一种黑水虻复合氨基酸肥料及其制备方法与流程

2021-01-30 23:01:10|

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本发明涉及微生物发酵工程
技术领域：
，特别涉及一种黑水虻复合氨基酸肥料及其制备方法。
背景技术：
：氨基酸能够促进植物根系生长，壮苗、健株、增强叶片的光合功能及作物的抗病虫害能力，对多种作物均有较显著的增产效果。而天然土壤中存在的氨基酸含量少，并且土壤中的微生物土壤动物等对土壤中的氨基酸的摄入，使植物在竞争土壤中氨基酸的过程中往往难以取得优势。因此，现有许多作物往往都需要进行人工施肥的方式来补足作物生长所需的氨基酸。在人工施肥的过程中，为使肥料实现既高效且无污染，通常是采用高蛋白物质分解成氨基酸来作为生物化肥，而目前对于高蛋白物质水解生产氨基酸肥料，通常采用蛋白酶或微生物降解鱼粉制备得到鱼蛋白肥料，主要成分为氨基酸、多肽和部分蛋白质形成的混合物以及少量的微量元素和脂类、维生素等成分，其所含有氨基酸种类有限、含量低，鱼蛋白作为营养剂其肥料效果慢，且价格较高。黑水虻(hermetiaillucensl.)为腐生性的水虻科昆虫，能够取食禽畜粪便和生活垃圾，因其繁殖迅速，生物量大，食性广泛、吸收转化率高，容易管理、饲养成本低，动物适口性好等特点，通常用于生产高价值的动物蛋白饲料和养殖场粪便等垃圾问题的处理，以对垃圾粪便进行分解加以利用，达到环保资源化的目的。黑水虻富含粗蛋白45％-48％，脂肪34％-35％，其粗蛋白含量与鲜鱼、鱼粉及肉骨粉相近或略高。黑水虻的营养成分也较为全面，含有动物所需要的多种氨基酸，其每一种氨基酸含量都高于鱼粉，其必需氨基酸总量是鱼粉的2.3倍，蛋氨酸含量是鱼粉的2.7倍，赖氨酸含量是鱼粉的2.6倍。但由于黑水虻虫体繁殖快，现有将黑水虻作为高蛋白物质，利用微生物发酵技术获取氨基酸肥料的过程中，往往存在蛋白质水解缓慢且不稳定，易出现未分解的活体，水解氨基酸含量低、发酵周期长等问题。因此，寻找一种发酵周期短且分解更加彻底、稳定的黑水虻复合氨基酸肥料的制备工艺，对实现以黑水虻蛋白为主的氨基酸液体肥料的广泛应用和生产具有重要的意义。技术实现要素：鉴以此，本发明提出一种黑水虻复合氨基酸肥料及其制备方法。本发明的技术方案是这样实现的：一种黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，包括如下步骤：(1)黑水虻预处理：将晒干的黑水虻虫体进行粉碎，烘干至含水率≤10％，与烘干葡萄皮粉渣按照质量比(50～80):1在40～50℃热风下搅拌混合，得到预处理的复合黑水虻粉末；(2)种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种到种子培养基中进行发酵，得到种子液；(3)发酵培养基的制备：将经预处理的复合黑水虻粉末，按照质量百分比50～60％的添加量加入至发酵培养基中，得到添加有复合黑水虻粉末的发酵培养基；(4)复合发酵：将种子液按照体积比1～3％的接种量接种至发酵培养基中，在26～30℃，150～250rpm振荡发酵72～78h，得到黑水虻复合氨基酸肥料。本发明提出一种黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，通过采用微生物发酵技术，将特定的解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种到添加有复合黒水虻粉末的发酵培养基中在发酵条件为26～30℃，150～250rpm条件下发酵至完全，以充分黑水虻虫体中的蛋白质分解为氨基酸，从而制备得到含有多种氨基酸的复合氨基酸肥料。其中，本发明经过对黑水虻虫体的预处理，采用已烘干的黑水虻虫体与一定量的烘干葡萄皮粉渣混合而得的复合黑水虻粉末，并以一定量添加至发酵培养基中，进一步诱发解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521对复合黑水虻粉末的发酵分解作用，显著提高黑水虻降解率，从而使分解更加彻底，并明显缩短了发酵周期，从而得到以黑水虻蛋白为主的复合氨基酸肥料。相比现有技术微生物发酵工艺，本发明所使用的发酵培养基除少量的无机盐，没有添加额外的碳氮源，发酵培养基具有组分简单、价格低廉，原料来源广泛的特点；本发明通过对菌种的提取优选下，结合了黑水虻预处理技术以及发酵工艺优化，使得培养基发酵黑水虻添加量达到60％，有效实现了对黑水虻虫体蛋白的快速、充分地分解，明显缩短了发酵周期至72h，使制备得到的复合氨基酸肥料的氨基酸的种类丰富，氨基酸含量可达0.32mg/ml，具有原料富含丰富的蛋白质，发酵周期短，氨基酸种类丰富，黑水虻降解率高等的优点，从而建立了以黑水虻为高蛋白物质的复合氨基酸肥料生产技术，有利于实现以黑水虻蛋白为主的氨基酸液体肥料的工业化生产和更加广泛应用。进一步说明，所述解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521于2020年9月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctccno.m2020525。保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521分离于海南尖峰岭自然保护区，其16srdna序列与bacillusparalicheniformisstrainkj-16相似性最高。进一步说明，所述复合黑水虻粉末的黑水虻与葡萄皮粉渣的质量比60:1。进一步说明，所述种子培养基的配方为：每升水中包括蛋白胨8～12g、酵母提取物4～5g和氯化钠9～11g。进一步说明，步骤(2)中，将种子培养基在32～35℃，100～120rpm振荡发酵培养48～54h，得到种子液。