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您当前的位置： 一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊及其制备方法与流程
2021-01-06 19:01:25|
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起点商标网 本发明属于保健品
技术领域：
，具体涉及一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊及其制备方法。
背景技术：
：随着生活水平的提高，人们对保健意识越来越强，使得保健品市场越来越繁荣。灵芝是我国传统名贵滋补品，也是药食同源的真菌，其保健功能得到人们的肯定，经过十多年的发展，我国已形成一个繁荣的灵芝类保健品新产业。灵芝又称林中灵，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝久负盛名，具有滋补强体、固本扶正、养颜安神的功效，不同于一般营养保健食品只对某一方面营养素的不足进行补充和强化，而是在整体上双向调节人体机能平衡，调动机体内部活力，调节人体新陈代谢机能，提高免疫力。灵芝孢子粉是灵芝成熟是所释放的孢子，是灵芝有性生殖细胞，又称担孢子。灵芝孢子粉在保健品中应用很广泛，其水提物也和灵芝子实体一样含有多糖、蛋白质、多肽，但其成分结构和含量有所区别，灵芝子实体和孢子粉成分进行分析对比，结果表明，孢子粉的蛋白含量约是子实体的两倍，脂肪含量孢子粉是子实体的五倍，但多糖含量子实体更高。灵芝孢子壁具有双层细胞壁，结实坚硬，不破壁的孢子粉只有10％～20％有效成分被人体吸收。研究发现，灵芝孢子粉具有提高机体免疫力、清除自由基抗衰老的作用。目前市面上基本上是灵芝子实体或是灵芝孢子粉分别加工，形成保健产品，很少有子实体与孢子粉混合加工形成产品。实际上灵芝子实体和孢子粉含有的活性成分是有区别的，混合两个成分能够增加产品的保健功效。鉴于以上原因，特提出本发明。技术实现要素：为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊及其制备方法，本发明的胶囊通过灵芝子实体和孢子粉混合进行发酵制备而成，有利于肠道益生菌生长，调节肠道菌群，具有增强免疫力、改善肥胖的潜力，本发明的胶囊活性物质含量高，保健功效显著。本发明的第一目的，提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊，按照重量份，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液70-90份、菊粉3-8份、低聚果糖3-8份和麦芽糊精7-13份。进一步的，按照重量份，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液80份、菊粉5份、低聚果糖5份和麦芽糊精10份。菊粉是植物中储备性多糖，主要来源于植物。菊粉分子约由31个β-d-呋喃果糖和1～2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2，1-键连接。是由d-果糖经β(1→2)糖苷键链接而成的线性直链多糖。摄入菊粉可有效降低血清总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)，提高高密度脂蛋白/低密度脂蛋白比率，改善血脂状况，还能够降低血糖和促进矿物质的吸收。菊粉还是一种天然的水溶性膳食纤维，几乎不能被胃酸水解和消化，只有在结肠被有益微生物利用，从而改善肠道环境，增强胃肠道蠕动，防止便秘。低聚果糖又称寡果糖或蔗糖三糖族低聚糖。包括蔗糖分子以β-(1→2)糖苷键与1-3个果糖分子结合成的蔗果三糖，蔗果四糖和蔗果五糖，属于果糖和葡萄糖构成的直链杂低聚糖。低聚果糖通过选择性促进乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等有益菌在消化道中的定植，抑制有害细菌生长，改善肠道菌群，间接达到对动物体的营养及促生长效应。促进b族维生素及叶酸的形成，能维护神经系统的正常功能，促进消化及新陈代谢，减少肝脏毒素，增强人体免疫力。麦芽糊精也称水溶性糊精或酶法糊精。它是以各类淀粉作原料，经酶法工艺低程度控制水解转化，提纯，干燥而成。在胶囊中主要作为粘合剂和填充剂。本发明的胶囊采取复配的方法，添加了菊粉、低聚果糖和灵芝子实体孢子粉发酵液。可以更加全面地调节肠道菌群和机体免疫力。进一步的，所述的灵芝子实体孢子粉发酵液通过如下方法制备而成，具体包括如下步骤：(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过80-120目筛处理，加入孢子粉，再加入蒸馏水制备成质量分数为7-13％的溶液，灭菌处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中，在30-37℃下培养44-52h，得到活化菌株；(3)混合发酵：将所述的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，将所述的混合种子液加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；(4)发酵后处理：将所述的初始灵芝子实体孢子粉发酵液灭菌处理，菌体破碎，过滤，得到所述的灵芝子实体孢子粉发酵液。进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为(10-1)：(1-10)。进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1。本发明人经过大量的试验发现，灵芝子实体和孢子粉采用上述的质量比发酵得到的发酵液中各活性成分的含量较高，制备的胶囊的保健效果较好。进一步的，步骤(2)中所述的菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252中的一种或多种。本发明中所述的青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。进一步的，所述的菌种为菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的混合菌种。进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)。进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为2:1:2:1。