一种三氧化钼纳米点抑菌材料的制备方法及其应用与流程

技术领域：

本发明属于纳米材料制备及性能检测与杀菌应用领域，涉及一种三氧化钼纳米点抑菌材料的制备方法及其应用，通过自下而上的水热方法制备的三氧化钼纳米点，利用三氧化钼纳米点的类酶性质以及吸收近红外光产生光热及光动力学性质达到杀菌的目的，抑菌效果良好且对人体无害。

背景技术：
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近年来，细菌感染性疾病正在世界范围内传播。当前，最大的任务之一就是控制传染源的传播。抗生素作为常用的抗菌剂，其滥用导致了大量耐药菌的出现，h2o2被广泛用作细菌感染的抗菌剂，有趣的是，h2o2能被具有过氧化物酶性质的功能性纳米颗粒转化为羟基自由基，对细菌的危害极大，但高浓度的h2o2对生物体同样有害。为了克服上述缺陷，迫切需要以简单且低成本的方式开发高效的抗菌材料。在天然酶的启发下，人们通过催化纳米酶所产生的有害活性氧(ros)来破坏细菌，与高成本不稳定的天然酶相比，纳米酶通常更易制备且稳定。这些特征有利于纳米酶在抗菌中的应用。现如今，已经报道了一些无机纳米材料，例如石墨烯量子点，fe3o4纳米颗粒和ceo2纳米颗粒可以模拟天然过氧化物酶的性质，将h2o2转化为羟基自由基，杀死细菌。

现如今，在抗菌纳米酶的开发中仍然存在许多挑战，在各种抗感染疗法中，包括光热疗法(ptt)在内的光活化疗法由于其无创性且副作用小而引起了广泛的关注。此外，光热的抗菌机制不同于传统的抗生素治疗，光热疗法利用局部光诱导的高温导致细菌变性死亡。使用近红外(nir)光热剂的光热疗法几乎不受工作距离或微观环境的限制，这是一种可行的方法。因此，nir光活化的光热剂被认为是抗感染治疗的候选药物。同时，除此之外，光动力疗法(pdt)被认为是对抗抗生素耐药性生物膜和细菌的有前途的替代方法。细菌可以被·oh，和¹o2，o^2-等活性氧(ros)杀死。一般来说，光敏剂(ps)仅在有光的情况下产生ros并表现出抗菌性能。因此，与其他抗菌剂相比，光动力学疗法是可控的。

目前，氧化钼材料作为一种新型的过渡金属氧化物由于其广泛的应用而引起了世界各地的广泛关注。由于氧化钼独特的晶体结构，因此，氧化钼具有许多优异的性能，并广泛用于光谱分析试剂。钼是哺乳动物和人类必需的微量元素，并且是各种酶(如黄嘌呤氧化酶，醛氧化酶和亚硫酸盐氧化酶)的辅助因子。饮食中的钼缺乏会导致食道癌的发生率增加。钼(vi)络合物是有效的抗糖尿病药。近来，纳米氧化钼的一些新功能已经被逐步探索，特别是在生物医学应用领域。作为多功能材料，氧化钼纳米材料在近红外(nir)区域具有很高的光热转换效率。然后用作可降解的光热剂和药物载体。除此之外，由于氧化钼纳米材料的价态和形式不同，三氧化钼纳米点(moo3-xnds)属于一种零维纳米点(0d-nds)，具有较小的尺寸和丰富的表面缺陷，使它们具有比其本体形式更多的催化活性位点。

氧化钼纳米点现有的制备方式一般以二硫化钼或者钼粉为钼前驱体，在双氧水或乙醇存在的情况下合成。合成过程有许多安全隐患且强氧化剂的除去会使制备过程变得复杂。相对于以上方法，溶剂热法制备过程极为简单而应用最为广泛，前期自上而下的溶剂热剥离技术一般需要对大块氧化钼原材料进行超声粉碎等前期处理步骤，步骤繁琐耗时，且材料转化率和产率都相对较低。因此，为了进一步研究氧化钼纳米材料的应用和发展，需要采用一种简单易行的、高效的氧化钼纳米结构的制备方法，如果可以通过一步法制备得到多种价态的氧化钼纳米材料，将会大大提高氧化钼纳米材料的制备和研究效率，但目前尚未见此类研究报道。因此，本发明寻求设计提供一种步骤简单、绿色无污染的一步法制备氧化钼纳米点的方法。

技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术存在的缺点，寻求提供一种三氧化钼纳米点抑菌材料的制备方法及其应用，通过自下而上的水热方法制备三氧化钼纳米点，制备的三氧化钼纳米点具有过氧化物酶性质以及在近红外照射下的光热和光动力学性质，在近红外光照射下，联合其类酶性质，光热与光动力学性质进行有效抑菌。

