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2021-02-01 10:02:50|
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起点商标网 专利名称：嗜热细菌用于制造三唑核苷类的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用酶促合成方法生产具有与三唑连接的核糖基的药用化合物，例如三唑核苷类，在一些实例中与1，2，4-三唑连接，形成1，2，4-三唑核苷类。一种化合物是药物三氮唑核苷，其化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
具有与三唑相连的核糖基的药用化合物，例如三唑核苷类可用不同方法制得。已知最好的化合物是三氮唑核苷，即1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。在某些情况下，引起涉及许多化学试剂的复杂的化学反应，包括在反应前将组分或反应物的活性基团加以保护，将核糖活化，然后将中间体去保护(通过酰胺化)。这可参阅相应于美国专利3798209的加拿大专利997756，文中涉及了三氮唑核苷的制造方法。这些方法的缺点是产物杂质多，因为有许多中间体残留物，和工艺方法带来的杂质，另外，生产成本也高。
制造这类包括三氮唑核苷在内的化合物也可用发酵和酶促合成方法进行。见例如美国专利3,976,545和4,458,016。发酵方法包括细菌的需氧培养，如短杆菌属，棒状杆菌属，Anthrobacterium，芽孢杆菌属等细菌的需氧培养，发酵时间2-8天，培养基中除营养介质外，还含有1，2，4-三唑-3-甲酰胺和核糖给体。然后将细菌培养液中聚集的最终产物如三氮唑核苷分离出来。
也可参阅例如Furuya，Akira等人在日本特许公开75123882 ICIC12D，C07D，1975年9月29日，美国专利4614719和题为J.P No.29725/1975(/Agric.Biol.M.50/1)，121-6，1986的文章。
然而上面提及的现有技术的方法的缺点包括发酵时间长，会被其它微生物污染，许多不希望有的酶促反应会导致必须除去的大量副反应产物的杂染。这些杂质降低了三氮唑核苷产量和妨碍了纯化过程。
在这后一点上，这些方法包括存在来自细菌的酶源，为底物提供特异性酶(例如磷酸酯酶、嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶)，用来使核糖基和三唑反应制成三唑核苷(例如三氮唑核苷)。然而，实际上这些方法并不能产生商业上所需量的三氮唑核苷。在某些情况下，由不同的异养性嗜温微生物产生的酶在不足以产生高产量的温度下是有活性的。在某些情况下，该过程很长，增加了被其它微生物污染的可能性。这样，该过程变得复杂了，致使在底物特异性酶纯化时的方法复杂了。
因此，本发明的目的是提供使核糖基与三唑反应的改良方法，以得到例如三氮唑核苷这样的三唑核苷药用活性化合物。
本发明的另一目的是提供产生高收率和杂质少的药用活性化合物的方法，因而是非常有效率的方法。
本发明的另一目的是提供这样的方法使诸成分更容易接触，于反应混合物中彼此更好地相互作用。
本发明的另一目的是所用的方法可用磷酸酯酶和核苷磷酸化酶来产生高收率的活性物质如三氮唑核苷。
本发明的其它目的对于本领域的技术人员由以下的发明综述及其实施方案的详细说明中会是很清楚的。
本发明的一个方面是提供了一种制备具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法，例如制备三唑核苷，如三氮唑核苷，是在嗜热细菌(如优选为排硫嗜热菌)的存在下作为催化反应的酶源，将三唑(如1，2，4-三唑-3-甲酰胺)与核糖基给体(例如核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，如尿苷和胞苷，嘌呤核苷，如鸟苷、肌苷和腺苷，嘧啶核苷酸如5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸如5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)反应。
嗜热细菌可定义为在较高温度例如高达大约90-95℃仍可存活的细菌，也包括排硫嗜热菌，它在40-80℃下仍存活。
排硫嗜热菌天然存在于新墨西哥热泉(大地构成泉)，温度74℃，pH7.0，HS-浓度1mg/升。该微生物为革兰氏阴性菌，非运动性菌，0.5-1.0×3-20μm，可形成长度达1cm的细胞链。形成的丝状体无荚膜。硫沉积在细胞外。该微生物可用自养培养基分离，培养基中HS-为能源，NO3-为终末电子接受体。厌氧条件需要NO2-或NO3-。由NO3-形成NO2-，无气体逸出。氧也可用作终末电子接受体，但是因为在生长所需的温度下O2的溶解度降低了，因而该菌生长较差。需氧和厌氧培养所用的交替能源包括有己糖、HS-、SO3＝、和S2O3＝。最佳温度为70-73℃，生长温度为62-77℃(“排硫嗜热菌属和兼性厌氧兼性矿质化能营养性细菌新种，于中性pH和高温下生长”，引自Douglas E.Caldwell，Sarah J.Caldwell，和J.Paul Laycoct，Can.J.Microbiol.221509-1517)。
含有排硫嗜热菌种的样品初培养后，再对富集培养液加以纯化。
由于嗜热微生物(如排硫嗜热菌种)的自然生境是大地构成泉(此处不存在不嗜热的天然存在的其它类型的细菌)，温度范围40-80℃，我们已经根据矿泉水的组成和温度数据，从具有最高温度的矿泉选择了塞尔维亚三个矿泉的热水作为本发明用的嗜热细菌的来源-Josanicka banja(62-78℃)-Vranjski banja(78-80℃)-Sijarinska banja(41-63℃)生境特征(a)Josanicka banja位于Kopaonik山脚下，有4处药用矿泉水的大地构成泉。水温62-78℃，水的pH范围7.5-8.5。(b)Vranjska banja位于Veliki Pester山脚下，在南斯拉夫是最温热的矿水泉，也是欧洲最温热的。水中含有硫和碱，水是超高温的，而pH范围7.8-8.0。取样之处的水温范围78-80℃，但某些地段的水温范围63-92℃。(c)Sijarinska banja位于Golak山的最远端，距Leskovac 52公里，有16个矿水泉，含有碱和铁，温度范围41-63℃。取样粘滑的细菌沉积物存在于经常被温水冲洗的岩石上。在无菌条件下取样，用移液管将细菌沉积物连同水一起取入，转移到锥形瓶内，用细菌环取出沉积物，接种于试管的营养介质(液体培养基)和琼脂斜面(固体培养基)上。在用细菌环移取时，沉积物可拉成10-15cm长的丝。使用下列培养基肉汤营养液(含蛋白胨1.5％，肉提取物0.3％，NaCl 0.5％，KH2P040.03％)和营养琼脂(其组成与肉汤营养液组成相同，只是含琼脂1.6％)。
