一种基于PP-TGase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法与流程

2021-01-06 19:01:04|

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本发明属于肉品加工储存技术领域，特别涉及一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法。

背景技术：

原料肉富含脂肪和蛋白质，在长期储藏及加工过程中，氧化是不可避免的自然现象；肌原纤维蛋白氧化通常会导致肉蛋白溶解度下降，进而引起加工性能，例如乳化性和凝胶性等劣变，最终导致产品得率降低、品质下降。因此，有效防控蛋白氧化或修复氧化损伤肉蛋白的功能特性具有重要的商业意义。现有研究聚焦于采用不同包装技术或添加抗氧化剂等手段降低储藏过程中原料肉的氧化损伤，上述方法在控制脂肪氧化方面非常有效，但是在控制蛋白氧化方面效果并不总是理想的。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，以提高肌原纤维蛋白凝胶性能，有效修复因蛋白氧化而造成的凝胶性能损伤，改善肉及肉制品的口感。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案为：

本发明提供了一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、提取肌原纤维蛋白，得到肌原纤维蛋白膏；

步骤2、采用磷酸盐缓冲液对肌原纤维蛋白膏进行稀释，得到肌原纤维蛋白稀释液；

步骤3、在肌原纤维蛋白稀释液中，加入脂肪氧化体系，得到的氧化反应体系；氧化反应后，得到氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶；

步骤4、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入凝胶性能修复剂，混匀后反应，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，凝胶性能修复剂采用焦磷酸钠溶液和谷氨酰胺转氨酶中的一种或两种；

步骤5、将反应后的肌原纤维蛋白凝胶置于密封容器中，水浴蒸煮，冷却，得到热诱导凝胶，所述热诱导凝胶即为性能修复后的肌原纤维蛋白凝胶。

进一步的，步骤1中，肌原纤维蛋白膏制备过程具体如下：

步骤11、将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织，切条备用；

步骤12、在切条后的猪外脊肉中加入僵直液，均浆捣碎，离心，得到沉淀物；

步骤13、在步骤12的沉淀物中加入nacl溶液，均浆搅拌，过滤，得到滤液；

步骤14，调节滤液ph至6.20-6.25，离心分离，得到沉淀，沉淀即为肌原纤维蛋白膏。

进一步的，步骤2中，磷酸盐缓冲液的ph为6.20-6.25，磷酸盐缓冲液浓度为25-30mmol/l。

进一步的，步骤3中，氧化反应体系中肌原纤维蛋白的浓度为30-35mg/ml；脂肪氧化体系采用脂肪氧合酶-亚油酸体系；其中，脂肪氧合酶-亚油酸体系中亚油酸的浓度为10-12mmol/l，脂肪氧合酶的浓度为3750-4000u/ml蛋白。

进一步的，步骤3中，氧化反应过程采用在0-4℃环境中，反应8-12h；采用在氧化反应体系中，加入trolox终止氧化反应；其中，trolox的浓度为1-1.2mmol/l。

进一步的，步骤4中，焦磷酸钠溶液的浓度为1-2mmol/l，谷氨酰胺转氨酶与肌原纤维蛋白底物的质量比为1:(500-550)；加入凝胶性能修复剂混匀后反应2-3h。

进一步的，步骤5中，水浴蒸煮过程，采用以1-2℃/min的升温速度，使水浴温度从20-25℃加热至75-80℃，并在75-80℃条件下保温10-15min。

进一步的，步骤5中，冷却过程，采用在冷水浴中，冷却30-40min后，放置于0-4℃条件下冷藏处理8-12h。

进一步的，步骤1中，肌原纤维蛋白提取过程采用在0-4℃条件下进行。

进一步的，步骤1中，将制备的肌原纤维蛋白膏，置于碎冰中保存备用，并在48h内使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

本发明提供了一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，通过在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入焦磷酸钠溶液或谷氨酰胺转氨酶，采用焦磷酸钠或谷氨酰胺转氨酶对氧化损伤肌原纤维蛋白进行修复；通过加入焦磷酸钠溶液，焦磷酸钠能有效改变氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶的构象，将肌动球蛋白解离为肌球蛋白和肌动蛋白，有效提高肌原纤维蛋白溶解度，降低肌原纤维蛋白的平均粒度，改善凝胶性能和持水性；修复处理后的肌原纤维蛋白的微观结构相比氧化损伤肌原纤维蛋白的凝胶更规则均匀，且细腻致密；通过采用谷氨酰胺转氨酶进行修复，谷氨酰胺转氨酶以多肽或蛋白质的谷氨酰胺残基的γ-羟胺基团为酰基供体，通过转酰基作用形成一种非二硫共价键，使肌原纤维蛋白的分子间发生交联，显著改善了肌原纤维蛋白的凝胶强度，凝胶的微观结构孔径变小，结构致密；通过采用焦磷酸钠和谷氨酰胺转氨酶同时修复处理时，焦磷酸钠和谷氨酰胺转氨酶能够产生协同效果，修复后的凝胶强度及持水性显著增强，且明显好于未氧化肌原纤维蛋白的凝胶性能，进而能够有效改善肉及肉制品的色泽和口感。