为了实现上述目的，本发明涉及的三氧化钼纳米点抑菌材料的制备方法，具体工艺步骤包括：

(1)配制质量浓度为0.005g/ml-0.006g/ml的三氯化钼水溶液，充分搅拌使其分散均匀，放入反应釜中；

(2)将反应釜放到鼓风干燥机中，在200℃下加热反应10小时；

(3)将反应完的样品取出，在12000rpm/min下离心9-11分钟，去除沉淀，收集上清液，再将上清液在12000rpm/min下离心9-11分钟，去除沉淀，再收集上清液，重复离心、去除沉淀和收集上清液步骤数次，至离心后溶液中无沉淀物出现，则获得无色分散的三氧化钼纳米点溶液，完成三氧化钼纳米点抑菌材料的制备。

本发明涉及的三氧化钼纳米点粒径均匀且小于10nm，平均粒径尺寸为3.07±0.45nm，且厚度在1.43±0.08nm，具有很好的分散性。

本发明涉及的三氧化钼纳米点含有氧空位，具有较多的表面氧缺陷，使其具有更多活性位点，能更好的利用纳米酶的性质抑制杀死伤口中的耐药菌体。

本发明涉及的三氧化钼纳米点在从可见光到近红外波长为300-1000nm之间有广泛吸收，具有出色的红外吸收性能。

本发明涉及的三氧化钼纳米点在近红外照射下能够很好的将光能转化成热能，且正好达到类酶(过氧化物酶)活性的最佳温度，使酶活状态达到最佳，并生成适量活性氧，抑制菌体的生长；光热转换效率达21.26％。

本发明还提供所述三氧化钼纳米点在光热成像材料的应用，具体为三氧化钼纳米点作为光热成像材料，用于光热成像仪拍照。

本发明还提供所述三氧化钼纳米点作为抑菌材料的应用，具体为三氧化钼纳米点作为抑菌材料对伤口进行处理的应用。

基于三氧化钼纳米点材料作为一种多功能材料，在近红外(nir)中既具有过氧化物酶活性，又具有很高的光热转换效率和很好的光动力学性质，并且在nir照射后的光热效应正好达到其类酶性质的最佳温度，使其类酶活性达到最佳状态，且nir作为一种无创的治疗方式，具有空间分辨率高、穿透深度深、对生物基质的光吸收和散射小等优点。因此，利用三氧化钼纳米点的近红外吸收及其类酶性质抑菌是具有非常重要的意义和应用前景的方法。

本发明与现有技术相比，本发明三氧化钼纳米点具有高催化活性，可长期储存，对恶劣环境的耐受性高，高稳定性和可调节催化活性等优点；通过水热法制备三氧化钼纳米点实现了采用三氯化钼粉末作为前躯体一步法制得氧化钼纳米材料，方法简便，且无污染，制备的三氧化钼纳米点含有氧空位，具有出色的红外吸收性能、光热转换性能和抑菌性能；该制备方法简单，制备设备易得，制备过程简单，同时抑菌效果良好且对人体无害，整个过程绿色无污染，应用环境友好，市场前景广阔。

附图说明：

图1为本发明涉及的三氧化钼纳米点的抑菌原理示意图。

图2为本发明实施例1制备的三氧化钼纳米点的透射电镜图和尺寸分布图，其中图2a为透射电镜图和高分辨透射电镜图，图2b为尺寸分布图，图2c为原子力透射显微镜图。

图3为本发明的三氧化钼纳米点的氧空位(a)，近红外吸收性质(b)以及过氧化物酶的性质(c)检测示意图。

图4为本发明涉及的经三氧化钼纳米点溶液体外抑菌实验的培养基图。

图5为本发明涉及的实施例5三氧化钼纳米点的体内抑菌实验结果照片图。

图6为本发明涉及的经实施例3三氧化钼纳米点在光热成像方面的应用实验结果对比图。

图7为本发明涉及的实施例4经三氧化钼纳米点处理的小鼠伤口切片对比图。

图8为本发明涉及的实施例4三氧化钼纳米点的细胞毒性测试结果图。

具体实施方式：

下面通过具体实施例并结合附图对本发明进行详细说明。

实施例1：

本实施例涉及的三氧化钼纳米点抑菌材料的制备方法，具体工艺步骤包括：

(1)用电子天平准确称取0.2克的三氯化钼粉末放入50毫升反应釜中，加入35毫升超纯水，充分搅拌使其分散均匀；

(2)将反应釜放到鼓风干燥机中，在200℃下加热反应10小时；

(3)将反应完的样品取出，在12000rpm/min下离心10min，去除沉淀，收集上清液，再将上清液在12000rpm/min下离心10min，去除沉淀，再收集上清液，重复离心、去除沉淀和收集上清液步骤数次，至离心后溶液中无沉淀物出现，则获得三氧化钼纳米点的无色分散液，完成三氧化钼纳米点抑菌材料的制备。

