测定)试剂盒实际筛检输血用血液时的阳性率达约1.5%，其中约半数为假阳性。
以后，有人提议，使用HCV核心区为抗原以提高HCV抗体检出率(查出率)，使感染得到早期检查。利用核心区蛋白抗原而制成的HCV抗体检出用试剂盒已被研究出若干种，相对于上述利用C-100-3抗原的试剂盒，被称为第二代试剂盒。有人尝试在核心区蛋白中设定一个相当于抗原决定基部分的合成肽，对此组合成相当于上述非结构区NS-3-4区中二个抗原决定基的合成肽，用以检出HCV抗体(Proc.Natl.Acad.Sci.USA88;3647-3651，1991)。照此方法，虽然特异性(专一性)可提高至高于利用C-100-3抗原的HCV标志，但由于它只准备一个在核心区的抗原决定基，因此无法检出对其他抗原决定基所产生的抗体，从而不能获得充分的检出率。
日本专利特开平3-139282号公报揭示若干与核心区的抗体有反应性的抗原决定基，虽然尚未达到实用化。将这些抗原决定基复合利用时或许可提高抗体的检出率，但可预料其特异性降低，且在经济上亦不利。
另一方面，迄今在HCV抗体检出上所利用的肽，由基因重组所获得者较多，因此有易于显现非特异反应的倾向。例如上述C-100-3抗原是利用它与超氧物歧化酶(以下简称为SOD)的融合蛋白而表达的基因重组产物，因此为了检查因对SOD部分反应而产生的假阳性，必须用免疫斑点法等进行追加试验，否则无法有效检出HCV抗体。
而且，若使用以T-7噬菌体媒介，由ARIMA＃14(后述)(其一部分与HCV核心区相似)表达所得的融合蛋白为抗原时，T-7噬菌体蛋白的抗体引起假阳性反应。在这种情况下，用T-7噬菌体蛋白来吸收非特异反应，以降低假阳性。
因此，使用基因重组所得的肽为抗原来筛检抗体时，必需对非特异反应有特殊的考虑。就目前情形而言，对付这样的非特异反应需要特殊操作，并且效果也多不足。从而需寻求一种对HCV抗体有高度反应性同时维持充分特异性的抗原。另一方面，除了上述起因于融合蛋白属性的非特异反应问题外，亦有基于抗原抗体反应的本质问题。即如前所述，若仅用在HCV核心区的一个抗原决定基作抗原，则会降低HCV抗体检出率，而利用复合抗原时虽然可提高检出率，却会增大非特异反应。一般而言，在利用某一抗原以检出抗体时，若为提高检出率而使用高反应性抗原，则易于随着反应性的提高使非特异反应增加而造成特异性降低(所谓“测量过度”(包含不应测出的测定值);反之，若提高抗原的特异性，可检出的抗体则减少(所谓漏检)。可满足这样相反条件的适当抗原目前尚未被人所知。
鉴于已有技术的上述情况，本发明的目的在于提供一种实用性强的检查用试剂，该试剂的肽所含氨基酸数目及肽的种类虽少，但却不必牺牲特异性即可提高HCV抗体检出率。
本发明的目的还在于提供检查方法。
本发明的目的可用下述手段来完成。即本发明为一种丙型肝炎检查用试剂，包括含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的一种或多种肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
本发明又是一种适于丙型肝炎的检查方法，即检出对于以下任一种肽具有反应性的抗体，这些肽是含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的一种或多种肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
各氨基酸的缩写分别代表以下氨基酸Ala丙氨酸Leu亮氨酸
Arg精氨酸Lys赖氨酸Asn天冬酰胺Met甲硫氨酸Asp天冬氨酸Phe苯丙氨酸Cys半胱氨酸Pro脯氨酸Glu谷氨酸Ser丝氨酸Gln谷氨酰胺Thr苏氨酸Gly甘氨酸Trp色氨酸His组氨酸Tyr酪氨酸Ile异亮氨酸Val缬氨酸在序列1的10个氨基酸中，Xaa为任选的氨基酸，其选择自由度较大。其他部分的氨基酸在序列未被特定时并未显示高抗原性，但在Xaa部分存在某种程度的容许范围。例如在日本专利特开平3-139282号公报所发表的HCV核心区相当于序列1的部分序列中，Xaa为Leu，但在依照本发明的序列1中，Xaa不限于Leu，即使Lys，Arg亦显示高抗原性。更确切地说，Lys比Leu更合适。