本发明原料肉中富含脂肪，脂肪氧化产物是诱导蛋白发生氧化的重要因素，采用脂肪氧化体系诱导肌原纤维蛋白结构展开，肌原纤维蛋白分子间s-s形成及疏水相互作用增强、蛋白质交联聚集加剧，导致肌原纤维蛋白的平均粒径显著增大，溶解度显著降低；氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶的α-螺旋含量减少，同时伴随着β-折叠、β-转角以及无规则卷曲含量的上升，实现了诱导蛋白发生氧化，为氧化损伤蛋白功能特性的修复研究提供条件。

附图说明

图1为本发明所述的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法的工艺流程图；

图2为对比例1-2及实施例1-3中修复后的肌原纤维蛋白凝胶的持水性柱状图；

图3为对比例1-2及实施例1-3中修复后的肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度柱状图；

图4为对比例1-2及实施例1-3中修复后的肌原纤维蛋白凝胶的扫描电镜图。

具体实施方式

为了使本发明所解决的技术问题，技术方案及有益效果更加清楚明白，以下具体实施例，对本发明进行进一步的详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

如附图1所示，本发明提供了一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取猪肉肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤12、分离；将处理好的条状外脊肉置于组织捣碎机中，加入四倍体积的僵直液，均浆捣碎后离心，得到初次沉淀物；在初次沉淀物中加入四倍体积的僵直液，重复均浆捣碎，离心3-4次，得到沉淀物；其中，僵直液中nacl的浓度为0.1-0.15mol/l，mgcl2的浓度为2-3mmol/l，na2hpo4的浓度为10-11mmol/l，egta的浓度为1-1.5mmol/l，ph为7.0-7.05；均浆捣碎条件为15s×4次；离心过程采用在0-4℃，2000×g条件下，离心15-20min。

步骤13、过滤；在步骤12的沉淀物中加入四倍体积的nacl溶液，均浆搅拌后，经四层纱布过滤，得到滤液；采用hcl溶液，将滤液ph调节至6.20-6.25；再次离心后，得到沉淀，沉淀即为肌原纤维蛋白膏；其中，nacl溶液的浓度为0.1-0.15mol/l，hcl溶液的浓度为0.1-0.15mol/l。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白的氧化处理以及焦磷酸钠或谷氨酰胺转氨酶的添加，具体包括以下步骤：

步骤21、采用磷酸盐缓冲液对肌原纤维蛋白膏进行稀释，得到肌原纤维蛋白稀释液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25；肌原纤维蛋白稀释液的浓度为45-50mg/ml，磷酸盐缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l。

步骤22、在肌原纤维蛋白稀释液中加入脂肪氧化体系，得到氧化反应体系；氧化反应体系中肌原纤维蛋白的浓度为30-35mg/ml；其中，脂肪氧化体系采用脂肪氧合酶-亚油酸氧化体系，脂肪氧化体系中亚油酸的浓度为10-12mmol/l，脂肪氧合酶的浓度为3750-4000u/ml蛋白。

步骤23、将氧化反应体系置于0-4℃条件下，进行氧化反应，反应时间为8-12h，得到氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶；在氧化反应体系中加入trolox，终止氧化反应；其中，trolox的浓度为1-1.2mmol/l。

步骤24、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入凝胶性能修复剂，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，凝胶性能修复剂采用焦磷酸钠溶液和谷氨酰胺转氨酶中的一种或两种；其中，焦磷酸钠溶液的浓度为1-2mmol/l，谷氨酰胺转氨酶与肌原纤维蛋白底物的质量比为1:(500-550)。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

将步骤2中制备的反应后的肌原纤维蛋白凝胶放入玻璃瓶中，采用保鲜膜密封后，置于水浴锅中，水浴蒸煮，冷却，得到热诱导凝胶，所述热诱导凝胶即为性能修复后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，水浴蒸煮条件为：以1-2℃/min的升温速度，使水浴温度从20-25℃加热至75-80℃，并在75-80℃处保温10-15min；冷却过程，采用在冷水浴中，冷却30-40min后，放置于0-4℃条件下冷藏处理8-12h。