生物材料取样放到锥形瓶中，也接种到营养介质中，运回到实验室。材料富集和纯化取样的生物材料起初接种在液体营养液中培养，于45和70℃培养过夜。“过夜”的培养液用同样介质稀释20倍，再于45°和70℃培养。然后再稀释，于45℃和70℃培养过夜。用这种双程法使起始的生物材料繁殖。用“块皿法”分离纯细菌培养物，得到的单个菌落在形态学上如形状、大小、颜色和稠度是不同的，在培养皿上的生长方式也是不同的。在培养皿上培养后出现不同类型的菌落。每种菌落划线接种到营养琼脂上，于45℃和70℃培养。培养出的菌落再接种在琼脂斜面上。用这种方法使采自Josanicka、Vranjska和Sijarinskabanja的生物材料富集和纯化。自Josanicka banja分离出4种形态学上不同的菌落，称作J1，J2，J3(排硫嗜热菌)和J4。自Vranjska banja的水中分离出的两种菌落称为V1和V2，自Sijarinska banja只分离出一种细菌培养物，因此在样品纯化后，总共分离出7种形态学不同的嗜热菌(菌落)，从Vranjska banja得到的菌落实际上与从Josanickabanja得到的菌落是一样的(V1＝J2，V2＝J3)。分离出的嗜热菌的纯培养物的分离和保存(a)分离出的细菌培养物保存在培养皿和琼脂斜面上，4℃保存，每1个月转种1次。(b)所有分离出的培养物冻干，于4℃贮存备用。
本发明的另一方面是提供了生产药用活性的三唑核苷如三氮唑核苷的方法，该过程是在由嗜热菌(如排硫嗜热菌)分泌的核苷磷酸化酶的存在下发生的。
本发明的另一方面是用嗜热菌生产药用活性的三唑核苷，例如三氮唑核苷，这类菌优选排硫嗜热菌。
因此，本发明的另一方面是由于嗜热菌(优选排硫嗜热菌)的存在，意外地提高了制造这类活性化合物方法的价值。
皆知，无机磷酸盐源(优选磷酸二氢钾)作为磷酸盐源作为催化剂参与了核糖磷酸化的生化途径。
本发明的酶促合成的反应方案如下 R可以是1)NH2三氮唑核苷2)OH3)烷氧基〔当未制成三氮唑核苷时，按本领域技术人员已知的任何方法将生成的产物转变成三氮唑核苷〕 〔〕*本步骤是任选的，这取决于核糖供给体是核苷酸还是核苷，例如步骤(e)步骤(e) 步骤(f)由核糖-1-磷酸开始，步骤如下 (由于核糖-1-磷酸昂贵且不太稳定，作为合成例如三氮唑核苷的原料是不经济的，不如其它物质如尿苷合算)。
由于嗜热细菌允许提高反应温度，并且用改进的酶促反应方法进行制造，因而合成费用降低了，例如增加了反应速率，增加了原料的溶解度，反应中的细胞溶解作用使酶和底物更好地接触，降低了竞争性微生物污染的危险，降低了同时发生竞争性反应的可能性，并改善了总的反应收率。
一个实际例子是本发明的合成方法可用来制造三氮唑核苷。为此，使1，2，4-三唑-3-甲酰胺(TCA)与一种核糖供给体(例如最好是尿苷)，浓度宜略高于TCA摩尔量(例如1.2∶1)，在无机磷酸盐源如磷酸二氢钾作为催化剂存在下酶促合成三氮唑核苷。用于本反应混合物的酶源最好是排硫嗜热菌的非繁殖性细胞，这些细胞随后溶解。非繁殖性细胞是指不生长和不繁殖的细胞。细胞的随后溶解能够使酶或酶性物质与底物直接接触以进行例如三氮唑核苷的酶促合成反应，而不是通过活细胞的某些其它代谢过程合成，在后者情况下细胞是活的，三氮唑核苷的合成会在细胞内进行，即在不同的条件下进行。pH最好是5-9的范围，优选温度是50-80℃。反应一般于1-48小时内完成。
核糖的适宜供给体可以是核糖-1-磷酸，嘧啶和嘌呤核苷和嘧啶和嘌呤核苷酸。嘧啶核苷酸包括5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)；嘌呤核苷酸包括5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)，嘧啶核苷包括尿苷(优选的)和胞苷；嘌呤核苷包括鸟苷、肌苷和腺苷。
一个实例中是将一定浓度的湿细菌生物量掺入到反应混合物中。在反应混合物中的湿细菌生物量为50-60mg/ml。在一个实例中的湿细菌生物量的制备是按本领域的技术人员所熟悉的常用的方法制成排硫嗜热菌的浓集物。
在用于实例中的排硫嗜热菌细胞的发育和制备时，培养用的营养介质有如下成分蛋白胨I、肉提取物、氯化钠、磷酸二氢钾、硫代硫酸钠五水合物和蒸馏水。主培养物的制备是将种子培养物接种于营养介质中，然后在50℃于空气存在下在振荡器上于100rpm连续搅拌培养18小时。培养到时后，于2700rpm离心30与钟将细胞与营养介质分开，弃去上清液，收集由湿细胞生物量构成的沉降物。
在本制备中进行如下操作营养介质的组成和制备介质组成蛋白胨I 6g肉提取物 1.3gNaCl 2.0gKH2PO40.12gNa2S2O3·5H2O 0.099g蒸馏水加到 440ml称量上述量的蛋白胨、肉提取物、NaCl和KH2PO4分别加到容量为200ml的玻璃器皿中，用100ml蒸馏水分别溶解各个成分，慢慢混合，直到溶液完全澄明。合并溶解的成分，置于1000ml玻璃器皿中，加蒸馏水到440ml(介质在高压釜中灭菌时，水分大约蒸发10％)。
用2M NaOH水溶液调节介质pH到7.0-7.2，倾入到置于1000ml锥形瓶内的介质中。
介质灭菌，于120℃、压力为1.5大气压的高压釜中灭菌15分钟。
于无菌条件下量取100ml介质置于4只1000ml锥形瓶内，冷却到室温后加入1ml新鲜制备的0.1M硫代硫酸钠水溶液。Na2S2O3液的制备称量0.248g Na2S2O3·5H2O，溶解于10ml蒸馏水中，在无菌条件下经细菌过滤器＝0.45μ过滤到避光(铝箔)的无菌玻璃容器内。接种物的制备(种子培养液)从100ml锥形瓶中量取5ml前面制备的介质，转移到琼脂斜面上。用无菌细菌环刮取琼脂斜面上的细菌重新悬浮并将悬浮液转移到空管(16cm×10mm)内，振摇(用旋涡振荡器)1-2分钟，得到均匀的悬浮液，显微镜下看不到菌丝和细菌沉降物。
将这样制得的细菌悬浮液接种于含有95ml介质的锥形瓶内。
用无菌塞塞住接种后的介质瓶，无菌塞用棉花和纱布制成，于50℃和空气中振摇培养6小时，100rpm搅拌并通气(K1Λ＝0.64mM O2/分钟)。培养到时后，检查得到的接种物(种子)pH应为7.4-7.8。如果接种物的pH不对，则不能用来制备主培养物。主培养物的制备将上面制成的种子培养物各5ml接种到3个含95ml介质的锥形瓶内。用无菌夹层塞(双层纸棉)闭塞，在空气中于振荡器上按上述接种物制备条件培养18小时(温度50℃，100rpm搅拌，通气K1Λ＝0.64mM O2/分钟)。
培养结束后，将主培养物合并到1000ml锥形瓶内，检测pH(应为8.3-8.6)。如果pH不对，该主培养物不能用于酶促合成。测定主培养物中细菌湿生物量的浓度(C1)以确定主培养物所需的体积(V1)测定光密度将0.5ml主培养物加入到4.5ml介质中，用涡旋振荡器剧烈振摇使均匀化。用未加细菌的介质作对照测定610nm处的光密度。
用如下公式计算主培养物的细菌湿生物量浓度(C1)C1＝3.89×OD610mm+10.76举例若OD610mm＝4.8，则C1＝29.6mg/ml(主样品液中细菌湿生物量浓度)若OD610mm＝5.5，则C1＝32mg/ml(主样品液中细菌湿生物量浓度)。为进行酶促反应确定主培养物所需的体积(V1)用如下公式确定需被离心定出反应混合物体积(V2)的主培养液体积(V1)V1=C2×V2C1]]>式中C1为用标准曲线测定OD610而确定的主培养物中细菌湿生物量浓度C2为反应混合物中细菌湿生物量的最佳浓度(58mg/ml)V2为反应混合物的体积。举例若C1＝29.6mg/ml，V2＝50ml，则为了使反应混合物中最终的细菌湿生物量浓度为58mg/ml时，离心的主培养液所需的体积为100.0ml。