本发明序列1-3所示肽的氨基酸序列虽然比公知(例如日本专利特开平3-139282号公报)的序列短得多，却显示与HCV核心区实际上1-3个抗原决定基相同的抗原机能。即利用HCV核心区中的一个序列(对应于序列1)、二个序列(序列1+序列2或3)或三个序列(序列1+2+3)抗原决定基构造的特定部分序列，将相应的肽用作抗原，可达到特异性与反应性的相容共存，即解决抗原抗体反应检出法的本质问题。又因不使用融合蛋白，从而可减少非特异反应。
以下详述本发明。本发明所需要的肽可利用化学合成品。含有序列1的肽可以举出序列1中添加数个-20个左右任选的氨基酸，或如后所述以间隙分子或载体蛋白修饰的肽。对序列1添加任选的氨基酸可分别对序列1的N末端、C末端单独施行。例如亦可以参照与序列1相对应的HCV核心区的若干公知序列而选定。但不限于这类公知序列。至于其他方法，例如亦可以使序列2或3所表示的肽与序列1的肽连接。在将序列1的肽与序列2或3连接时，在维持反应性上较佳的是，通过数个-20个左右任选的肽或后述载体蛋白等在氨基酸上予以结合。当然亦有可能仅由含序列1的肽来构成本发明。
其次，将序列1与序列2和/或序列3的肽予以组合，亦即在互相不连接而呈混合状态下同时用作抗原时，可获得比序列1或含它的肽单独使用时更好的结果。因为仅用一种肽有时出现检出率降低。在利用肽组合的情况下，最好能使序列1的肽与序列2和/或序列3的肽的用量比率为1∶2-2∶1。而且，在序列1与序列2、3组合使用时，最好分别结合载体蛋白或其他任选的肽等，然后再混合使用。关于这一点说明如下即序列1的Xaa可采用任选的氨基酸，因此可认为每一不同的Xaa拥有不同的抗原决定基，而Xaa不同的多种序列在Xaa以外的氨基酸序列共同的情况下可能具有不同的抗原决定基，因此与其使用多种序列1，不如合并使用互相在对应抗原决定基上显然不相同的序列1与序列2，这样容易提高检出率。但这并不排除多种序列1的使用，因为它有时可能有效。
本发明使用的肽，虽然可将肽分子直接利用于抗原抗体反应，但若预先使它与间隙分子或载体蛋白结合，则有可能生成反应性更优的试剂。例如使4-(N-顺丁烯二酰亚氨甲基)环己烷-1-羧酸磺丁二酰亚胺酯(以下简称为Sulfo-SMCC)、6-〔3-(2-吡啶二硫)丙酰胺〕己酸磺丁二酰亚胺酯(以下简称为Sulfo-LC-SPDP)、N-(ε-顺丁烯二酰亚胺己酰氧)丁二酰亚胺(以下简称为EMCS)等间隙分子共价结合于肽的N末端时，该肽与抗体的反应性则提高。
若通过此间隙分子使肽与人血清白蛋白(以下简称为HSA)、牛血清白蛋白(以下简称为BSA)等非活性载体蛋白结合，则可获得更好的结果。使肽与载体蛋白结合时，除肽侧的间隙分子外，亦可以在载体蛋白侧预先导入间隙分子。为了能尽量减少非特异反应，用作载体蛋白的蛋白最好能用从实际受试动物得到的蛋白。即若以人血清为试样，则宜使用HSA。
本发明有关的肽或其修饰物可以所适用的免疫分析系的形式提供。例如在抗原与固相树脂珠或容器壁结合的状态下与拟检出抗体进行反应的固相免疫测定法，是依靠物理吸附或化学结合使本发明有关的肽或其修饰物结合在固相载体上。在利用多种肽时，无论各肽以混合物同时结合于载体，或各肽各别结合于载体后再予以合并均可。这时，固相上的肽所捕获的HCV抗体可利用人·免疫球蛋白的抗体予以检出(“夹层技术”法)。作为人·免疫球蛋白的抗体，若使用能辨认“类别”(例如IgG，IgA，IgM……等)的抗体，则有可能按类别分开后检出HCV抗体。关于利用固相结合肽之免疫分析法，除了该夹层法外，还可举出一种利用标记抗体的竞争法(使标记抗体与待测抗体互相竞争的方法)。
在本发明中，所用抗原决定基实际上至多不过2个，所以在采用竞争法时有可能利用单克隆抗体作为标记抗体。在考虑固相上肽的配比及亲合力之下，将对所利用的肽有特异性的单克隆抗体适当混合于该肽，以用作标记抗体即可。
本发明有关的肽或其修饰亦可用作标记抗原。在这种情况下，可用(夹层法)固相化的人·免疫球蛋白的抗体或此抗体与(竞争法)固相化的HCV抗体组合起来构成免疫分析系。酶、发光物质、萤光物质、放射性同位素等公知物可被用作这种免疫分析系的标记物。通过适当的间隙分子、抗生物素-生物素结合等使这些标记物结合。
本发明有关的肽或其修饰物亦可与乳胶粒子等组合，以应用于粒子凝聚反应或凝聚抑制反应。