对比例1

对比例1中提供了一种氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取猪肉肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，并于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白空白对照处理，具体包括以下步骤：

步骤21、采用磷酸盐缓冲液，对肌原纤维蛋白膏进行稀释，得到肌原纤维蛋白稀释液。其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25；肌原纤维蛋白稀释液的浓度为45-50mg/ml,磷酸盐缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l。

步骤22、在肌原纤维蛋白稀释液中加入磷酸盐缓冲液，得到空白对照体系，其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l；空白对照体系中肌原纤维蛋白的浓度为30-35mg/ml。

步骤23、将空白对照体系置于0-4℃条件下，进行氧化反应，反应时间为8-12h，得到氧化后肌原纤维蛋白凝胶；在氧化反应体系中加入trolox，终止氧化反应；其中，trolox的浓度为1-1.2mmol/l。

步骤24、在氧化后肌原纤维蛋白凝胶中加入磷酸盐缓冲液，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

对比例2

对比例2提供了一种氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，并于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白的氧化处理，具体包括以下步骤：

步骤21、采用磷酸盐缓冲液，对肌原纤维蛋白膏进行稀释，得到肌原纤维蛋白稀释液；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25；肌原纤维蛋白稀释液的浓度为45-50mg/ml,磷酸盐缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l。

步骤24、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入磷酸盐缓冲液，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

将步骤2中制备的反应后的肌原纤维蛋白凝胶放入玻璃瓶中，采用保鲜膜密封后，置于水浴锅中，水浴蒸煮，冷却，得到热诱导凝胶，所述热诱导凝胶即为性能提高后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，水浴蒸煮条件为：以1-2℃/min的升温速度，使水浴温度从20-25℃加热至75-80℃，并在75-80℃处保温10-15min；冷却过程，采用在冷水浴中，冷却30-40min后，放置于0-4℃条件下冷藏处理8-12h。

实施例1

本实施例1提供了一种基于pp的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取猪肉肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，并于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白的氧化处理及氧化后物质的添加，具体包括以下步骤：

步骤24、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入凝胶性能修复剂，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，凝胶性能修复剂采用焦磷酸钠溶液及磷酸盐缓冲液的混合物；其中，焦磷酸钠溶液的浓度为1-2mmol/l，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l；其中肌原纤维蛋白的终浓度为30mg/ml。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

实施例2

本实施例2提供了一种基于tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取猪肉肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，并于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白的氧化处理及氧化后物质的添加，具体包括以下步骤：

步骤24、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入凝胶性能修复剂，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，凝胶性能修复剂采用谷氨酰胺转氨酶与磷酸盐缓冲液的混合物；其中，谷氨酰胺转氨酶(1000u/g)与肌原纤维蛋白底物的质量比为1：(500-550)，磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l；其中肌原纤维蛋白的终浓度为30mg/ml。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

实施例3

本实施例3提供了一种基于pp-tgase的氧化损伤蛋白凝胶性能修复方法，包括以下步骤：

步骤1、在0-4℃条件下，提取猪肉肌原纤维蛋白，制备肌原纤维蛋白膏；制备过程具体包括以下步骤：

步骤11、切条；将猪外脊肉去除脂肪及结缔组织等，切成条状称重备用。

步骤14、储存；将所得肌原纤维蛋白膏置于塑料离心杯中，并于碎冰中保存，并于48h内使用。

步骤15、测定蛋白质浓度；以bsa作为标准蛋白，采用双缩脲法测定肌原纤维蛋白膏中蛋白质浓度。

步骤2、肌原纤维蛋白的氧化处理及氧化后物质的添加，具体包括以下步骤：

步骤24、在氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶中加入凝胶性能修复剂，混匀后反应2-3h，得到反应后的肌原纤维蛋白凝胶；其中，凝胶性能修复剂采用焦磷酸钠溶液、谷氨酰胺转氨酶及磷酸盐缓冲液的混合物；其中，焦磷酸钠溶液的浓度为1-2mmol/l，谷氨酰胺转氨酶与肌原纤维蛋白底物的质量比为1:(500-550)；磷酸盐缓冲液的浓度为25-30mmol/l，ph为6.20-6.25，缓冲液中nacl的浓度为0.4-0.45mol/l；其中肌原纤维蛋白的终浓度为30mg/ml。