进一步说明，步骤(4)中，所述种子液的接种量为2％。进一步说明，所述发酵培养基的配方为：每升水中包括nacl10～20g和复合黑水虻粉末15～24g。进一步说明，步骤(4)中，发酵培养基中在28℃，200rpm振荡发酵至72h，得到黑水虻复合氨基酸肥料。一种根据上述的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法制得的黑水虻复合氨基酸肥料。与现有技术相比，本发明的有益效果是：(1)本发明所使用的发酵培养基除少量的无机盐，没有添加额外的碳氮源，发酵培养基具有组分简单、价格低廉，原料来源广泛的特点；(2)本发明通过对菌种的选用和发酵工艺优化，有效缩短了黑水虻复合发酵周期至72h；(3)本发明通过黑水虻预处理技术以及发酵工艺优化，利用烘干葡萄皮渣与烘干黑水虻虫体组合，在一定的发酵条件下，诱导菌种对复合黑水虻粉末的发酵分解，不仅明显缩短了发酵周期，而且使得培养基发酵黑水虻添加量达到60％，有效实现了对黑水虻虫体蛋白的快速、充分地分解，使制备得到的复合氨基酸肥料的氨基酸的种类丰富，氨基酸含量高达0.32mg/ml；(4)建立了以黑水虻为高蛋白物质的复合氨基酸肥料生产技术，有利于实现以黑水虻蛋白为主的氨基酸液体肥料的工业化生产和更加广泛应用。附图说明图1为本发明解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521的菌落形态图；图2为本发明解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521光学显微镜的细胞形态图(考马斯亮蓝染色)；图3为本发明解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521的16srrna基因pcr扩增片段琼脂糖电泳图；图4为本发明解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521发酵黑水虻的游离态的氨基酸图谱。具体实施方式为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1-一种黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，包括如下步骤：(1)黑水虻预处理：将晒干的黑水虻虫体进行粉碎，烘干至含水率≤10％，与烘干葡萄皮粉渣按照质量比50:1在40℃热风下搅拌混合，得到预处理的复合黑水虻粉末；(2)种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种到种子培养基中，在32℃，100rpm振荡发酵培养48h，得到种子液；所述种子培养基的配方为：每升水中包括蛋白胨8g、酵母提取物4g和氯化钠9g；(3)发酵培养基的制备：将经预处理的复合黑水虻粉末，按照质量百分比60％的添加量加入至发酵培养基中，得到添加有复合黑水虻粉末的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：每升水中包括nacl10g和复合黑水虻粉末15g；(4)复合发酵：将种子液按照体积比1％的接种量接种至发酵培养基中，在26℃，150rpm振荡发酵78h，得到液体黑水虻复合氨基酸肥料。实施例2-一种黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，包括如下步骤：(1)黑水虻预处理：将晒干的黑水虻虫体进行粉碎，烘干至含水率≤10％，与烘干葡萄皮粉渣按照质量比80:1在50℃热风下搅拌混合，得到预处理的复合黑水虻粉末；(2)种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种到种子培养基中，在35℃，120rpm振荡发酵培养54h，得到种子液；所述种子培养基的配方为：每升水中包括蛋白胨12g、酵母提取物5g和氯化钠11g；(3)发酵培养基的制备：将经预处理的复合黑水虻粉末，按照质量百分比50％的添加量加入至发酵培养基中，得到添加有复合黑水虻粉末的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：每升水中包括nacl20g和复合黑水虻粉末20g；(4)复合发酵：将种子液按照体积比3％的接种量接种至发酵培养基中，在30℃，250rpm振荡发酵72h，得到液体黑水虻复合氨基酸肥料。实施例3-一种黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，包括如下步骤：(1)黑水虻预处理：将晒干的黑水虻虫体进行粉碎，烘干至含水率≤10％，与烘干葡萄皮粉渣按照质量比60:1在45℃热风下搅拌混合，得到预处理的复合黑水虻粉末；(2)种子液的制备：将解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种到种子培养基中，在33℃，110rpm振荡发酵培养54h，得到种子液；所述种子培养基的配方为：每升水中包括蛋白胨10g、酵母提取物4.5g和氯化钠10g(3)发酵培养基的制备：将经预处理的复合黑水虻粉末，按照质量百分比60％的添加量加入至发酵培养基中，得到添加有复合黑水虻粉末的发酵培养基；所述发酵培养基的配方为：每升水中包括nacl16g和复合黑水虻粉末24g；(4)复合发酵：将种子液按照体积比2％的接种量接种至发酵培养基中，在28℃，200rpm振荡发酵72h，得到液体黑水虻复合氨基酸肥料。