本实施例制备的三氧化钼纳米点粒径均匀且小于10nm，平均粒径尺寸为3.07±0.45nm，且厚度在1.43±0.08nm，具有很好的分散性。

然后将制备的三氧化钼纳米点进行电子顺磁共振(epr)以进一步验证氧空位，因为它提供了有关表面缺陷以及被测样品中被捕获的电子的证据。如图3a所示，三氧化钼纳米点样品在g＝2.001时显示epr信号，这是由于氧空位捕获的电子,说明三氧化钼纳米点具有较好的氧空位。同时，该纳米点在近红外光照射下具有很好的近红外吸收性能，且照射时达到的温度正是该纳米酶(过氧化物酶)的最佳温度，且氧空位越多酶活性就越好，能让过氧化物酶发挥最好的活性(图3c)。

实施例2：

本实施例涉及三氧化钼纳米点在体外抑菌方面的应用实验，将实施例1制备的三氧化钼纳米点溶液应用到体外抗菌实验，将固体lb培养基上的单菌落非抗药性和抗药性细菌接种到50ml无菌液体lb培养基含有胰蛋白胨(0.5g)、酵母提取物(0.25g)和nacl(0.5g)，然后将抗药性细菌的悬浮液置于旋转振荡器上以180rpm/min在37℃下培养过夜。随后用无菌pbs将细菌稀释至10⁶cfu/ml，将获得的细菌溶液(100微升)与300微升质量浓度为90μg·ml^-1的三氧化钼纳米点溶液，50微升摩尔浓度为100微摩尔每升的h2o2和550微升的pbs缓冲液在37℃下温育30分钟，之后吸取50微升的溶液均匀的涂布在固体培养基上，在将固体培养基放在37℃的保温箱中培养12小时，用cfu法计数细菌菌落数，使用pbs作为空白对照，细菌单独与h2o2或三氧化钼纳米点进行平行对照实验。测量结果如图4所示，在红外光照射下同时加入h2o2和三氧化钼纳米点时，平板中只有很少的细菌菌落，对耐药性大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抗菌率分别是98.4％和98％，表明三氧化钼纳米点在近红外光和h2o2存在条件下，具有极强的抗菌性能。

实施例3：

本实施例为三氧化钼纳米点在光热成像方面的应用实验，将实施例1制备的三氧化钼纳米点应用于有效的光热成像，将300微升质量浓度为90μg·ml^-1的三氧化钼纳米点溶液注射到小鼠伤口部位，实验结果如图6所示，未加近红外照射时，小鼠成像温度为35℃；在波长为808nm下2w/cm²的近红外光照射20分钟后，小鼠成像温度为55℃，表明三氧化钼纳米点能够有效的将光能转变成热能，再用光热成像仪就能够清晰准确的拍摄到小鼠伤口部位。

本实施例说明三氧化钼纳米点具有较好的光热转化效率，经光热转化率公式计算，得到光热转化效率为21.26％。

实施例4：

本实施例为三氧化钼纳米点在生物毒性测试方面的应用实验，实验用细胞为小鼠l929细胞，将细胞分别用由不同浓度(0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)的100微升三氧化钼纳米点溶液分别和150微升dmem溶液混合的7种混合液进行孵育24小时，然后分别加入10ml含有5mg/ml的mtt溶液，然后继续在通5％co2和37℃条件下孵育4小时，最后用100μl二甲基亚砜使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪490nm处测量各孔的吸光值，测量结果如图8所示，未经过三氧化钼纳米点溶液孵育的细胞活性设定为100％，结果显示分别经不同浓度(0μg/ml，2.5μg/ml，5μg/ml，10μg/ml，25μg/ml，50μg/ml，100μg/ml)的三氧化钼纳米点溶液孵育后，细胞活性均能保持99％以上。

此外，分别用pbs和质量浓度为100μg/ml和200μg/ml的三氧化钼纳米点处理小鼠的主要器官(肝脏，心脏，肺，脾脏和肾脏)，结果如图7所示，肝脏，心脏，肺，脾脏和肾脏均没有明显的损伤或组织异常，证明了所制备的三氧化钼纳米点具有良好的生物相容性和低细胞毒性。

实施例5：

本实施例为三氧化钼纳米点在体内抑菌方面的应用，将实施例1制备的三氧化钼纳米点溶液应用到体内抗菌实验方面，通过使用雄性和雌性混合小鼠(六周，180-200g，共32只sd小鼠)建立了小鼠伤口感染模型。在所有小鼠的背部上制造了直径约1cm的圆形皮肤损伤，小鼠被mrsa(耐甲氧西林金黄色葡萄球菌)感染后，将其分成8组，每组4只。每组接受不同的治疗药物，分别为pbs、h2o2、三氧化钼纳米点、h2o2+三氧化钼纳米点、pbs+nir、h2o2+nir、三氧化钼纳米点+nir、h2o2+三氧化钼纳米点+nir。每隔一天收集伤口的照片，并将整个治疗过程定为6天。由图5可知，h2o2+三氧化钼纳米点+nir组处理的伤口最小，表明三氧化钼纳米点对多种耐药性细菌都具有明显的抗菌性能，使小鼠伤口快速愈合。

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