步骤3、热诱导凝胶制备，具体包括以下步骤：

实验方法

肌原纤维蛋白凝胶性能测定

在测定凝胶性能之前，需要将凝胶样品在室温下平衡2h；凝胶持水性的测定：将凝胶置于离心管中于4℃下离心，在6000g条件下，离心15min，记录离心管质量m以及离心前离心管和凝胶总重量m1和离心后去除离心管中水分后总重量m2；持水性的计算公式如下：

凝胶强度的测定：样品凝胶强度用ta-xtplus物性分析仪进行测定；测定模式：测前速率为5mm/s；测中速率为1mm/s；测后速率为5mm/s；下压距离为8mm，探头型号为p/0.5。凝胶强度定义为刺破凝胶所需的初始压力n。

扫描电镜

将制备的肌原纤维蛋白凝胶切块，用2.5％的戊二醛(溶于ph7.4的磷酸盐缓冲液)固定4h，用ph7.4的磷酸盐缓冲液清洗一次，采用乙醇按50％、70％、90％、95％和100％梯度脱水，脱水时间为每次30min，而后在-70℃冷冻干燥，粘样，喷金后用扫描电镜对肌原纤维蛋白凝胶微观结构进行观察，放大倍数4000倍，加速电压15kv。

实验结果

凝胶的持水性指凝胶在外力作用下保持自身水分或者补充水分的能力，它与凝胶内部结构相关；不同凝胶性能修复剂处理下肌原纤维蛋白凝胶的持水性，如附图2所示，与未氧化蛋白相比，经氧化处理后的对照蛋白较未氧化蛋白的持水性下降16％；焦磷酸钠以及焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶的加入使氧化损伤蛋白凝胶的持水性分别上升了28.6％和10.4％，谷氨酰胺转氨酶的单独添加其持水性与氧化损伤蛋白无显著性差异；焦磷酸钠的单独或与谷氨酰胺转氨酶复配使用均在很大程度上增强了凝胶的持水性能。

如图3所示，氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度下降明显，与未氧化肌原纤维蛋白凝胶相比，氧化对照蛋白的凝胶强度下降23.8％。而焦磷酸钠、谷氨酰胺转氨酶及焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶的加入对于氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度均具有明显的促进作用，焦磷酸钠的加入使氧化损伤的肌原纤维蛋白的凝胶强度提高了18.8％，其与焦磷酸钠在肌原纤维蛋白凝胶中的作用分不开；谷氨酰胺转氨酶及焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶的加入使其凝胶性能大幅度提升，由于谷氨酰胺转氨酶与蛋白发生交联，从而降低了蛋白质分子之间的静电斥力，增强了非极性分子间的疏水相互作用。

不同凝胶性能修复剂下肌原纤维蛋白凝胶的微观结构，如图4所示，肌原纤维蛋白凝胶的微观结构的变化与凝胶持水能力和凝胶强度的变化密切相关：未氧化的肌原纤维蛋白凝胶结构细密、均匀，是一种规则连续的三维网状结构，然而氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶其微观结构不规则，粗糙且多孔；与氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶相比，焦磷酸钠的使用使凝胶的微观结构得到较为明显的改善：肌原纤维蛋白凝胶的微观结构变得更加细腻、光滑、规则、孔径也较小，对应了其明显增强的凝胶强度以及持水性能，这一结果与焦磷酸钠引起的肌动球蛋白解离和溶解度增加有关；谷氨酰胺转氨酶的单独使用使氧化损伤的肌原纤维蛋白凝胶结构更加紧致，添加谷氨酰胺转氨酶的氧化损伤蛋白凝胶拥有较好的凝胶强度。

本发明通过采用焦磷酸钠处理使得氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶的微观结构更加均匀、细腻，持水性能显著增强；谷氨酰胺转氨酶处理显著改善了氧化损伤mp的凝胶强度；焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶处理使得氧化损伤肌原纤维蛋白凝胶性能显著改善，表现为凝胶三维网络结构更加的细密、均匀，凝胶强度和持水性能均显著增加；焦磷酸钠+谷氨酰胺转氨酶协同使用效果最好，可以有效修复氧化损伤猪肉肌原纤维蛋白的凝胶性能；因此，在肉品加工业中焦磷酸钠和谷氨酰胺转氨酶复配有望改善氧化损伤原料肉的加工性能、提高肉品品质和企业经济效益。

上述实施例仅仅是能够实现本发明技术方案的实施方式之一，本发明所要求保护的范围并不仅仅受本实施例的限制，还包括在本发明所公开的技术范围内，任何熟悉本技术领域的技术人员所容易想到的变化、替换及其他实施方式。

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