若C1＝32mg/ml，V2＝50ml，则V1＝90.5ml。自主培养液中分离细胞方法将V1ml主培养物(90.5-100ml)离心(2700rpm)30分钟，沉降质，倾去上清液，将得到的沉降物(约2.9g)重新悬浮于5ml无菌重蒸馏水中，转移到无菌试管内，该悬浮液中含有2.0×107-109个活细胞/ml，用于进行酶促反应。酶促反应和分离将嗜热菌的湿细胞块重新悬浮于蒸馏水中，将此细菌悬浮液引入到溶液中，使诸成分最终浓度为成分 浓度TCA 100mM尿苷 120mMKH2PO450mM嗜热菌 58mg/ml(于一实例中细菌生物量中无营养物)制得酶促反应混合物。
将酶促反应混合物于60℃保温24小时(保温过程中因没有营养物和反应介质的高渗性，使活细胞溶解)。
酶反应完全后，将药用活性物质如三氮唑核苷，与反应的副产物和残留的反应试剂分开并纯化。这种提取、纯化和分离操作例如是通过分步沉淀法，基于反应介质中产物、副产物和原料的溶解度不同进行的，也可以使用本领域的技术人员已知的其它的提取、纯化和分离的方法。
可用柱层析法，例如用适宜的离子交换柱，例如当要除去尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和无机磷酸盐时，它们可用强阴离子交换树脂(例如Dowe，Cl-型)除去。当要除去痕量的阳离子型杂质(K+、NH4+、重金属等)时，也需要强阳离子交换树脂(如Dowe50W，H+型)。药用级别的经用水洗脱和从浓缩、冷却的洗脱液(最好再加入乙醇)结晶后可被回收，收率为80-90％。
在制造三氮唑核苷时，核糖供给体对三氮唑核苷的产量影响如表1所示表1核糖供给体三氮唑核苷收率(％)鸟苷21.0胞苷32.0尿苷80.0肌苷4.0腺苷39.95-UMP 40.0表2列出了用尿苷作核糖供给体和1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应时反应混合物保温的温度对三氮唑核苷产量的影响
表2反应温度(℃) 三氮唑核苷收率(％)50 56.760 84.665 55.370 29.7尿苷为核糖供给体，作为催化剂的磷酸二氢钾(KH2PO4)的浓度对三氮唑核苷产量的影响列于表3。
表3KH2PO4浓度(mM) 三氮唑核苷收率(％)25 80.3650 84.9475 82.17100 73.77(mM为毫摩尔)在排硫嗜热菌存在下三氮唑核苷的制备按如下反应流程进行 (排硫嗜热菌中的酶优选用于由尿苷和1，2，4-三唑-3-甲酰胺合成三氮唑核苷。尿苷和无机磷酸盐在嘧啶核苷磷酸化酶的作用下转变成核糖-1-磷酸和尿嘧啶。在核苷酶的作用下同时发生尿苷的降解生成尿嘧啶和核糖。最后，嘌呤核苷磷酸化酶催化核糖-1-磷酸与1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应，生成无机磷酸盐和三氮唑核苷)。
用嗜热菌作为酶促反应的酶源显然能使反应在提高的温度下进行，从而提高了酶的活性并改善了TCA的溶解度。由于较短的和比较经济的制备细菌生物量的方法(用未处理的细菌细胞操作)，由于细胞溶解作用使酶释放，使这些酶与底物较好地接触而增加了酶促反应的效率，由于缩短了细胞蛋白的变性和分离过程，由于选择适宜的层析柱缩短了层极纯化过程，使总的制备时间缩短了。除了在较高温度下操作外，还由于选择了适宜的核糖供给体、试剂的摩尔比和催化剂，由于制备并选择了适宜量的细菌湿生物量，选择了反应的pH以及确定了分离和纯化的条件，该酶促反应有较高的收率(转化百分率)，在终产物的分离上也是有较高收率的。在提高的温度下细菌生物量制备和酶促合成防止了其它微生物的污染。由于在反应过程中发生溶菌作用，因而在酶促反应完全后没有细胞的失活问题。
现在用如下的酶促合成三氮唑核苷的实施例对本发明加以说明。实施例1将排硫嗜热菌加入到富含能源Na2S2O7的无菌营养介质中，后者的pH7.0，接种过的培养基通气下50℃温育18小时。温育完毕后，达到所需的生物量，于2700rpm离心分离出细菌，沉降下来的细胞重新悬浮于蒸馏水中，混匀。
将排硫嗜热菌的未经处理的完整细胞细菌生物量加入到含有120mM尿苷、100mMTCA和50mM KH2PO4的pH为6.8的反应混合物中，使反应混合物中湿生物量的最终浓度为58mg/ml。将反应混合物不断地混合，于60℃温育24小时。在温育过程中，活细胞逐渐在反应混合液中溶解(由于没有营养物供给以及反应介质的高渗性)。温育毕，将反应混合物离心，除去沉降物。上清液于90℃加热处理20分钟使酶失活和变性，蛋白沉淀。得到的上清液真空下浓缩，使尿嘧啶浓度为20-40mg/ml(用HPLC测定)，此时大部分残留量的尿嘧啶、TCA和部分量的尿苷被除去。调节溶液pH至9后，分离出大量的无机磷酸盐，调节得到的上清液至pH11.5，用装有强阴离子树脂(Dowex1×8Cl-型)的离子交换柱进行纯化。三氮唑核苷用水自柱上洗脱出，而残留量的尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和无机磷酸盐仍留在柱上。水洗脱液经过Dowe50W H+型离子交换树脂，而痕量的阳离子形式的杂质留在柱上。洗脱液经浓缩和冷却后，结晶出药用级别的三氮唑核苷，收率80-90％。实施例2
将前述的嗜热细菌J1接种到pH7.0的无菌介质中，于60℃恒温箱培养24小时(“停滞培养”)。得到的初级菌种再接种到新鲜的营养介质中，并于同样条件下培养24小时。二级菌种再接种到新鲜介质中，于同样条件下培养18小时，制得主培养物。于2700rpm离心使细菌沉降，得到的沉降物再悬浮于蒸馏水中，混匀。将J1细菌的湿生物量加入到10ml反应混合物中，后者含有32nM TCA、60mM尿苷和50mM KH2PO4，pH7.0，使反应混合物中细菌的最终浓度为76mg/ml。将反应混合物均化后，于45℃温育24小时，得到的三氮唑核苷产量为14.9mM(16.6％)。实施例3将由琼脂斜面得到的排硫嗜热菌接种于富含30ppm Na2S2O3-3的无菌营养介质中，将初级菌种接种。于50℃和100rpm搅拌下有氧培养24小时后，将初级菌种再接种到新鲜营养介质中，于同样条件下将二级菌种培养24小时。将二级菌种再接种于新鲜营养介质中，接种主培养物并于同样条件下温育18小时。然后于2700rpm离心，得到的细菌沉降物再悬浮于蒸馏水中，振荡使均匀。将上述制备的湿排硫嗜热菌生物量加入到10ml反应混合物中，其中含有100mM TCA、120mM核糖供给体(列于表中)和25mM KH2PO4，pH68。将混合物均化后，60℃温育24小时，得到的三氮唑核苷产率列于表1。
现有技术方法与本发明方法制备三氮唑核苷的收率的比较如表4所示I.本申请人的发明温度 50-80℃时间(小时) 1-48核糖∶TCA比值1.2∶1收率(％) 85II.美国专利3976545酶来源是小牛脾脏0-50℃0.082∶554.1III.美国专利4458016酶来源是肺炎克氏杆菌55-65℃0.17-204.9∶1**24.2***为核糖供给体与TCA的摩尔浓度比**用核糖-1-磷酸，三氮唑核苷收率为24.2％，核糖∶TCA比值为4.9∶1。若按美国专利4458016用尿苷作核糖供给体，则三氮唑核苷收率为11.5％，核糖∶TCA＝4.6∶1。
由于在不背离本发明范围的情况下可对本发明进行许多改变，所以本文包含的所有材料都是为了说明本发明而无限制的意图。
权利要求