依照本发明的HCV检查用试剂或检查方法所需的包括稀释液，标记检出用基质，阳性对照物等各种成份，可适当地加以组合，以形成试剂盒的形式。例如将本发明有关的肽结合于固相树脂珠，并与标记的抗人IgG抗体组合，形成检定试剂盒。
本发明中含有序列-1的肽对HCV抗体有高度反应性，并且很难与其他抗体发生非特异性反应。该肽与序列-2和/或序列-3的肽组合时可进一步提高HCV抗体的检出率。本发明有关的肽为诸如从日本专利特开平3-139282号公报所示抗原决定基结构取出的部分序列或与它们有共同部分的序列。但比特开平3-139292号公报所示序列短很多，因此容易合成，又由于选择了对HCV抗体保持高度特异性的部分，因此可进行特异性很高的分析。
以下说明本发明的实施例。
实施例1.肽的合成用一肽合成装置(BIOSEARCH公司制造，9600型)合成依照本发明含有下述氨基酸序列的六种肽。序列1中Xaa为Leu、Lys、Arg的分别称为序列1a、1b、1c。序列1与其他氨基酸的结合点以·表示。
序列1aArgLeuGlyProArgLeuGlyArgArgPro序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys序列1a7(序列1a+7种氨基酸)ThrArg·ArgLeuGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaVal序列1b9(序列1b+9种氨基酸)ValValPro·ArgLysGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaValLys序列1c9(序列1c+9种氨基酸)ProThrArg·ArgArgGlyProArgLeuGlyArgArgPro·AlaLeuMetAlaValLys合成按阶段性固相法进行。固相使用叔丁氧羰基氨酰基-4-(氧甲基)-Merrifield氏树脂(渡边化学工业公司制造)，氨基酸(L型)的氨基用叔丁氧羰基(以下称为t-BOC)加以保护。各氨基酸的侧链分别用下述保护基加以保护苏氨酸(Thr/T)、丝氨酸(Ser/S)邻苄基;
谷氨酸(Glu/E)γ-苄酯;
精氨酸(Arg/R);
-2-磺酰基;
赖氨酸(Lys/K)2-氯苄氧羰基，其他氨基酸的侧链无保护。
用三氟乙酸除去树脂上肽末端t-BOC氨基酸的t-BOC基后用N，N'-二异丙碳二亚胺使待偶联的下一个氨基酸的羧基活化，然后在室温下混合1-4小时以进行偶联反应。反应时间按氨基酸种类及组合情形而确定。未反应的游离氨基酸靠1-乙酰咪唑的乙酰化作用使之失活。
所需要的反应循环终了后，用三甲硅烷基三氟甲磺酸、苯基甲基硫醚、以及三氟乙酸去除保护基并使合成肽脱离树脂，用乙醚回收肽。所回收的肽用凝胶过滤予以粗提纯后，用ODS-80TM(含有水-乙腈、0.1%TFA)柱进行反相HPLC分析，分取其高峰流份。
实施例2.检查用试剂的配制(1)使用实施例1所合成的肽配制用于检测HCV抗体的五种试剂。试剂编号与所用序列编号的对应关系如下试剂-1a序列1a试剂-2序列2
试剂-3序列3试剂-1a7序列1a7试剂-1a7＊2序列1a7+序列2其中，序列2及序列3的使用目的在于观察序列2、序列3的单独效果，，为证实本发明试剂的效果供比较用。序列1a、1a7、2及3表示的肽由下述方法加以固相化。
用50mM碳酸缓冲液(pH9.6)使各合成肽抗原溶解至2.0μg/ml(若在2.0-5.0μg/ml浓度范围内，结果可获得相同的检出率)，按100μl分注于ELISA微量反应器(MAXISORPC12、Nunk公司制)的各孔中(每孔抗原量为0.2μg0.2μg/孔，以下同样)。
在4℃温度下静置一夜后，用洗涤液(含有0.05%吐温-20的10mM磷酸缓冲液，pH7.2)300μl洗3次后，干燥，获得按各序列的试剂。再使用序列1a7及序列2所表示的肽按1∶1互相混合，以相同的操作吸附于微量滴定板(分注浓度0.2+0.2＝0.4μg/孔)而获得试剂。
另一方面准备按顺丁烯二酰亚胺法用过氧化酶标记的抗人·免疫球蛋白G单克隆抗体(含有0.1%BSA的磷酸缓冲液，以下简称为POD标记抗IgG抗体)及由四甲联苯胺0.17mg/ml、0.015%过氧化氢、以及0.125M柠檬酸缓冲液(pH4.2)所组成的发色基质液。