本发明人经过大量的试验发现，当菌种采用上述四种菌种混合时发酵时可以使孢子粉坚韧的双层细胞壁、子实体细胞壁打开，细胞膜破裂，胞内成分流出，活性物质利用率提高，可以提高制备的胶囊的保健功效。同时采用上述比例范围下的四种菌种发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率高。本发明中各菌种的活化方法均采用现有方法进行，具体如下所示：青春双歧杆菌活化培养基：mrs培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；青春双歧杆菌活化方法：在mrs固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂15～20g/l，蒸馏水，ph值7.5±0.2；纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。保加利亚乳杆菌活化培养基：mrs固体培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；保加利亚乳杆菌活化方法：在mrs培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(nyda固体培养基)，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。酿酒酵母菌活化方法：在nyda培养基上划线，30℃正常培养48h。进一步的，步骤(3)中混合种子液以1.5-2.5％的质量分数加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中。进一步的，步骤(3)中发酵温度为35-45℃，在转速为100-150rpm的摇床上进行发酵44-52h。本发明中活化菌株进行扩大培养具体如下：各培养基都是液体培养基：酿酒酵母菌cicc1252扩大培养培养基：nydb液体培养基，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到酿酒酵母种子液。纳豆芽孢杆菌cicc10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。青春双歧杆菌cicc6175培养基：mrs液体培养基，包括牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，ph值6.2±0.2。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到青春双歧杆菌种子液；保加利亚乳杆菌cicc20271(耐氧训练)：固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液；或液体培养基活化后，接种5％到装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^9cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。进一步的，步骤(1)和(4)中灭菌处理为在121℃下灭菌15min或在600mpa，25℃下进行超高压灭菌。进一步的，步骤(4)中菌体破碎采用高压匀浆机或超声破碎，过滤采用离心、超滤膜、微滤膜或反渗透过滤。本发明人经过大量的试验发现，菌体破碎后部分灵芝细胞内物质溶出，让有益成分流出。使用highpressurehomogenizer高压匀浆机，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃。本发明的第二目的，提供了一种所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊的制备方法，包括如下步骤：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为(83-119)kg:(5-15)l，溶解温度为45-55℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至75-85℃，保温搅拌灭菌处理25-35min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明的胶囊通过灵芝子实体和孢子粉发酵制备而成，能够调节肠道菌群，具有增强免疫力，改善肥胖的作用，灵芝子实体和孢子粉混合发酵，得到的多肽含量增加，具有调节肠道微生态的作用，菊粉、低聚果糖复配灵芝子实体孢子粉发酵液后能够统筹各个原料优点，放大对肠道菌群以及健康的正相作用，同时可以减少副作用，本发明制备的胶囊通过调节肠道菌群，可以改变皮肤的含水量及皮肤的弹性；(2)本发明通过对灵芝子实体和孢子粉进行混合发酵，发酵菌水解灵芝孢子双层细胞壁、灵芝子实体细胞壁，使胞内物质流出，从而促进有效成分的提取率，同时发酵可以降低大分子得到分子量更小即更易被皮肤吸收的小分子，促进功效物质吸收利用；(3)本发明的胶囊制备方法简单，制成的胶囊可以防潮、避光、隔离空气、稳定性好，而且与片剂、丸剂相比，释药更迅速，药物生物利用度高，与颗粒剂相比，可以减少辅料的用量，节约成本，服用，携带更加方便。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明中菌种活化和扩大培养均采用如下方法：具体的菌种活化如下：青春双歧杆菌活化培养基：mrs培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；青春双歧杆菌活化方法：在mrs固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂15～20g/l，蒸馏水，ph值7.5±0.2；纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。保加利亚乳杆菌活化培养基：mrs固体培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；保加利亚乳杆菌活化方法：在mrs培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(nyda固体培养基)，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。酿酒酵母菌活化方法：在nyda培养基上划线，30℃正常培养48h。