1.一种在嗜热细菌和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下使三唑与核糖供给体反应生产具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法。
2.权利要求1的方法，其中细菌是排硫嗜热菌。
3.权利要求2的方法，其中药用活性化合物是三氮唑核苷。
4.权利要求2的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸。
5.权利要求2的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
6.权利要求2的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
7.权利要求4的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
8.权利要求5的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
9.权利要求5的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
10.权利要求6，7或8的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
11.权利要求6，7，8或10的方法，其中核糖供给体是尿苷。
12.权利要求2，5或9的方法，其中核糖供给体是尿苷，其存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
13.权利要求5的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
14.权利权利要求6的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
15.权利要求7的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
16.权利要求8的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
17.权利要求9的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
18.权利要求10的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
19.权利要求11的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
20.权利要求12的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
21.上述任何一项的方法，可得到三氮唑核苷。
22.权利要求1，2，4，6，7，10，11，14或15的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
23.生产药用活性三唑核苷的方法，其中在由嗜热细菌来源的核苷磷酸化酶制剂和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下发生反应。
24.权利要求23的制备核苷的方法，其中细菌是排硫嗜热菌。
25.权利要求24的方法，其中反应是在核糖供给体和三唑的存在下进行的。
26.权利要求25的方法，其中反应是在核糖供给体和三唑的存在下进行的。
27.权利要求25的方法，其中药用活性化合物是三氮唑核苷。
28.权利要求25的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
29.权利要求28的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
30.权利要求25，26，27或28的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
31.权利要求25或27的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
32.权利要求26，27或29的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
33.权利要求30，31或32的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
34.权利要求23，24，25，27或31的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
35.权利要求23，24，25，26，27，28，29，30，31，32或33的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
36.一种用排硫嗜热菌酶促合成三氮唑核苷的方法，包括以磷酸二氢钾为催化剂和在对热稳定的嘧啶核苷和嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，使核糖供给体与1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应，磷酸化酶来自完整的排硫嗜热菌，该菌在反应混合物中不繁殖，pH范围为5-9，温度范围是50-80℃，时间为1-48小时，其中细菌在反应混合液中的浓度为50-60mg/ml。
37.权利要求36的方法，其中分离和纯化三氮唑核苷是用所选类型的离子交换树脂的柱层析法，根据反应混合物中各组分溶解度的不同使副产物和残留的反应物分开。
38.权利要求36的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸，其摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
39.权利要求36的方法，其中核糖供给体是尿苷，其摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
40.权利要求36的方法，其中作为催化剂使用的磷酸二氢钾的浓度，以每100mM的1，2，4-三唑-3-甲酰胺计，为25-100mM。
41.权利要求40或42的方法，其中三氮唑核苷的分离和纯化是经热处理除去残留的溶解细胞和蛋白，将预先真空浓缩的上清液pH调节到11.5，用分步沉淀法除去残留量的反应物和副产物，用含有所选类型的离子交换树脂的预先再生的柱经层析纯化，用水洗脱出全量的三氮唑核苷。
42.权利要求44的方法，其中层析柱分别装载Dowex1×8，Cl-型和Dowex50W，H+的强阴离子和强阳离子交换树脂。 其中R选自NH2(产生三氮唑核苷)，OH或烷氧基 其中R选自NH2(产生三氮唑核苷)，OH或烷氧基
49.在排硫嗜热菌存在下制备三氮唑核苷的方法，该方法包括下列步骤 此处Pi是无机磷酸盐
全文摘要
在嗜热菌和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下使三唑与核糖供给体反应生产具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法。