实施例3.HCV抗体的检出(1)以被怀疑有HCV感染的血清检样(20例)及正常人血清检样(10例)为试样，用试剂-1a、试剂-1a7、试剂-2、试剂-3、及试剂-1a7＊2进行ELISA。另对由公知肽B-1及ARIMA＊14(以下简称为N-14)配制的试剂亦进行分析以作比较。其中B-1、N-14的抗原浓度为0.1μg/孔。上述序列1a等的抗原浓度为0.2μg/孔，双方的差异是最适抗原浓度(即不致引起敏感度降低的经济浓度)不同所致，但均按各抗原的最适条件来配制这一点是不变的。
B-1相当于文献(J.Virology，65/3，p1105-，1991年)，所记载的HCV结构区氨基酸序列中从N末端起算的第10个-第122个氨基酸序列的肽，而ARIMA＃14据报告是作为HCV结构区中抗原决定基(BIOmedica6(2)，p26-，1991)的肽。同时，将使用市售HCV抗体检出用试剂盒(利用C-100-3抗原)所得的分析结果进行比较。另外，对一部分血清检样用免疫斑点法追加试验市售试剂盒(“RIBATest”，ORTHODIAGNOSTICS公司制造，商品名)进行确证试验。其操作如下在抗原固相化板的各孔分别加入检样稀释液(0.05%吐温-20，0.125%NaN3，10mM磷酸缓冲液pH7.2)200μl及血清检样20μl，在25℃下反应1小时。反应完成后，除去反应液，用洗涤液(0.05%吐温-20，10mM磷酸缓冲液pH7.2)300μl，洗5次，分别加入POD标记抗IgG抗体100μl，于25℃下反应1小时。反应完成后，除去反应液，用洗涤液300μl洗5次，加入发色基质液100μl后，在25℃下反应30分钟，用2N硫酸终止反应，测定450nm吸光度。结果如表1所示(表中，以P表示试剂)。在表1中，与免疫斑点法追加试验结果(表中，以RIBA表示)相比较，在市售品(表中以“C-100”表示)中出现相当多的假阳性，但试剂-1a7及试剂-1a7＊2均与RIBA充分一致，证实本发明的试剂-1a7及试剂-1a7＊2检出率高。又发现试剂-2及3也具有基本相等的作用，但与含有序列1的试剂-1a、-1a7、-1a7＊2对照比较时，有漏检的情况(检样No16，17)，证明若单独使用序列2及3，有时会发生漏检。亦证明，与试剂-1a、-1a7相比，试剂-1a7＊2使检出率更为提高。而与B-1一致或不一致，这本身并不代表检查用试剂的好坏，但一般而言，被怀疑有HCV感染的检样当B-1呈阳性时，产生阴性反应的试剂可认为检出率低。基于这一观点，试剂-1a、-1a7、-1a7＊2优于试剂-2、3及-N-14。
然后，对于HCV阳性检样，试用序列1a7及序列2进行抑制试验。将固相化所利用的序列1a7及序列2的肽10μg加入检样稀释液(200μl)中，以观察试剂-1a7及试剂-2的反应变化。结果如表2所示，HCV抗体阳性检样由于添加序列1a7的肽10μg而被完全抑制，证实其特异性高。另在序列2中亦发现HCV抗体阳性检样完全被抑制。以此而言，其特异性亦高。
实施例4.试剂的配制(2)将各种交联剂导入实施例1所合成的肽，以此作为抗原来配制试剂。
(1)将各种交联剂导入合成肽;
(A)Sulfo-SMCC导入合成肽将Sulfo-SMCC(PIERCE公司制造)0.132mg与合成肽(序列1a7或2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后加以混合，将液量调整到0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(B)EMCS导入合成肽将EMCS(“同仁化学”公司制造)0.1mg溶于二甲基甲酰胺10μl，该溶液与合成肽(序列1a7或序列2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后加以混合，将液量调整至0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(C)Sulfo-LC-SPDP导入合成肽将Sulfo-LC-SPDP(PIERCE公司制造)0.15mg与合成肽(序列1a7或2)0.5mg分别溶于100mM磷酸缓冲液(pH7.5)后予以混合，将液量调整到0.1ml后，在25℃温度下反应2小时，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(D)DSS导入合成肽使DSS(PIERCE公司制造)0.2mg溶于二甲基甲酰胺50μl，与合成肽(序列1a7或2)0.5mg一起加入100mM磷酸缓冲液(pH7.5)0.15ml中，在40℃温度下搅拌8小时以进行反应后，添加1M甘氨酸10μl以终止反应。