活化菌株扩大培养具体如下：各培养基都是液体培养基：酿酒酵母菌cicc1252扩大培养培养基：nydb液体培养基，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到酿酒酵母种子液。纳豆芽孢杆菌cicc10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。青春双歧杆菌cicc6175培养基：mrs液体培养基，包括牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，ph值6.2±0.2。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到青春双歧杆菌种子液；保加利亚乳杆菌cicc20271(耐氧训练)：固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。制备例为灵芝子实体孢子粉发酵液的制备制备例1本制备例的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法，包括如下步骤：(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1，再加入蒸馏水制备成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中进行培养，所述的菌种为菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的混合菌种，得到活化菌株；(3)混合发酵：将所述的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比2:1:2:1，将所述的混合种子液以2％的质量分数加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，发酵温度为40℃，在转速为125rpm的摇床上进行发酵48h，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；(4)发酵后处理：将所述的初始灵芝子实体孢子粉发酵液在121℃下灭菌15min处理，采用高压匀浆机进行菌体破碎，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃，离心过滤，得到所述的灵芝子实体孢子粉发酵液。以下制备例中改变某一项或几项实验参数，其他操作均与制备例1相同，具体的参数设定参见表1，制备例中的青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。对比例1本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法为：将灵芝子实体粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1：1，加水配制成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，然后在40℃下保温48h，再在121℃下灭菌15min，离心分离取上清液，即得到清水提取液。对比例2本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的灵芝子实体进行发酵。对比例3本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的孢子粉进行发酵。对比例4本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，步骤(4)中菌体不进行破碎处理。表1灵芝子实体孢子粉发酵液成分的测定分别测定制备例1-14以及对比例1-4制备的灵芝子实体孢子粉发酵液，多糖测试方法参照snt4260；采用bca法测定蛋白多肽的含量；采用folin-ciocalteu法测定多酚含量；采用al(no3)3-nano2-naoh法测定总黄酮含量，结果见表2。表2组别多糖(mg/ml)多肽(mg/ml)多酚(mg/ml)总黄酮(mg/ml)制备例13.174.240.0570.033制备例23.124.180.0530.031制备例33.084.150.0510.029制备例42.843.860.0370.018制备例52.763.790.0320.015制备例63.014.020.0450.026制备例72.984.060.0470.025制备例82.913.970.0410.023制备例93.114.190.0520.030制备例103.084.110.0510.028制备例112.853.790.0320.017制备例122.893.820.0340.020制备例133.154.190.0550.032制备例143.144.210.0530.030对比例11.042.030.0330.019对比例23.253.880.0520.021对比例31.933.290.0410.014对比例42.813.750.0380.021从表1和表2中制备例1-5中可以看出，采用本发明的混合种子液青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)下制备的灵芝子实体孢子粉发酵液的多糖、多肽、多酚及总黄酮成分含量相对较高，当比例为2:1:2:1时即制备例1的方案时各成分的含量最高，说明采用本发明的四种菌种在上述比例范围内进行发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率最高。从制备例1-3和制备例6-8中的数据可以看出，采用四种菌种发酵比采用少于四种菌种发酵灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。从制备例1和制备例9-12的数据可以看出，采用本发明的孢子粉和子实体的质量比1：1下发酵得到的灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。从对比例1-4的数据中可以看出，采用水提制备灵芝子实体和孢子粉水提液、单独采用孢子粉或灵芝子实体发酵得到的发酵液中的有益成分较低，对于步骤(4)得到的菌体进行破碎处理，可以明显提高发酵液中的有益成分含量。抑菌试验(1)将金黄色葡萄球菌atcc6538接种于营养肉汤培养基，短双歧杆菌atcc15700和唾液乳杆菌atcc11741培养于tpy培养基，大肠杆菌atcc25312培养于lb培养基。(2)每种培养液各取10ml，各2份，分别加入0.1ml制备例1的灵芝发酵液和0.1ml去离子水作为空白对照。