文档编号C12P19/38GK1111061SQ94190019
公开日1995年11月1日 申请日期1994年5月12日 优先权日1993年12月14日
发明者奥佩西克·戈德纳, 格利吉克·利尤宾卡, 劳德罗维克·泽尔基卡, 齐夫科维克·瓦伦西亚, 马蒂克·洛拉, 史密斯·罗伯特 申请人:奥佩西克·戈德纳, 格利吉克·利尤宾卡, 劳德罗维克·泽尔斯卡, 齐夫科维克·瓦伦西亚, 马蒂克·洛拉, 史密斯·罗伯特
技术领域：
本发明涉及用酶促合成方法生产具有与三唑连接的核糖基的药用化合物，例如三唑核苷类，在一些实例中与1，2，4-三唑连接，形成1，2，4-三唑核苷类。一种化合物是药物三氮唑核苷，其化学名为1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
具有与三唑相连的核糖基的药用化合物，例如三唑核苷类可用不同方法制得。已知最好的化合物是三氮唑核苷，即1-β-D-呋喃核糖基-1，2，4-三唑-3-甲酰胺。在某些情况下，引起涉及许多化学试剂的复杂的化学反应，包括在反应前将组分或反应物的活性基团加以保护，将核糖活化，然后将中间体去保护(通过酰胺化)。这可参阅相应于美国专利3798209的加拿大专利997756，文中涉及了三氮唑核苷的制造方法。这些方法的缺点是产物杂质多，因为有许多中间体残留物，和工艺方法带来的杂质，另外，生产成本也高。
制造这类包括三氮唑核苷在内的化合物也可用发酵和酶促合成方法进行。见例如美国专利3,976,545和4,458,016。发酵方法包括细菌的需氧培养，如短杆菌属，棒状杆菌属，Anthrobacterium，芽孢杆菌属等细菌的需氧培养，发酵时间2-8天，培养基中除营养介质外，还含有1，2，4-三唑-3-甲酰胺和核糖给体。然后将细菌培养液中聚集的最终产物如三氮唑核苷分离出来。
也可参阅例如Furuya，Akira等人在日本特许公开75123882 ICIC12D，C07D，1975年9月29日，美国专利4614719和题为J.P No.29725/1975(/Agric.Biol.M.50/1)，121-6，1986的文章。
然而上面提及的现有技术的方法的缺点包括发酵时间长，会被其它微生物污染，许多不希望有的酶促反应会导致必须除去的大量副反应产物的杂染。这些杂质降低了三氮唑核苷产量和妨碍了纯化过程。
在这后一点上，这些方法包括存在来自细菌的酶源，为底物提供特异性酶(例如磷酸酯酶、嘧啶和嘌呤核苷磷酸化酶)，用来使核糖基和三唑反应制成三唑核苷(例如三氮唑核苷)。然而，实际上这些方法并不能产生商业上所需量的三氮唑核苷。在某些情况下，由不同的异养性嗜温微生物产生的酶在不足以产生高产量的温度下是有活性的。在某些情况下，该过程很长，增加了被其它微生物污染的可能性。这样，该过程变得复杂了，致使在底物特异性酶纯化时的方法复杂了。
因此，本发明的目的是提供使核糖基与三唑反应的改良方法，以得到例如三氮唑核苷这样的三唑核苷药用活性化合物。
本发明的另一目的是提供产生高收率和杂质少的药用活性化合物的方法，因而是非常有效率的方法。
本发明的另一目的是提供这样的方法使诸成分更容易接触，于反应混合物中彼此更好地相互作用。
本发明的另一目的是所用的方法可用磷酸酯酶和核苷磷酸化酶来产生高收率的活性物质如三氮唑核苷。
本发明的其它目的对于本领域的技术人员由以下的发明综述及其实施方案的详细说明中会是很清楚的。
本发明的一个方面是提供了一种制备具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法，例如制备三唑核苷，如三氮唑核苷，是在嗜热细菌(如优选为排硫嗜热菌)的存在下作为催化反应的酶源，将三唑(如1，2，4-三唑-3-甲酰胺)与核糖基给体(例如核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，如尿苷和胞苷，嘌呤核苷，如鸟苷、肌苷和腺苷，嘧啶核苷酸如5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸如5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)反应。
嗜热细菌可定义为在较高温度例如高达大约90-95℃仍可存活的细菌，也包括排硫嗜热菌，它在40-80℃下仍存活。
排硫嗜热菌天然存在于新墨西哥热泉(大地构成泉)，温度74℃，pH7.0，HS-浓度1mg/升。该微生物为革兰氏阴性菌，非运动性菌，0.5-1.0×3-20μm，可形成长度达1cm的细胞链。形成的丝状体无荚膜。硫沉积在细胞外。该微生物可用自养培养基分离，培养基中HS-为能源，NO3-为终末电子接受体。厌氧条件需要NO2-或NO3-。由NO3-形成NO2-，无气体逸出。氧也可用作终末电子接受体，但是因为在生长所需的温度下O2的溶解度降低了，因而该菌生长较差。需氧和厌氧培养所用的交替能源包括有己糖、HS-、SO3＝、和S2O3＝。最佳温度为70-73℃，生长温度为62-77℃(“排硫嗜热菌属和兼性厌氧兼性矿质化能营养性细菌新种，于中性pH和高温下生长”，引自Douglas E.Caldwell，Sarah J.Caldwell，和J.Paul Laycoct，Can.J.Microbiol.221509-1517)。
含有排硫嗜热菌种的样品初培养后，再对富集培养液加以纯化。
由于嗜热微生物(如排硫嗜热菌种)的自然生境是大地构成泉(此处不存在不嗜热的天然存在的其它类型的细菌)，温度范围40-80℃，我们已经根据矿泉水的组成和温度数据，从具有最高温度的矿泉选择了塞尔维亚三个矿泉的热水作为本发明用的嗜热细菌的来源-Josanicka banja(62-78℃)-Vranjski banja(78-80℃)-Sijarinska banja(41-63℃)生境特征(a)Josanicka banja位于Kopaonik山脚下，有4处药用矿泉水的大地构成泉。水温62-78℃，水的pH范围7.5-8.5。(b)Vranjska banja位于Veliki Pester山脚下，在南斯拉夫是最温热的矿水泉，也是欧洲最温热的。水中含有硫和碱，水是超高温的，而pH范围7.8-8.0。取样之处的水温范围78-80℃，但某些地段的水温范围63-92℃。(c)Sijarinska banja位于Golak山的最远端，距Leskovac 52公里，有16个矿水泉，含有碱和铁，温度范围41-63℃。取样粘滑的细菌沉积物存在于经常被温水冲洗的岩石上。在无菌条件下取样，用移液管将细菌沉积物连同水一起取入，转移到锥形瓶内，用细菌环取出沉积物，接种于试管的营养介质(液体培养基)和琼脂斜面(固体培养基)上。在用细菌环移取时，沉积物可拉成10-15cm长的丝。使用下列培养基肉汤营养液(含蛋白胨1.5％，肉提取物0.3％，NaCl 0.5％，KH2P040.03％)和营养琼脂(其组成与肉汤营养液组成相同，只是含琼脂1.6％)。
