一种碳纳米点及其制备方法与应用与流程

本发明涉及纳米材料技术领域，特别是涉及一种碳纳米点及其制备方法与应用。

背景技术：

碳纳米点(cds)是一种获取途径经济、简单的多功能碳基纳米材料，具有超小的粒径、良好的光热稳定性与水溶性、易于功能化修饰以及自身具备荧光能力的特点，此外，cds还具备药物递送能力，因此，其在近年来受到了人们的广泛关注。即便如此，但cds的发展依然受制于其低效的产率。此外，作为一种可用于生物成像以及药物递送的纳米材料，其应用前景取决于其在体内所展现出的毒性，然而目前针对cds的体内毒性研究十分缺失。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种便捷、经济的cds的制备方法，弥补cds在安全性评价上的缺失，促进cds的临床转化。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供了一种碳纳米点的制备方法，包括以下步骤：

(1)将甘蔗蜜至于高压釜中进行水热反应，得到第一产品；

(2)将所述第一产品冷却至室温，加入去离子水进行混合，微孔滤膜过滤，得到滤液；

(3)将所述滤液与无水乙醇混合，离心，去除颗粒，得到上清；

(4)经减压蒸馏去除步骤(3)所得上清中的溶剂，再将蒸馏产物复溶于去离子水中，再经72小时的冷冻干燥得到第二产品，所述第二产品即为碳纳米点。

作为本发明的进一步改进，所述水热反应的温度为250℃，时间为12h。当反应温度与反应时间低于以上数值时，甘蔗蜜将无法充分反应，致使碳纳米点的产率下降；当反应温度与反应时间高于以上数值时，碳纳米点将会被过分加热，导致其表面结构被破坏。

作为本发明的进一步改进，步骤(1)中所述甘蔗蜜的添加量为5.0g。甘蔗蜜易于获取、价格低廉，且其中含有丰富的糖分，是一种适用于碳纳米点制备的环保型原材料。由于反应釜内部空间为10ml，当甘蔗蜜的添加量大于5.0g时将会导致高压釜内的反应空间体积减小，致使碳纳米点的产率下降。

作为本发明的进一步改进，步骤(2)所述过滤为以0.22μm的微孔滤膜去除所述滤液中的大颗粒。

作为本发明的进一步改进，步骤(3)中所述滤液与所述无水乙醇的体积比为1：25。加入无水乙醇的目的是为了改变溶液的极性，根据“相似相溶”原理，当溶液的极性降低时，在步骤(1)中未经分子间脱水形成碳纳米点的糖类分子将会被析出，从而在后续的离心中实现碳纳米点与糖类分子的分离。

作为本发明的进一步改进，步骤(3)所述离心为在6000rpm下离心10min。

本发明所述方法所构建的碳点产量高达8.2％，碳点尺寸集中分布在1.42nm～3.55nm区间，平均尺寸为2.4nm。

本发明通过一种便捷、经济的方法制备了cds，并以斑马鱼作为体内评价的动物模型，对cds的安全性进行了系统的评价，结果证明cds在低于200μg/ml时不会对斑马鱼产生毒副作用，根据美国鱼类及野生动物管理局(fws)的相关规定可划分为“几乎无毒”。本发明弥补了cds在安全性评价上的缺失，促进了cds的临床转化。

本发明将具有高糖分含量的甘蔗作为制备cds的原料，通过对水热法制备参数的调整获取了更高的cds产率。为促进cds的临床转化，我们借助与人类基因高度相似、繁殖与生长发育迅速的脊椎动物斑马鱼对cds的体内毒性进行了系统的评价。进一步地，我们基于cds制备了用于检测co²⁺与edta的开关型双功能荧光探针。