(3)将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌置于37℃下进行24h需氧培养，将短双歧杆菌和唾液乳杆菌置于37℃下进行48h厌氧培养。(4)用稀释平板法测定培养前后培养液中各种菌的数目，测试结果如表3所示。表3表3数据可以看出，加入灵芝发酵液培养一段时间后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌这类有害菌数量比不加入灵芝发酵液的空白组低，但短双歧杆菌、唾液乳杆菌这类有益菌比不加入灵芝发酵液的空白组增加了。说明本发明的玫瑰发酵液可以作用于肠道微生物，特别是能够选择性抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，同时促进短双歧杆菌、唾液乳杆菌这类有益菌的生长，从而调节肠道菌群，使其达到健康平衡的状态。将其用于胶囊中，能够调节肠道微生态，达到促进人体健康的效果。本发明人也对制备例2-3、制备例6-10、制备例13-14进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。以下实施例中菊粉购自西安浩天生物工程有限公司，低聚果糖购自广州鸿易食品添加剂有限公司，麦芽糊精购自西安大丰收生物科技有限公司。实施例1利用制备例1制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液70kg、菊粉8kg、低聚果糖3kg和麦芽糊精13kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为83kg:15l，溶解温度为45℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至75℃，保温搅拌灭菌处理25min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。实施例2利用制备例13制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液80kg、菊粉5kg、低聚果糖5kg和麦芽糊精10kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为101kg:10l溶解温度为50℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至80℃，保温搅拌灭菌处理30min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。实施例3利用制备例14制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液90kg、菊粉3kg、低聚果糖8kg和麦芽糊精7kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为119kg:5l，溶解温度为55℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至85℃，保温搅拌灭菌处理35min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。对比例5本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为制备例11的灵芝子实体孢子粉发酵液。对比例6本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为对比例12的灵芝子实体孢子粉发酵液。对比例7本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为对比例1提取的灵芝子实体孢子粉水提液制备胶囊。对比例8本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，不添加灵芝子实体孢子粉发酵液。试验例1将实施例1-3和对比例5-8制备的胶囊进行皮肤含水量测试及皮肤弹性测试，结果如表4和5所示。皮肤含水量测试选取实验室里6名志愿者，年龄范围22～40岁，其中5名志愿者分别服用了实施例1-3和对比例5-8制备的胶囊，服用量为每天1颗。第6名志愿者不服用胶囊作为空白组。测试期间只能使用基础类护肤品，不能使用任何功效类护肤品，同时注意防晒。选取脸颊两侧作为测试部位，在实验第0，14，30天采用皮肤水分测试仪水分测试探头corneometercm825测试其头皮角质层含水量，测试三次取平均值，结果如表4所示；在实验第0，14，30天使用皮肤弹性测试探头cutometermpa580测试皮肤弹性变化；测试三次取平均值，结果如表5所示。表4表5时间实施例1实施例2实施例3对比例5对比例6对比例7对比例8空白0d0.73540.67430.69830.68730.69210.78260.76290.769214d0.74240.69520.70820.68770.70210.78910.76380.769628d0.77680.70940.74290.70920.71180.79020.76490.7698皮肤弹性值越大，说明皮肤弹性越好，皮肤弹性与皮肤胶原蛋白以及弹性蛋白的流失息息相关，胶原蛋白和弹性蛋白的流失与皮肤松弛等衰老有关。皮肤弹性值变化越大说明产品效果越好。从表4和5可以看出与使用前以及空白组相比，本发明实施例1～3制备的胶囊服用28天后，在角质层含水量以及皮肤弹性方面均有一定变化。具体地，服用实施例1～3的胶囊的皮肤弹性值总体趋势是增大的，能够在一定程度上反映产品延缓衰老的效果。同时角质层含水量越高，说明产品提高皮肤保湿能力越好。将实施例2与对比例5-8比较可以发现，在其他原料不变的情况下添加了灵芝发酵液能对受试者的皮肤水润度和皮肤弹性带来正向影响，添加灵芝子实体比孢子粉比例在(10-1):(1-10)之间的灵芝发酵液效果更明显；如果把灵芝发酵液换成灵芝水提取液，其水润度和皮肤弹性变化都没有灵芝发酵液那么明显。说明灵芝发酵液能够对皮肤的水润与皮肤弹性有很好的作用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页1 2 3
技术领域：
，具体涉及一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊及其制备方法。
背景技术：