检测上述实施例3发酵72h后获得的液体黑水虻复合氨基酸肥料的游离氨基酸，其结果如下表：表1液体黑水虻复合氨基酸肥料的游离氨基酸化合物名称保留时间/(min)响应含量/(mg/ml)含量/(％)磷酸丝氨酸3.2452226.5350.010183.2牛磺酸4.8191929.9140.006682.1尿素7.3601006.3340.006482.0天冬氨酸17.821482.2340.001490.5苏氨酸24.512604.5610.002470.8丝氨酸26.763506.9970.001400.4天冬酰胺30.152105.2480.001060.3谷氨酸32.3446189.8850.0842726.2甘氨酸46.6481650.6500.004671.5丙氨酸48.8453287.8480.007682.4α氨基丁酸52.816756.4250.002120.7缬氨酸56.1891510.7800.004731.5蛋氨酸61.917730.4840.004061.3异亮氨酸64.981763.4540.003401.1亮氨酸66.3151658.9780.005401.7酪氨酸69.1392589.1370.012373.8苯丙氨酸72.5686476.9950.0900128.0β丙氨酸74.86783.4050.000740.2β氨基异丁酸75.579163.5130.001680.5γ氨基丁酸77.621132.9780.000390.1组氨酸82.5368819.3630.030889.63甲基组氨酸83.733126.6600.000550.2肌肽88.528169.4370.001800.6色氨酸89.9071468.2860.018755.8鸟氨酸93.272267.1690.000990.3赖氨酸94.7891218.7710.007212.2精氨酸102.9521978.5560.010523.3脯氨酸43.408109.9270.002010.0合计----0.32199100由上表可以看出，根据本发明的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法制得的复合氨基酸肥料的氨基酸的种类丰富，氨基酸含量可达0.32mg/ml。其中，游离态的氨基酸含量图谱如图4所示。本发明解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521的菌落形态图和细胞形态图如图1和图2所示；解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521的dna序列为：tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtcagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatgcttgattgaaccgcatggttcaattataaaaggtggcttttagctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtacccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacaaaagtctgacggaccaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaaacttctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccaaaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagaacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaa本发明对解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521的16srrna基因pcr扩增片段进行琼脂糖电泳如图3所示；对比例1-根据实施例3的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，区别在于：步骤(1)中，将晒干的黑水虻虫体进行粉碎，烘干至含水率≤10％后，未与烘干葡萄皮粉渣混合，直接按照质量百分比60％的添加量加入至发酵培养基中；其余均与实施例3相同。对比例2-根据实施例3的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，区别在于：步骤(1)中，采用新鲜的黑水虻幼虫直接进行粉碎后，与未烘干的葡萄皮粉渣按照质量比60:1直接在常温下混合，得到复合黑水虻粉末，其余均与实施例3相同。对比例3-根据实施例3的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，区别在于：步骤(2)中，将种子液按照体积比5％的接种量接种至发酵培养基中，其余均与实施例相同。对比例4-根据实施例3的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，区别在于：步骤(2)中，采用市售的解淀粉芽孢杆菌替换解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521接种至种子培养基中进行发酵，得到种子液，其余均与实施例3相同。根据上述实施例3和对比例1～4的黑水虻复合氨基酸肥料的制备方法，设为实验组1和对照组1～4。(1)分别测定不同时期的复合黑水虻粉末的降解率，复合黑水虻粉末的降解率％＝(发酵前复合黑水虻粉末添加量干重-发酵后滤渣干重)/发酵前复合黑水虻粉末添加量干重×100％，其结果如下表：表2不同时期的复合黑水虻粉末的降解率由上表可以看出，对比组1的黑水虻粉末和对比组2中的复合黑水虻粉末的降解率均明显下降，表明了采用一定量的烘干葡萄皮粉渣与烘干的黑水虻虫体混合，可有利于诱发解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521对复合黑水虻粉末的发酵分解作用，显著提高黑水虻降解率，从而明显缩短了发酵周期；同时，将黑水虻幼虫进行烘干处理，控制了复合黑水虻粉末的水分含量，有利于提高蛋白的分解效率，使分解更加彻底，稳定。