(2)固相化抗原的制备参照实施例2的方法制得导入上述(A)-(D)交联剂的各抗原实施例5.HCV抗体的检出(2)使用实施例4所制的试剂，试行HCV患者血清中抗体的ELISA法测定。同时进行上述实施例4所得各抗原的抑制试验。
(1)HCV患者血清中抗体的ELISA法测定使用上述实施例4(2)所制得的抗原固相化板，参照实施例3的方法测定HCV患者血清中的抗体。同时选择很多在肽单独时呈阴性(在B-1呈阳性)的检样，以观察交联剂的效果。
结果表示在表3及表4中。各合成肽的抗原性由于肽与交联剂结合而被增强，但增强效果按交联剂的种类而有所不同。Sulfo-SMCC、EMCS、以及Sulfo-LC-SPDP均显示同等程度有效，而DSS稍逊于前三者。尤其在导入有Sulfo-SMCC的序列1a7全然未发现任何漏检。而对于序列2，即使与交联剂结合亦无法完全防止漏检。一般而言，交联剂的增强效果在序列1a7表现得更显著。此外发现B-1抗体在阴性患者血清检样中与导入交联剂的抗原起反应的例子。
(2)抑制试验使用已导入Sulfo-SMCC的合成肽(序列1a7)测定抗体时，将合成肽、Sulfo-SMCC导入肽、Sulfo-SMCC、BSA(SIGMA化学公司制造)或B-1各10μg加入检样稀释液(200μl)中，观察反应的变化。结果列入表5。
结果，如检样N所示，B-1及导入Sulfo-SMCC的合成肽出现抑制，但合成肽本身或Sulfo-SMCC单独时未见抑制。由此证实，因交联剂的导入，使合成肽的反应性有明显的变化，而接近核心区全区域适用的抗原。
实施例6.试剂的配制(3)将实施例4所得导入各种交联剂的肽与载体蛋白结合作为抗原而进行试剂配制。
(1)Sulfo-SMCC交联剂导入肽抗原与载体蛋白的结合将BSA(SIGMA化学公司制造)或HSA(SIGMA化学公司制造)10mg溶于含有6M尿素的100mM EDTA溶液2ml中。加入正丁醇0.2ml及NaBH420mg，在25℃温度下搅拌30分钟后，滴加100mM NaH2PO41ml及丙酮0.4ml，以生成还原BSA溶液或还原HSA溶液。
在此溶液0.3ml中添加上述实施例4中被甘氨酸终止反应前的反应液(Sulfo-SMCC交联剂导入肽抗原，参照实施例4(1)(A))(0.1ml)，在4℃温度下搅拌8小时以进行反应后，添加50mMN-乙基顺丁烯二酰亚胺50μl以终止反应。然后用SEPHADEXG-50(PHARMACIA公司制造)进行纯化，获得结合于载体蛋白的Sulfo-SMCC交联剂导入合成肽(以下简称为BSA结合肽、HSA结合肽)。
(2)固相化抗原的制备参照实施例2的方法制成BSA结合肽、及HSA结合肽的固相化板。
实施例7.HCV抗体的检出(3)使用实施例6所制成的固相化板，参照实施例2的方法，将按B-1测定抗体结果显示阳性的HCV患者血清(54例)测定其中的抗体。结果列入表6。如表6所示，BSA结合肽与HSA结合肽均显示相同的结果。
表6BSA结合抗原HSA结合抗原肽阳性/检样阳性率(%)阳性/检样阳性率(%)序列1a753/5498.153/5498.1序列251/5494.451/5494.4同时，对于正常人血清，两者测定的结果如表7所示，BSA结合抗原出现约2%的非特异阳性，而HSA结合抗原并未出现非特异阳性。
表7BSA结合抗原HSA结合抗原肽阳性/检样阳性率(%)阳性/检样阳性率(%)序列1a77/2592.71/2590.39序列27/2592.71/2590.39此外，以同一方式用公知肽(B-1及N-14)试剂进行同一检样的分析，比较两者的结果。