生物材料取样放到锥形瓶中，也接种到营养介质中，运回到实验室。材料富集和纯化取样的生物材料起初接种在液体营养液中培养，于45和70℃培养过夜。“过夜”的培养液用同样介质稀释20倍，再于45°和70℃培养。然后再稀释，于45℃和70℃培养过夜。用这种双程法使起始的生物材料繁殖。用“块皿法”分离纯细菌培养物，得到的单个菌落在形态学上如形状、大小、颜色和稠度是不同的，在培养皿上的生长方式也是不同的。在培养皿上培养后出现不同类型的菌落。每种菌落划线接种到营养琼脂上，于45℃和70℃培养。培养出的菌落再接种在琼脂斜面上。用这种方法使采自Josanicka、Vranjska和Sijarinskabanja的生物材料富集和纯化。自Josanicka banja分离出4种形态学上不同的菌落，称作J1，J2，J3(排硫嗜热菌)和J4。自Vranjska banja的水中分离出的两种菌落称为V1和V2，自Sijarinska banja只分离出一种细菌培养物，因此在样品纯化后，总共分离出7种形态学不同的嗜热菌(菌落)，从Vranjska banja得到的菌落实际上与从Josanickabanja得到的菌落是一样的(V1＝J2，V2＝J3)。分离出的嗜热菌的纯培养物的分离和保存(a)分离出的细菌培养物保存在培养皿和琼脂斜面上，4℃保存，每1个月转种1次。(b)所有分离出的培养物冻干，于4℃贮存备用。
本发明的另一方面是提供了生产药用活性的三唑核苷如三氮唑核苷的方法，该过程是在由嗜热菌(如排硫嗜热菌)分泌的核苷磷酸化酶的存在下发生的。
本发明的另一方面是用嗜热菌生产药用活性的三唑核苷，例如三氮唑核苷，这类菌优选排硫嗜热菌。
因此，本发明的另一方面是由于嗜热菌(优选排硫嗜热菌)的存在，意外地提高了制造这类活性化合物方法的价值。
皆知，无机磷酸盐源(优选磷酸二氢钾)作为磷酸盐源作为催化剂参与了核糖磷酸化的生化途径。
本发明的酶促合成的反应方案如下 R可以是1)NH2三氮唑核苷2)OH3)烷氧基〔当未制成三氮唑核苷时，按本领域技术人员已知的任何方法将生成的产物转变成三氮唑核苷〕 〔〕*本步骤是任选的，这取决于核糖供给体是核苷酸还是核苷，例如步骤(e)步骤(e) 步骤(f)由核糖-1-磷酸开始，步骤如下 (由于核糖-1-磷酸昂贵且不太稳定，作为合成例如三氮唑核苷的原料是不经济的，不如其它物质如尿苷合算)。
由于嗜热细菌允许提高反应温度，并且用改进的酶促反应方法进行制造，因而合成费用降低了，例如增加了反应速率，增加了原料的溶解度，反应中的细胞溶解作用使酶和底物更好地接触，降低了竞争性微生物污染的危险，降低了同时发生竞争性反应的可能性，并改善了总的反应收率。
一个实际例子是本发明的合成方法可用来制造三氮唑核苷。为此，使1，2，4-三唑-3-甲酰胺(TCA)与一种核糖供给体(例如最好是尿苷)，浓度宜略高于TCA摩尔量(例如1.2∶1)，在无机磷酸盐源如磷酸二氢钾作为催化剂存在下酶促合成三氮唑核苷。用于本反应混合物的酶源最好是排硫嗜热菌的非繁殖性细胞，这些细胞随后溶解。非繁殖性细胞是指不生长和不繁殖的细胞。细胞的随后溶解能够使酶或酶性物质与底物直接接触以进行例如三氮唑核苷的酶促合成反应，而不是通过活细胞的某些其它代谢过程合成，在后者情况下细胞是活的，三氮唑核苷的合成会在细胞内进行，即在不同的条件下进行。pH最好是5-9的范围，优选温度是50-80℃。反应一般于1-48小时内完成。
核糖的适宜供给体可以是核糖-1-磷酸，嘧啶和嘌呤核苷和嘧啶和嘌呤核苷酸。嘧啶核苷酸包括5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)；嘌呤核苷酸包括5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)，嘧啶核苷包括尿苷(优选的)和胞苷；嘌呤核苷包括鸟苷、肌苷和腺苷。
一个实例中是将一定浓度的湿细菌生物量掺入到反应混合物中。在反应混合物中的湿细菌生物量为50-60mg/ml。在一个实例中的湿细菌生物量的制备是按本领域的技术人员所熟悉的常用的方法制成排硫嗜热菌的浓集物。
在用于实例中的排硫嗜热菌细胞的发育和制备时，培养用的营养介质有如下成分蛋白胨I、肉提取物、氯化钠、磷酸二氢钾、硫代硫酸钠五水合物和蒸馏水。主培养物的制备是将种子培养物接种于营养介质中，然后在50℃于空气存在下在振荡器上于100rpm连续搅拌培养18小时。培养到时后，于2700rpm离心30与钟将细胞与营养介质分开，弃去上清液，收集由湿细胞生物量构成的沉降物。
在本制备中进行如下操作营养介质的组成和制备介质组成蛋白胨I 6g肉提取物 1.3gNaCl 2.0gKH2PO40.12gNa2S2O3·5H2O 0.099g蒸馏水加到 440ml称量上述量的蛋白胨、肉提取物、NaCl和KH2PO4分别加到容量为200ml的玻璃器皿中，用100ml蒸馏水分别溶解各个成分，慢慢混合，直到溶液完全澄明。合并溶解的成分，置于1000ml玻璃器皿中，加蒸馏水到440ml(介质在高压釜中灭菌时，水分大约蒸发10％)。
用2M NaOH水溶液调节介质pH到7.0-7.2，倾入到置于1000ml锥形瓶内的介质中。
介质灭菌，于120℃、压力为1.5大气压的高压釜中灭菌15分钟。
于无菌条件下量取100ml介质置于4只1000ml锥形瓶内，冷却到室温后加入1ml新鲜制备的0.1M硫代硫酸钠水溶液。Na2S2O3液的制备称量0.248g Na2S2O3·5H2O，溶解于10ml蒸馏水中，在无菌条件下经细菌过滤器＝0.45μ过滤到避光(铝箔)的无菌玻璃容器内。接种物的制备(种子培养液)从100ml锥形瓶中量取5ml前面制备的介质，转移到琼脂斜面上。用无菌细菌环刮取琼脂斜面上的细菌重新悬浮并将悬浮液转移到空管(16cm×10mm)内，振摇(用旋涡振荡器)1-2分钟，得到均匀的悬浮液，显微镜下看不到菌丝和细菌沉降物。
将这样制得的细菌悬浮液接种于含有95ml介质的锥形瓶内。
用无菌塞塞住接种后的介质瓶，无菌塞用棉花和纱布制成，于50℃和空气中振摇培养6小时，100rpm搅拌并通气(K1Λ＝0.64mM O2/分钟)。培养到时后，检查得到的接种物(种子)pH应为7.4-7.8。如果接种物的pH不对，则不能用来制备主培养物。主培养物的制备将上面制成的种子培养物各5ml接种到3个含95ml介质的锥形瓶内。用无菌夹层塞(双层纸棉)闭塞，在空气中于振荡器上按上述接种物制备条件培养18小时(温度50℃，100rpm搅拌，通气K1Λ＝0.64mM O2/分钟)。
培养结束后，将主培养物合并到1000ml锥形瓶内，检测pH(应为8.3-8.6)。如果pH不对，该主培养物不能用于酶促合成。测定主培养物中细菌湿生物量的浓度(C1)以确定主培养物所需的体积(V1)测定光密度将0.5ml主培养物加入到4.5ml介质中，用涡旋振荡器剧烈振摇使均匀化。用未加细菌的介质作对照测定610nm处的光密度。
用如下公式计算主培养物的细菌湿生物量浓度(C1)C1＝3.89×OD610mm+10.76举例若OD610mm＝4.8，则C1＝29.6mg/ml(主样品液中细菌湿生物量浓度)若OD610mm＝5.5，则C1＝32mg/ml(主样品液中细菌湿生物量浓度)。为进行酶促反应确定主培养物所需的体积(V1)用如下公式确定需被离心定出反应混合物体积(V2)的主培养液体积(V1)V1=C2×V2C1]]>式中C1为用标准曲线测定OD610而确定的主培养物中细菌湿生物量浓度C2为反应混合物中细菌湿生物量的最佳浓度(58mg/ml)V2为反应混合物的体积。举例若C1＝29.6mg/ml，V2＝50ml，则为了使反应混合物中最终的细菌湿生物量浓度为58mg/ml时，离心的主培养液所需的体积为100.0ml。