对比组4和对比组3中复合黑水虻粉末的降解率相对于实施例3也相对较低，表明了通过对菌种的选用，并在一定的发酵条件下，有利于加快对复合黑水虻粉末的降解率，而当控制解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciensbt521种子液的接种量过多时，可能引起了菌体发酵前期的发酵速率过快，而导致后期溶氧不足，引起菌体的早衰、自溶等情况，最终使复合黑水虻粉末的降解效果明显下降。(2)分别等量取样的液体黑水虻复合氨基酸肥料，测定不同发酵时期下的氨基酸含量，测定结果如下表：表3不同发酵时期下的氨基酸含量由上表可以看出，在同一发酵时期下，实验组1获得的黑水虻复合氨基酸肥料中的游离氨基酸总含量明显增加，而对比组1～4中在发酵72h后的游离氨基酸总含量较低，其对复合黑水虻粉末的分解程度较低，蛋白质水解缓慢且不稳定。且对比组3中虽然前期氨基酸分解速度较高，但在发酵72h后还无法对复合黑水虻粉末达到充分地分解；表明了本发明通过对菌种的提取优选下，结合了黑水虻预处理技术以及发酵工艺优化，不仅使得发酵培养基中黑水虻可添加量达到60％，提高降解效率，实现了对黑水虻虫体蛋白的快速，而且分解得更加充分，在分解至72h后，所制备得到的复合氨基酸肥料的氨基酸的种类丰富，且氨基酸含量可达0.32mg/ml，显著提高液体黑水虻复合氨基酸肥料的氨基酸含量。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>海口海森元生物科技有限公司海南师范大学<120>一种黑水虻复合氨基酸肥料及其制备方法<160>1<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>1423<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1tgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgtcagcggcggacgggtgagta60acacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccgg120atgcttgattgaaccgcatggttcaattataaaaggtggcttttagctaccacttacaga180tggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgta240cccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccaaactcctacggg300aggcagcagtagggaatcttccgcaatggacaaaagtctgacggaccaacgccgcgtgag360tgatgaaggttttcggatcgtaaaacttctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaa420tagggcggtaccttgacggtacctaaccaaaaagccacggctaactacgtgccagcagcc480gcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggc540ggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactgg600ggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagaga660tgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggcgcga720aagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgc780taagtgttagagggtttccgccctttagtgctgcagcaaacgcattaagcactccgcctg840gggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtgg900agcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgac960aaccctagagatagggcttccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgt1020cagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagt1080tgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggg1140gatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcag1200aacaaagggcagcgaagccgcgaggctaagccaatcccacaaatctgttctcagttcgga1260tcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgc1320cgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaa1380cacccgaagtcggtgaggtaaccttttggagccagccgccgaa1423当前第1页1 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