实施例8.HCV抗体的检出(4)将实施例1所合成的序列1b9及1c9按实施例4及6诱导以下所示抗原(HSA结合抗原)，参照实施例2的方法将其在微量反应器(在孔中加样时抗原浓度为0.5μg/孔)敏化以试行被怀疑有HCV感染的患者检样(105例)中HCV抗体的检出(ELISA法)。结果列于表8，其总计数列于表9。
虽然有若干反应性差异，但确证具有大致相同的反应性。
序列1b9间隙分子(Sulfo-SMCC)-HSA(称为1b9-HSA)。
序列1c9间隙分子(Sulfo-SMCC)-HSA(称为1b9-HSA)。
表9被怀疑有丙型肝炎的105例检样(本发明品间的比较)
实施例9.HCV抗体的检出(5)分别准备序列1b9及序列3通过间隙分子(Sulfo-SMCC)与HSA结合的抗原。然后将它们按1∶1掺配以制备一试剂(称为P1b9＊3)，参照实施例2的方法使其在微量反应器(分注浓度0.5+0.5＝1.0μg/孔)敏化，以试行检测各种检样中的HCV抗体(ELISA法，一部分RIA法)。另外以同一方式用公知肽(B-1及N-14)的试剂进行上述各种检样的分析，比较两者的结果。
除上述被怀疑有HCV感染的检样外，亦使用B-1阳性检样(139例)、RF阳性检样(50例)，及正常人检样(100例)。
在此使用RF阳性检样是基于下述考虑即由于RF是风湿病因子且成为HCV感染假阳性的原因，受到RF干涉而变为阳性者易于发生非特异反应。
试验结果分别列入表10(被怀疑有HCV感染的检样)、表13(B-1阳性检样)、表16(RF阳性检样)、及表19(正常检样)。按各检样群将各表总计后列入表11、12(与表10相对应)、表14、15(与表13相对应)、表17、18(与表16相对应)及表20(与表19相对应)。在被怀疑有HCV感染的检样中，发现N-14呈阴性的变为P1b9＊3阳性，而P1b9＊3的检出率高于B-1(表10-12)。表13-15是以B-1阳性检样为基准对P1b9＊3与N-14进行比较，由这些表可明确得知P1b9＊3的检出率高于N-14。另发现在RF阳性检样中，B-1由于敏感度高而极易受RF干扰的影响，而P1b9＊3与N-14同样程度地，不太受到RF干扰的影响(表16-18)。此外，在正常检样中，P1b9＊3、B-1及N-14均未检出阳性，而发现B-1检出倾向大(吸光度较高)，易于形成“测量过度”，但P1b9＊3的检出倾向小于B-1而与N-14相差不大(表19)。又，由表19的结果算出界限值(判定阴阳性之基准)P1b9＊3为0.319，B-1为0.445，而N-14为0.037。
由此表明，本发明由肽组合的P1b9＊3在HCV抗体的检出率或特异性上胜过N-14而与B-1相等或超过B-1。
从实施例的结果亦可得知，本发明的HCV抗体检测试剂在检出率和特异性上均优。
按本发明序列1所示的肽，因构成该肽的氨基酸少，由化学合成即可获得该肽，因而可排除基因重组所制肽抗原较多发生的非特异反应。并且用1-2种肽即可达到充分的检出率，因此在经济上亦有利。
此外，依照本发明的肽由于导入Sulfo-SMCC所代表的交联剂，与原来“无交联剂”的肽相比，可提高对HCV核心抗体的反应性。而且，若通过所导入的交联剂与诸如HSA等血清蛋白(作为载体蛋白)结合，则可获得良好反应性并可抑制非特异反应。
如上所述，依照本发明可实现HCV感染的早期而且正确的检查。
〔序列表〕[序列表]序列编号:1序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形(拓扑):直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:2序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:3序列长度:10序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro1510序列编号:4序列长度:11序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg1510序列编号:5序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn1510Arg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys15序列编号:6序列长度:17序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Thr