若C1＝32mg/ml，V2＝50ml，则V1＝90.5ml。自主培养液中分离细胞方法将V1ml主培养物(90.5-100ml)离心(2700rpm)30分钟，沉降质，倾去上清液，将得到的沉降物(约2.9g)重新悬浮于5ml无菌重蒸馏水中，转移到无菌试管内，该悬浮液中含有2.0×107-109个活细胞/ml，用于进行酶促反应。酶促反应和分离将嗜热菌的湿细胞块重新悬浮于蒸馏水中，将此细菌悬浮液引入到溶液中，使诸成分最终浓度为成分 浓度TCA 100mM尿苷 120mMKH2PO450mM嗜热菌 58mg/ml(于一实例中细菌生物量中无营养物)制得酶促反应混合物。
将酶促反应混合物于60℃保温24小时(保温过程中因没有营养物和反应介质的高渗性，使活细胞溶解)。
酶反应完全后，将药用活性物质如三氮唑核苷，与反应的副产物和残留的反应试剂分开并纯化。这种提取、纯化和分离操作例如是通过分步沉淀法，基于反应介质中产物、副产物和原料的溶解度不同进行的，也可以使用本领域的技术人员已知的其它的提取、纯化和分离的方法。
可用柱层析法，例如用适宜的离子交换柱，例如当要除去尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和无机磷酸盐时，它们可用强阴离子交换树脂(例如Dowe，Cl-型)除去。当要除去痕量的阳离子型杂质(K+、NH4+、重金属等)时，也需要强阳离子交换树脂(如Dowe50W，H+型)。药用级别的经用水洗脱和从浓缩、冷却的洗脱液(最好再加入乙醇)结晶后可被回收，收率为80-90％。
在制造三氮唑核苷时，核糖供给体对三氮唑核苷的产量影响如表1所示表1核糖供给体三氮唑核苷收率(％)鸟苷21.0胞苷32.0尿苷80.0肌苷4.0腺苷39.95-UMP 40.0表2列出了用尿苷作核糖供给体和1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应时反应混合物保温的温度对三氮唑核苷产量的影响
表2反应温度(℃) 三氮唑核苷收率(％)50 56.760 84.665 55.370 29.7尿苷为核糖供给体，作为催化剂的磷酸二氢钾(KH2PO4)的浓度对三氮唑核苷产量的影响列于表3。
表3KH2PO4浓度(mM) 三氮唑核苷收率(％)25 80.3650 84.9475 82.17100 73.77(mM为毫摩尔)在排硫嗜热菌存在下三氮唑核苷的制备按如下反应流程进行 (排硫嗜热菌中的酶优选用于由尿苷和1，2，4-三唑-3-甲酰胺合成三氮唑核苷。尿苷和无机磷酸盐在嘧啶核苷磷酸化酶的作用下转变成核糖-1-磷酸和尿嘧啶。在核苷酶的作用下同时发生尿苷的降解生成尿嘧啶和核糖。最后，嘌呤核苷磷酸化酶催化核糖-1-磷酸与1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应，生成无机磷酸盐和三氮唑核苷)。
用嗜热菌作为酶促反应的酶源显然能使反应在提高的温度下进行，从而提高了酶的活性并改善了TCA的溶解度。由于较短的和比较经济的制备细菌生物量的方法(用未处理的细菌细胞操作)，由于细胞溶解作用使酶释放，使这些酶与底物较好地接触而增加了酶促反应的效率，由于缩短了细胞蛋白的变性和分离过程，由于选择适宜的层析柱缩短了层极纯化过程，使总的制备时间缩短了。除了在较高温度下操作外，还由于选择了适宜的核糖供给体、试剂的摩尔比和催化剂，由于制备并选择了适宜量的细菌湿生物量，选择了反应的pH以及确定了分离和纯化的条件，该酶促反应有较高的收率(转化百分率)，在终产物的分离上也是有较高收率的。在提高的温度下细菌生物量制备和酶促合成防止了其它微生物的污染。由于在反应过程中发生溶菌作用，因而在酶促反应完全后没有细胞的失活问题。
现在用如下的酶促合成三氮唑核苷的实施例对本发明加以说明。实施例1将排硫嗜热菌加入到富含能源Na2S2O7的无菌营养介质中，后者的pH7.0，接种过的培养基通气下50℃温育18小时。温育完毕后，达到所需的生物量，于2700rpm离心分离出细菌，沉降下来的细胞重新悬浮于蒸馏水中，混匀。
将排硫嗜热菌的未经处理的完整细胞细菌生物量加入到含有120mM尿苷、100mMTCA和50mM KH2PO4的pH为6.8的反应混合物中，使反应混合物中湿生物量的最终浓度为58mg/ml。将反应混合物不断地混合，于60℃温育24小时。在温育过程中，活细胞逐渐在反应混合液中溶解(由于没有营养物供给以及反应介质的高渗性)。温育毕，将反应混合物离心，除去沉降物。上清液于90℃加热处理20分钟使酶失活和变性，蛋白沉淀。得到的上清液真空下浓缩，使尿嘧啶浓度为20-40mg/ml(用HPLC测定)，此时大部分残留量的尿嘧啶、TCA和部分量的尿苷被除去。调节溶液pH至9后，分离出大量的无机磷酸盐，调节得到的上清液至pH11.5，用装有强阴离子树脂(Dowex1×8Cl-型)的离子交换柱进行纯化。三氮唑核苷用水自柱上洗脱出，而残留量的尿苷、尿嘧啶、TCA、尿苷一磷酸和无机磷酸盐仍留在柱上。水洗脱液经过Dowe50W H+型离子交换树脂，而痕量的阳离子形式的杂质留在柱上。洗脱液经浓缩和冷却后，结晶出药用级别的三氮唑核苷，收率80-90％。实施例2
将前述的嗜热细菌J1接种到pH7.0的无菌介质中，于60℃恒温箱培养24小时(“停滞培养”)。得到的初级菌种再接种到新鲜的营养介质中，并于同样条件下培养24小时。二级菌种再接种到新鲜介质中，于同样条件下培养18小时，制得主培养物。于2700rpm离心使细菌沉降，得到的沉降物再悬浮于蒸馏水中，混匀。将J1细菌的湿生物量加入到10ml反应混合物中，后者含有32nM TCA、60mM尿苷和50mM KH2PO4，pH7.0，使反应混合物中细菌的最终浓度为76mg/ml。将反应混合物均化后，于45℃温育24小时，得到的三氮唑核苷产量为14.9mM(16.6％)。实施例3将由琼脂斜面得到的排硫嗜热菌接种于富含30ppm Na2S2O3-3的无菌营养介质中，将初级菌种接种。于50℃和100rpm搅拌下有氧培养24小时后，将初级菌种再接种到新鲜营养介质中，于同样条件下将二级菌种培养24小时。将二级菌种再接种于新鲜营养介质中，接种主培养物并于同样条件下温育18小时。然后于2700rpm离心，得到的细菌沉降物再悬浮于蒸馏水中，振荡使均匀。将上述制备的湿排硫嗜热菌生物量加入到10ml反应混合物中，其中含有100mM TCA、120mM核糖供给体(列于表中)和25mM KH2PO4，pH68。将混合物均化后，60℃温育24小时，得到的三氮唑核苷产率列于表1。
现有技术方法与本发明方法制备三氮唑核苷的收率的比较如表4所示I.本申请人的发明温度 50-80℃时间(小时) 1-48核糖∶TCA比值1.2∶1收率(％) 85II.美国专利3976545酶来源是小牛脾脏0-50℃0.082∶554.1III.美国专利4458016酶来源是肺炎克氏杆菌55-65℃0.17-204.9∶1**24.2***为核糖供给体与TCA的摩尔浓度比**用核糖-1-磷酸，三氮唑核苷收率为24.2％，核糖∶TCA比值为4.9∶1。若按美国专利4458016用尿苷作核糖供给体，则三氮唑核苷收率为11.5％，核糖∶TCA＝4.6∶1。
由于在不背离本发明范围的情况下可对本发明进行许多改变，所以本文包含的所有材料都是为了说明本发明而无限制的意图。
权利要求
1.一种在嗜热细菌和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下使三唑与核糖供给体反应生产具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法。