：随着生活水平的提高，人们对保健意识越来越强，使得保健品市场越来越繁荣。灵芝是我国传统名贵滋补品，也是药食同源的真菌，其保健功能得到人们的肯定，经过十多年的发展，我国已形成一个繁荣的灵芝类保健品新产业。灵芝又称林中灵，外形呈伞状，菌盖肾形、半圆形或近圆形，为多孔菌科真菌灵芝的子实体。灵芝久负盛名，具有滋补强体、固本扶正、养颜安神的功效，不同于一般营养保健食品只对某一方面营养素的不足进行补充和强化，而是在整体上双向调节人体机能平衡，调动机体内部活力，调节人体新陈代谢机能，提高免疫力。灵芝孢子粉是灵芝成熟是所释放的孢子，是灵芝有性生殖细胞，又称担孢子。灵芝孢子粉在保健品中应用很广泛，其水提物也和灵芝子实体一样含有多糖、蛋白质、多肽，但其成分结构和含量有所区别，灵芝子实体和孢子粉成分进行分析对比，结果表明，孢子粉的蛋白含量约是子实体的两倍，脂肪含量孢子粉是子实体的五倍，但多糖含量子实体更高。灵芝孢子壁具有双层细胞壁，结实坚硬，不破壁的孢子粉只有10％～20％有效成分被人体吸收。研究发现，灵芝孢子粉具有提高机体免疫力、清除自由基抗衰老的作用。目前市面上基本上是灵芝子实体或是灵芝孢子粉分别加工，形成保健产品，很少有子实体与孢子粉混合加工形成产品。实际上灵芝子实体和孢子粉含有的活性成分是有区别的，混合两个成分能够增加产品的保健功效。鉴于以上原因，特提出本发明。技术实现要素：为了解决现有技术存在的以上问题，本发明提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊及其制备方法，本发明的胶囊通过灵芝子实体和孢子粉混合进行发酵制备而成，有利于肠道益生菌生长，调节肠道菌群，具有增强免疫力、改善肥胖的潜力，本发明的胶囊活性物质含量高，保健功效显著。本发明的第一目的，提供了一种含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊，按照重量份，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液70-90份、菊粉3-8份、低聚果糖3-8份和麦芽糊精7-13份。进一步的，按照重量份，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液80份、菊粉5份、低聚果糖5份和麦芽糊精10份。菊粉是植物中储备性多糖，主要来源于植物。菊粉分子约由31个β-d-呋喃果糖和1～2个吡喃菊糖残基聚合而成，果糖残基之间能通过β-2，1-键连接。是由d-果糖经β(1→2)糖苷键链接而成的线性直链多糖。摄入菊粉可有效降低血清总胆固醇(tc)和低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)，提高高密度脂蛋白/低密度脂蛋白比率，改善血脂状况，还能够降低血糖和促进矿物质的吸收。菊粉还是一种天然的水溶性膳食纤维，几乎不能被胃酸水解和消化，只有在结肠被有益微生物利用，从而改善肠道环境，增强胃肠道蠕动，防止便秘。低聚果糖又称寡果糖或蔗糖三糖族低聚糖。包括蔗糖分子以β-(1→2)糖苷键与1-3个果糖分子结合成的蔗果三糖，蔗果四糖和蔗果五糖，属于果糖和葡萄糖构成的直链杂低聚糖。低聚果糖通过选择性促进乳酸杆菌、双歧杆菌和链球菌等有益菌在消化道中的定植，抑制有害细菌生长，改善肠道菌群，间接达到对动物体的营养及促生长效应。促进b族维生素及叶酸的形成，能维护神经系统的正常功能，促进消化及新陈代谢，减少肝脏毒素，增强人体免疫力。麦芽糊精也称水溶性糊精或酶法糊精。它是以各类淀粉作原料，经酶法工艺低程度控制水解转化，提纯，干燥而成。在胶囊中主要作为粘合剂和填充剂。本发明的胶囊采取复配的方法，添加了菊粉、低聚果糖和灵芝子实体孢子粉发酵液。可以更加全面地调节肠道菌群和机体免疫力。进一步的，所述的灵芝子实体孢子粉发酵液通过如下方法制备而成，具体包括如下步骤：(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过80-120目筛处理，加入孢子粉，再加入蒸馏水制备成质量分数为7-13％的溶液，灭菌处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中，在30-37℃下培养44-52h，得到活化菌株；(3)混合发酵：将所述的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，将所述的混合种子液加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；(4)发酵后处理：将所述的初始灵芝子实体孢子粉发酵液灭菌处理，菌体破碎，过滤，得到所述的灵芝子实体孢子粉发酵液。进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为(10-1)：(1-10)。进一步的，步骤(1)中灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1。本发明人经过大量的试验发现，灵芝子实体和孢子粉采用上述的质量比发酵得到的发酵液中各活性成分的含量较高，制备的胶囊的保健效果较好。进一步的，步骤(2)中所述的菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252中的一种或多种。本发明中所述的青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。进一步的，所述的菌种为菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的混合菌种。进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)。进一步的，步骤(3)中混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为2:1:2:1。本发明人经过大量的试验发现，当菌种采用上述四种菌种混合时发酵时可以使孢子粉坚韧的双层细胞壁、子实体细胞壁打开，细胞膜破裂，胞内成分流出，活性物质利用率提高，可以提高制备的胶囊的保健功效。同时采用上述比例范围下的四种菌种发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率高。本发明中各菌种的活化方法均采用现有方法进行，具体如下所示：青春双歧杆菌活化培养基：mrs培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；青春双歧杆菌活化方法：在mrs固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂15～20g/l，蒸馏水，ph值7.5±0.2；纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。