Arg Arg Leu Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg1510Pro Ala Leu Met Ala Val15序列编号:7序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Val Val Pro Arg Lys Gly Pro Arg Leu Gly Arg1510Arg Pro Ala Leu Met Ala Val Lys15序列编号:8序列长度:19序列类型:氨基酸序列构形:直链状序列种类:肽其他讯息:HCV核心区抗体及反应性肽序列:Pro The Arg Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Arg1510Arg Pro Ala Leu Met Ala Val Lys1权利要求
1.一种丙型肝炎检查用试剂，其特征在于包括含有序列1ArgXaaGlyProArgLeuGlyArgArgPro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的肽，或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2GlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArg序列3ThrGlnGlnArgLysThrLysArgSerThrAsnArgArgArgSerLysAsnGluLys的肽所得的复合肽。
2.如权利要求1所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于序列1中Xaa为选自Leu、Lys及Arg所组成的一组中的氨基酸。
3.如权利要求1或2所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于其中的肽与间隙分子和/或载体蛋白结合。
4.如权利要求3所述的丙型肝炎检查用试剂，其特征在于其中所述载体蛋白为人·血清白蛋白。
5.一种丙型肝炎的检查方法，其特征在于检出对以下任一种肽具有反应性的抗体，所述肽为含有序列1Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro(其中，Xaa表示任选的氨基酸)的肽或该肽添加下述序列2和/或序列3序列2Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr Asn Arg Arg序列3Thr Gln Gln Arg Lys Thr Lys Arg Ser Thr AsnArg Arg Arg Ser Lys Asn Glu Lys的肽所得的复合肽。
全文摘要
一种利用肽为抗原以检查丙型肝炎抗体的试剂，该肽包含一具有HCV结构区抗原决定基的特定序列Arg Xaa Gly Pro Arg Leu Gly Arg Arg Pro(其中Xaa最好能表示Leu、Lys或Arg)为必需肽。该试剂可特异地以高检出率检出HCV结构区的抗体，可实现HCV感染的早期且正确的检查。所需要的肽由化学合成即可容易地制备。
文档编号C07K7/06GK1078805SQ9310360
公开日1993年11月24日 申请日期1993年3月25日 优先权日1992年3月26日
发明者石桥嘉一郎, 伊藤正雄, 吉田巌, 高见泽昭久, 柴谷武尔 申请人:荣研化学株式会社, 财园法人阪大微生物病研究会田边制药株式会社
起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】
与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。
此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除
热门咨询
tips