本发明还提供一种由所述的碳纳米点的制备方法制备得到的碳纳米点。

本发明还提供所述的碳纳米点在制备生物成像试剂中的应用。

本发明还提供所述的碳纳米点在制备检测co²⁺和edta的开关型双功能荧光探针中的应用。

本发明还提供所述的碳纳米点在制备细胞内co²⁺和edta的多色荧光传感检测试剂中的应用。

本发明还提供所述的碳纳米点在研究斑马鱼毒副作用方面的应用。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明提供了一种便捷、经济的cds的合成方法；

(2)本发明指明了cds在低于200μg/ml时不会对斑马鱼产生毒副作用，弥补了cds在安全性评价上的缺失，促进了cds的临床转化；

(3)本发明解决了碳点产率低的问题，荧光量子产率可达80-105％。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明实施例1cds的制备过程示意图；

图2是本发明中对实施例1制备的cds进行表征的结果,(a)cds在高分辨率投射电镜下的成像及其粒径分布；(b)cds的ft-ir分析图谱；(c)cds的uv-vis分析图谱；

图3是本发明实施例4中不同浓度的cds对斑马鱼胚胎存活率的影响；

图4是本发明实施例4中cds在斑马鱼胚胎与幼鱼中的成像图；

图5是本发明实施例4中不同浓度的cds对斑马鱼行为学的影响；

图6是本发明实施例4中不同浓度的cds对斑马鱼大脑中多巴胺能神经元细胞的影响；

图7是本发明实施例4中cds经口服后在斑马鱼各个主要器官中的浓度变化情况；

图8是本发明实施例4中经不同浓度cds对斑马鱼培养后，腮的组织切片的h&e染色结果；

图9是本发明实施例4中经不同浓度cds对斑马鱼培养后，心脏的组织切片的h&e染色结果；

图10是本发明实施例4中经不同浓度cds对斑马鱼培养后，肝脏的组织切片的h&e染色结果；

图11是本发明实施例4中经不同浓度cds对斑马鱼培养后，肠的组织切片的h&e染色结果；

图12是本发明实施例4中经不同浓度cds对斑马鱼培养后，脑的组织切片的h&e染色结果。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1cds的制备

如图1所示，将5.0g甘蔗糖蜜在高压釜中于250℃加热12h，得到产品，然后将所述产品冷却至室温，加入10ml去离子水混合，并通过0.22μm孔膜除去大颗粒。然后将所得滤液与250ml无水乙醇混合，并将溶液以6000rpm旋转10min以去除可见的棕色颗粒。收集上清液，减压蒸发，重悬于5ml去离子水中，冻干72h，即得0.41gcds，量点产率为8.2％，荧光量子产率为94.26％。

实施例2cds的表征

如图2a所示，cds在电镜中所呈现的形状为球形，其平均粒径为2.4nm，zeta电势为-26.88mv。

通过ft-ir对cds进行表征，结果如图2b，3390cm^-1处的广泛特征峰是由共聚物中的o-h引起的，2983，1565，1402cm^-1处的峰分别由-c–h，c＝o以及–c＝c引起，1400-1000cm^-1范围内的所有峰都是由c-o与si-o-si的伸缩振动所引起的。

cds经uv-vis分析结果如图2c，260nm与320nm处的特征峰分别是由c＝o中π–π^*跃迁以及n–π^*跃迁所引起的。

实施例3斑马鱼的饲养

雄性和雌性斑马鱼都以14/10h的明/暗周期饲养。通过将成年雄性和雌性以2：1的比例混合在一个2l的繁殖池中，使繁殖最大化，繁殖前一晚通过2mm筛网将其分开。斑马鱼在无光照条件下开始繁殖行为，将产生的胚胎置于e3培养基(13.7mmnacl，540μmkcl，25μmna2hpo4、44μmkh2po4、300μmcacl2，100μmmgso4、420μmnahco3，ph7.4)中，并在28℃条件下进行培养。