保加利亚乳杆菌活化培养基：mrs固体培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；保加利亚乳杆菌活化方法：在mrs培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(nyda固体培养基)，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。酿酒酵母菌活化方法：在nyda培养基上划线，30℃正常培养48h。进一步的，步骤(3)中混合种子液以1.5-2.5％的质量分数加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中。进一步的，步骤(3)中发酵温度为35-45℃，在转速为100-150rpm的摇床上进行发酵44-52h。本发明中活化菌株进行扩大培养具体如下：各培养基都是液体培养基：酿酒酵母菌cicc1252扩大培养培养基：nydb液体培养基，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到酿酒酵母种子液。纳豆芽孢杆菌cicc10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。青春双歧杆菌cicc6175培养基：mrs液体培养基，包括牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，ph值6.2±0.2。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到青春双歧杆菌种子液；保加利亚乳杆菌cicc20271(耐氧训练)：固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液；或液体培养基活化后，接种5％到装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^9cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。进一步的，步骤(1)和(4)中灭菌处理为在121℃下灭菌15min或在600mpa，25℃下进行超高压灭菌。进一步的，步骤(4)中菌体破碎采用高压匀浆机或超声破碎，过滤采用离心、超滤膜、微滤膜或反渗透过滤。本发明人经过大量的试验发现，菌体破碎后部分灵芝细胞内物质溶出，让有益成分流出。使用highpressurehomogenizer高压匀浆机，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃。本发明的第二目的，提供了一种所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊的制备方法，包括如下步骤：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为(83-119)kg:(5-15)l，溶解温度为45-55℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至75-85℃，保温搅拌灭菌处理25-35min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。与现有技术相比，本发明的有益效果为：(1)本发明的胶囊通过灵芝子实体和孢子粉发酵制备而成，能够调节肠道菌群，具有增强免疫力，改善肥胖的作用，灵芝子实体和孢子粉混合发酵，得到的多肽含量增加，具有调节肠道微生态的作用，菊粉、低聚果糖复配灵芝子实体孢子粉发酵液后能够统筹各个原料优点，放大对肠道菌群以及健康的正相作用，同时可以减少副作用，本发明制备的胶囊通过调节肠道菌群，可以改变皮肤的含水量及皮肤的弹性；(2)本发明通过对灵芝子实体和孢子粉进行混合发酵，发酵菌水解灵芝孢子双层细胞壁、灵芝子实体细胞壁，使胞内物质流出，从而促进有效成分的提取率，同时发酵可以降低大分子得到分子量更小即更易被皮肤吸收的小分子，促进功效物质吸收利用；(3)本发明的胶囊制备方法简单，制成的胶囊可以防潮、避光、隔离空气、稳定性好，而且与片剂、丸剂相比，释药更迅速，药物生物利用度高，与颗粒剂相比，可以减少辅料的用量，节约成本，服用，携带更加方便。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。本发明中菌种活化和扩大培养均采用如下方法：具体的菌种活化如下：青春双歧杆菌活化培养基：mrs培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；青春双歧杆菌活化方法：在mrs固体培养基中划线，37℃厌氧培养48h，无氧条件下传3代。纳豆芽孢杆菌活化培养基：牛肉膏蛋白胨培养基，牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，琼脂15～20g/l，蒸馏水，ph值7.5±0.2；纳豆芽孢杆菌活化方法：在牛肉膏蛋白胨培养基上划线，35℃正常培养48h。保加利亚乳杆菌活化培养基：mrs固体培养基，牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，琼脂20g/l，蒸馏水，ph值6.2±0.2；保加利亚乳杆菌活化方法：在mrs培养基中划线，37℃恒温无氧培养48h。酿酒酵母菌活化培养基：营养酵母葡萄糖液体培养基(nyda固体培养基)，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。酿酒酵母菌活化方法：在nyda培养基上划线，30℃正常培养48h。活化菌株扩大培养具体如下：各培养基都是液体培养基：酿酒酵母菌cicc1252扩大培养培养基：nydb液体培养基，牛肉浸膏g/l，酵母浸粉5g/l，葡萄糖10g/l，琼脂20g/l，正常ph。活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，30℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到酿酒酵母种子液。纳豆芽孢杆菌cicc10262扩大培养培养基：牛肉膏3g/l，蛋白胨10g/l，nacl5g/l，ph7。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，轻微摆动接种针，使菌体分散于液体培养基内，35℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到纳豆芽孢杆菌种子液。