2.权利要求1的方法，其中细菌是排硫嗜热菌。
3.权利要求2的方法，其中药用活性化合物是三氮唑核苷。
4.权利要求2的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸。
5.权利要求2的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
6.权利要求2的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
7.权利要求4的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
8.权利要求5的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
9.权利要求5的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
10.权利要求6，7或8的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
11.权利要求6，7，8或10的方法，其中核糖供给体是尿苷。
12.权利要求2，5或9的方法，其中核糖供给体是尿苷，其存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
13.权利要求5的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
14.权利权利要求6的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
15.权利要求7的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
16.权利要求8的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
17.权利要求9的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
18.权利要求10的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
19.权利要求11的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
20.权利要求12的方法，其中作为催化剂的无机磷酸盐是磷酸二氢钾。
21.上述任何一项的方法，可得到三氮唑核苷。
22.权利要求1，2，4，6，7，10，11，14或15的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
23.生产药用活性三唑核苷的方法，其中在由嗜热细菌来源的核苷磷酸化酶制剂和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下发生反应。
24.权利要求23的制备核苷的方法，其中细菌是排硫嗜热菌。
25.权利要求24的方法，其中反应是在核糖供给体和三唑的存在下进行的。
26.权利要求25的方法，其中反应是在核糖供给体和三唑的存在下进行的。
27.权利要求25的方法，其中药用活性化合物是三氮唑核苷。
28.权利要求25的方法，其中三唑是1，2，4-三唑-3-甲酰胺。
29.权利要求28的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸；嘧啶核苷，尿苷和胞苷；嘌呤核苷，鸟苷，肌苷和腺苷；嘧啶核苷酸，5′-尿苷一磷酸(5′-UMP)和嘌呤核苷酸，5′-腺苷一磷酸(5′-AMP)。
30.权利要求25，26，27或28的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量。
31.权利要求25或27的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
32.权利要求26，27或29的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
33.权利要求30，31或32的方法，其中核糖供给体存在的摩尔量大于三唑的摩尔量，核糖供给体是尿苷。
34.权利要求23，24，25，27或31的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
35.权利要求23，24，25，26，27，28，29，30，31，32或33的方法，还包括制备三氮唑核苷的步骤。
36.一种用排硫嗜热菌酶促合成三氮唑核苷的方法，包括以磷酸二氢钾为催化剂和在对热稳定的嘧啶核苷和嘌呤核苷磷酸化酶的存在下，使核糖供给体与1，2，4-三唑-3-甲酰胺反应，磷酸化酶来自完整的排硫嗜热菌，该菌在反应混合物中不繁殖，pH范围为5-9，温度范围是50-80℃，时间为1-48小时，其中细菌在反应混合液中的浓度为50-60mg/ml。
37.权利要求36的方法，其中分离和纯化三氮唑核苷是用所选类型的离子交换树脂的柱层析法，根据反应混合物中各组分溶解度的不同使副产物和残留的反应物分开。
38.权利要求36的方法，其中核糖供给体选自核糖-1-磷酸，嘧啶核苷，嘌呤核苷，嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸，其摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
39.权利要求36的方法，其中核糖供给体是尿苷，其摩尔量大于1，2，4-三唑-3-甲酰胺的摩尔量。
40.权利要求36的方法，其中作为催化剂使用的磷酸二氢钾的浓度，以每100mM的1，2，4-三唑-3-甲酰胺计，为25-100mM。
41.权利要求40或42的方法，其中三氮唑核苷的分离和纯化是经热处理除去残留的溶解细胞和蛋白，将预先真空浓缩的上清液pH调节到11.5，用分步沉淀法除去残留量的反应物和副产物，用含有所选类型的离子交换树脂的预先再生的柱经层析纯化，用水洗脱出全量的三氮唑核苷。
42.权利要求44的方法，其中层析柱分别装载Dowex1×8，Cl-型和Dowex50W，H+的强阴离子和强阳离子交换树脂。 其中R选自NH2(产生三氮唑核苷)，OH或烷氧基 其中R选自NH2(产生三氮唑核苷)，OH或烷氧基
49.在排硫嗜热菌存在下制备三氮唑核苷的方法，该方法包括下列步骤 此处Pi是无机磷酸盐
全文摘要
在嗜热菌和作为催化剂的无机磷酸盐源的存在下使三唑与核糖供给体反应生产具有与三唑相连的核糖基的药用活性化合物的方法。
文档编号C12P19/38GK1111061SQ94190019
公开日1995年11月1日 申请日期1994年5月12日 优先权日1993年12月14日
发明者奥佩西克·戈德纳, 格利吉克·利尤宾卡, 劳德罗维克·泽尔基卡, 齐夫科维克·瓦伦西亚, 马蒂克·洛拉, 史密斯·罗伯特 申请人:奥佩西克·戈德纳, 格利吉克·利尤宾卡, 劳德罗维克·泽尔斯卡, 齐夫科维克·瓦伦西亚, 马蒂克·洛拉, 史密斯·罗伯特
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