实施例4cds对斑马鱼的毒性评价

cds对斑马鱼的胚胎毒性评价：用e3培养基(control)在24孔板中将cds稀释至50、100、150、200、250、300和400μg/ml，然后分别用于培养1.5hpf斑马鱼胚胎(每个浓度20个胚胎)。如图3所示，在cds浓度在200μg/ml以下时不会对斑马鱼胚胎的存活率造成影响。

cds对斑马鱼胚胎及幼鱼的成像：选用6hpf的胚胎和5dpf的幼鱼，分别用e3培养基(control)或5mg/mlcds在28℃下处理斑马鱼胚胎和幼鱼1h，然后使用0.04％ms-222麻醉斑马鱼，并放置在1％低熔点琼脂糖中，通过荧光显微镜进行观察。结果如图4，无论是胚胎还是幼鱼，在经cds的培养后都出现了体内的荧光聚集，并且不同组织器官展现出了不同的荧光强度，说明不同的组织器官对cds具有不同的亲密度。值得一提的是，在幼鱼的眼部发现了强烈的荧光聚集，说明cds具备跨跃bbb的能力，因此，我们进一步评价了cds对中枢神经系统所造成的影响。

cds对斑马鱼的行为学影响：将3dpf的斑马鱼幼鱼(每组n＝12)暴露于不同浓度的cds中(50、100、150、200、350、500、1000和2000μg/ml)3天，然后分别将它们转移至配有自动视频跟踪系统的zebrabox中的96孔板，并记录斑马鱼在10min内移动的距离(以毫米为单位)。结果如图5所示，在50-150μg/ml的浓度下，cds不会对斑马鱼的行动造成影响，然而当cds的浓度达到200μg/ml时则会对斑马鱼的行动产生影响。这一结果表明高浓度的cds将会对斑马鱼的中枢神经系统造成损害。

cds对斑马鱼脑部多巴胺能神经元的影响：用4％多聚甲醛固定斑马鱼(7hpf)5h，然后使用pbst中的2％lambserum和0.1％bsa对所有样品封闭1h。然后在4℃下用鼠抗th探针对样品孵化过夜，然后用pbst洗涤6次(每次30min/次)，并与偶联到alexafluor488的山羊抗小鼠二抗一起孵育。使用image-proplus6.0软件对th⁺细胞数量进行评估。结果与行为学评价一致(图6)，200、350、500、1000和2000μg/ml的cds将会使斑马鱼中的th⁺神经元分别降低9.68％，17.06％，31.25％，43.42％和57.14％，而当cds的浓度低于200μg/ml时将不会对其数量造成影响。

cds经口服后在斑马鱼体内的分布：用ms-222(150μg/ml)对成年斑马鱼进行麻醉，然后放入浸泡在水中的海绵中，头部伸出。将带有小软管的移液管轻轻插入斑马鱼的嘴和咽中0.8-1cm，再将10μlcds溶液(10mg/ml)缓慢注入斑马鱼体内，以确保注入的溶液不会反流。给药0、0.5、2和5h后，用过量的ms-222(300mg/ml)麻醉斑马鱼，并测定主要器官(脑、腮、心脏、肝脏和肠)中cds的含量。结果如图7所示，除腮以外，cds在所有器官内的浓度都在0.5h时达到最大，随后逐渐减小。

cds对斑马鱼各器官影响的病理学观察：将斑马鱼暴露于一系列cds浓度(0、100、250、500、2000和5000μg/ml)14天，收集脑、腮、心脏、肝脏和肠组织，并使用4％多聚甲醛固定48h，然后使用乙醇梯度将样品脱水，并制成4μm厚的切片，以进行苏木精和曙红(h&e)染色以进行组织病理学研究。当cds浓度达到250μg/ml时，腮、心脏、肝脏以及肠组织都开始出现轻微的组织损伤，随着cds浓度的增大，这一趋势越发显著，见图8-图11。而脑组织则是在cds的浓度达到500μg/ml时也开始表现组织损伤，如图12。

本实施例中所用cds为实施例1制备的cds。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除