青春双歧杆菌cicc6175培养基：mrs液体培养基，包括牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，葡萄糖20g/l，酵母粉4g/l，乙酸钠5g/l，硫酸镁0.2g/l，柠檬酸三铵2g/l，磷酸氢二钾2g/l，硫酸锰0.05g/l，吐温-801g/l，ph值6.2±0.2。固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到青春双歧杆菌种子液；保加利亚乳杆菌cicc20271(耐氧训练)：固体培养基活化后，用接种针或接种环从固体培养基菌落中挑取菌落，放入装有液体培养基的三角瓶中，静置培养24h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为5％，37℃，20rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为10％，37℃，60rpm培养12h；吸取上步骤菌液再接种到装有液体培养基的三角瓶中，接种量为15％，37℃，120rpm培养，直到菌种数量达到1*10^8cfu/ml时结束，得到保加利亚乳杆菌种子液。制备例为灵芝子实体孢子粉发酵液的制备制备例1本制备例的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法，包括如下步骤：(1)灵芝发酵基质制备：将灵芝子实体干燥，粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1:1，再加入蒸馏水制备成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，得到灭菌后的灵芝发酵基质；(2)菌种活化：采用平板划线法将菌种分别接种到培养基中进行培养，所述的菌种为菌种选自青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的混合菌种，得到活化菌株；(3)混合发酵：将所述的活化菌株进行扩大培养后进行混合，得到混合种子液，混合种子液中青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比2:1:2:1，将所述的混合种子液以2％的质量分数加入到所述的灭菌后的灵芝发酵基质中，进行发酵，发酵温度为40℃，在转速为125rpm的摇床上进行发酵48h，得到初始灵芝子实体孢子粉发酵液；(4)发酵后处理：将所述的初始灵芝子实体孢子粉发酵液在121℃下灭菌15min处理，采用高压匀浆机进行菌体破碎，压力设定为100mpa，匀浆3次，出口温度为25℃，离心过滤，得到所述的灵芝子实体孢子粉发酵液。以下制备例中改变某一项或几项实验参数，其他操作均与制备例1相同，具体的参数设定参见表1，制备例中的青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271、酿酒酵母菌cicc1252均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。对比例1本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法为：将灵芝子实体粉碎过100目筛处理，加入孢子粉，灵芝子实体与孢子粉的质量比为1：1，加水配制成质量分数为10％的溶液，在121℃下灭菌15min处理，然后在40℃下保温48h，再在121℃下灭菌15min，离心分离取上清液，即得到清水提取液。对比例2本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的灵芝子实体进行发酵。对比例3本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，将孢子粉和灵芝子实体替换为相同重量的孢子粉进行发酵。对比例4本对比例中的灵芝子实体孢子粉发酵液的制备方法与制备例1相同，不同之处在于，步骤(4)中菌体不进行破碎处理。表1灵芝子实体孢子粉发酵液成分的测定分别测定制备例1-14以及对比例1-4制备的灵芝子实体孢子粉发酵液，多糖测试方法参照snt4260；采用bca法测定蛋白多肽的含量；采用folin-ciocalteu法测定多酚含量；采用al(no3)3-nano2-naoh法测定总黄酮含量，结果见表2。表2组别多糖(mg/ml)多肽(mg/ml)多酚(mg/ml)总黄酮(mg/ml)制备例13.174.240.0570.033制备例23.124.180.0530.031制备例33.084.150.0510.029制备例42.843.860.0370.018制备例52.763.790.0320.015制备例63.014.020.0450.026制备例72.984.060.0470.025制备例82.913.970.0410.023制备例93.114.190.0520.030制备例103.084.110.0510.028制备例112.853.790.0320.017制备例122.893.820.0340.020制备例133.154.190.0550.032制备例143.144.210.0530.030对比例11.042.030.0330.019对比例23.253.880.0520.021对比例31.933.290.0410.014对比例42.813.750.0380.021从表1和表2中制备例1-5中可以看出，采用本发明的混合种子液青春双歧杆菌cicc6175、纳豆芽孢杆菌cicc10262、保加利亚乳杆菌cicc20271和酿酒酵母菌cicc1252的质量比为(1.5-2.5):1:(1.5:-2.5)：(0.8-1.2)下制备的灵芝子实体孢子粉发酵液的多糖、多肽、多酚及总黄酮成分含量相对较高，当比例为2:1:2:1时即制备例1的方案时各成分的含量最高，说明采用本发明的四种菌种在上述比例范围内进行发酵，灵芝子实体和孢子粉中的有益成分提取率最高。从制备例1-3和制备例6-8中的数据可以看出，采用四种菌种发酵比采用少于四种菌种发酵灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。从制备例1和制备例9-12的数据可以看出，采用本发明的孢子粉和子实体的质量比1：1下发酵得到的灵芝子实体和孢子粉中发酵液中的有益成分高。从对比例1-4的数据中可以看出，采用水提制备灵芝子实体和孢子粉水提液、单独采用孢子粉或灵芝子实体发酵得到的发酵液中的有益成分较低，对于步骤(4)得到的菌体进行破碎处理，可以明显提高发酵液中的有益成分含量。抑菌试验(1)将金黄色葡萄球菌atcc6538接种于营养肉汤培养基，短双歧杆菌atcc15700和唾液乳杆菌atcc11741培养于tpy培养基，大肠杆菌atcc25312培养于lb培养基。(2)每种培养液各取10ml，各2份，分别加入0.1ml制备例1的灵芝发酵液和0.1ml去离子水作为空白对照。(3)将金黄色葡萄球菌、大肠杆菌置于37℃下进行24h需氧培养，将短双歧杆菌和唾液乳杆菌置于37℃下进行48h厌氧培养。(4)用稀释平板法测定培养前后培养液中各种菌的数目，测试结果如表3所示。表3表3数据可以看出，加入灵芝发酵液培养一段时间后，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌这类有害菌数量比不加入灵芝发酵液的空白组低，但短双歧杆菌、唾液乳杆菌这类有益菌比不加入灵芝发酵液的空白组增加了。说明本发明的玫瑰发酵液可以作用于肠道微生物，特别是能够选择性抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等有害菌的生长，同时促进短双歧杆菌、唾液乳杆菌这类有益菌的生长，从而调节肠道菌群，使其达到健康平衡的状态。将其用于胶囊中，能够调节肠道微生态，达到促进人体健康的效果。本发明人也对制备例2-3、制备例6-10、制备例13-14进行了上述试验，结果基本一致，由于篇幅有限，不再一一列举。以下实施例中菊粉购自西安浩天生物工程有限公司，低聚果糖购自广州鸿易食品添加剂有限公司，麦芽糊精购自西安大丰收生物科技有限公司。实施例1利用制备例1制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液70kg、菊粉8kg、低聚果糖3kg和麦芽糊精13kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为83kg:15l，溶解温度为45℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至75℃，保温搅拌灭菌处理25min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。实施例2利用制备例13制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液80kg、菊粉5kg、低聚果糖5kg和麦芽糊精10kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为101kg:10l溶解温度为50℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至80℃，保温搅拌灭菌处理30min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。实施例3利用制备例14制备的灵芝子实体孢子粉发酵液制备胶囊，所述的胶囊包括灵芝子实体孢子粉发酵液90kg、菊粉3kg、低聚果糖8kg和麦芽糊精7kg。本实施例的胶囊的制备方法如下：(a)按照各原料的重量分别称取备用；(b)将各原料加入水混合搅拌溶解，总原料的质量与水的体积比为119kg:5l，溶解温度为55℃，得到混合液，再将所述的混合液升温至85℃，保温搅拌灭菌处理35min，过滤；(3)过滤后在-60℃冷冻6h，冻干曲线：-60℃干燥10h，-40℃干燥5h，-20℃干燥5h，0℃干燥5h，20℃干燥10h干燥，40℃干燥5h，进行胶囊填充，得到所述的含有灵芝子实体孢子粉发酵液的胶囊。对比例5本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为制备例11的灵芝子实体孢子粉发酵液。对比例6本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为对比例12的灵芝子实体孢子粉发酵液。对比例7本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，将灵芝子实体孢子粉发酵液替换为对比例1提取的灵芝子实体孢子粉水提液制备胶囊。对比例8本对比例的胶囊的原料及制备方法与实施例2相同，不同之处，不添加灵芝子实体孢子粉发酵液。试验例1将实施例1-3和对比例5-8制备的胶囊进行皮肤含水量测试及皮肤弹性测试，结果如表4和5所示。皮肤含水量测试选取实验室里6名志愿者，年龄范围22～40岁，其中5名志愿者分别服用了实施例1-3和对比例5-8制备的胶囊，服用量为每天1颗。第6名志愿者不服用胶囊作为空白组。测试期间只能使用基础类护肤品，不能使用任何功效类护肤品，同时注意防晒。选取脸颊两侧作为测试部位，在实验第0，14，30天采用皮肤水分测试仪水分测试探头corneometercm825测试其头皮角质层含水量，测试三次取平均值，结果如表4所示；在实验第0，14，30天使用皮肤弹性测试探头cutometermpa580测试皮肤弹性变化；测试三次取平均值，结果如表5所示。表4表5时间实施例1实施例2实施例3对比例5对比例6对比例7对比例8空白0d0.73540.67430.69830.68730.69210.78260.76290.769214d0.74240.69520.70820.68770.70210.78910.76380.769628d0.77680.70940.74290.70920.71180.79020.76490.7698皮肤弹性值越大，说明皮肤弹性越好，皮肤弹性与皮肤胶原蛋白以及弹性蛋白的流失息息相关，胶原蛋白和弹性蛋白的流失与皮肤松弛等衰老有关。皮肤弹性值变化越大说明产品效果越好。从表4和5可以看出与使用前以及空白组相比，本发明实施例1～3制备的胶囊服用28天后，在角质层含水量以及皮肤弹性方面均有一定变化。具体地，服用实施例1～3的胶囊的皮肤弹性值总体趋势是增大的，能够在一定程度上反映产品延缓衰老的效果。同时角质层含水量越高，说明产品提高皮肤保湿能力越好。将实施例2与对比例5-8比较可以发现，在其他原料不变的情况下添加了灵芝发酵液能对受试者的皮肤水润度和皮肤弹性带来正向影响，添加灵芝子实体比孢子粉比例在(10-1):(1-10)之间的灵芝发酵液效果更明显；如果把灵芝发酵液换成灵芝水提取液，其水润度和皮肤弹性变化都没有灵芝发酵液那么明显。说明灵芝发酵液能够对皮肤的水润与皮肤弹性有很好的作用。以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本
技术领域：
的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。当前第1页1 2 3
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