一种酶交联大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的制备方法与流程

本发明涉及一种酶交联大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的制备方法，属于食品蛋白质加工的技术领域。

背景技术：

碎米是一种廉价的大米加工副产品，主要用于饲料，不仅降低了商品的价值，而且还造成了大米资源的浪费。碎米中含有较多的蛋白质，大米蛋白具有低过敏性、高营养价值和氨基酸种类丰富的特点。大米蛋白根据其溶解性的不同可以分为清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白。其中，谷蛋白占大米蛋白的约80％，通常通过疏水相互作用和二硫键形成聚集体和水不溶性大分子。蛋白质的功能特性包括凝胶化、溶解性、乳化性、发泡性等等。大米蛋白在食品加工(例如米豆腐)中最重要的功能特性之一是它们在加热时的凝胶特性，这显著影响最终产品的质地和感官特性。

蛋白凝胶化包括蛋白质肽链的伸展、裂解、结合及聚集等四个复杂的过程，通过伸展肽链间的相互作用而形成凝胶。首先，蛋白在适当的条件下，蛋白质分子开始缓慢伸展，原来埋在分子链内部的巯基、二硫键、疏水性基团等功能基团暴露出来，相邻的分子通过氢键、疏水相互作用、二硫键、范德华力以及静电相互作用等作用力形成网状的空间结构，从而形成凝胶。

蛋白凝胶的制备方法主要有：热处理、添加凝固剂、酶法和添加交联剂等。

1、热处理：加热是诱导凝胶形成最直接的一种方法。热致凝胶属于物理凝胶的一种，是由分子间的氢键、静电耦合、配位键、疏水结合和范德瓦耳斯力等方式形成。在热诱导蛋白凝胶形成的过程中，涉及的分子作用力可能是氢键、疏水性相互作用，而维持凝胶结构可能的作用力是二硫键和氢键。

2、添加凝固剂：目前使用的凝固剂主要有盐、盐卤和石膏等无机盐、酸、酶和其他一些天然汁液。其中，盐和酸被广泛使用。

3、酶法：蛋白质经过酶作用水解后，通过非共价键(疏水相互作用)促使其分子内或分子间交联，促进凝胶的形成。原因是蛋白质经水解后，内部疏水基团暴露促使了分子间相互交联作用的加强，提高蛋白的凝胶性。转谷氨酰胺酶属于酰基转移酶，可以催化蛋白质分子间的交联和聚合形成网络结构，产生新的共价键，以此提高蛋白质的凝胶性。漆酶作为一种多酚氧化酶，能够催化氧化阿魏酸形成醌类，与蛋白质分子中的巯基、氨基、亚氨基等发生加成反应，使得阿魏酸和蛋白质之间形成更加稳定的c-n或c-s共价键。

4、添加交联剂：最近，以戊二醛为代表的交联剂成为交联凝胶的研究热点，通过氨基酸残基侧链的非交联修饰，改变等电点和其他凝胶性质。

技术实现要素：

本发明旨在提供一种酶交联大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的制备方法，本方法制得的复合凝胶具有凝胶强度高和持水性好的特点。本发明方法新颖，安全性好，工艺简便，过程可控，无需复杂设备，有利于生产硬度大、持水性高的蛋白质凝胶。

本发明通过漆酶催化氧化甜菜果胶中的阿魏酸形成醌类，与大米谷蛋白分子中的巯基、氨基、亚氨基等发生加成反应，使得甜菜果胶和大米谷蛋白之间形成更加稳定的c-n或c-s共价键。漆酶能够有效地促进甜菜果胶和大米谷蛋白交联，从而改善蛋白质的凝胶网络结构、乳化特性和流变学特性。

本发明酶交联大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的制备方法，是以碎米为原料，采用碱提酸沉法得到大米谷蛋白，先将大米谷蛋白溶液与甜菜果胶溶液充分混合，再加入漆酶，最后加热冷却获得大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶。具体包括如下步骤：

步骤1：将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的nacl溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05m的naoh溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，取上清液，使用1m的hcl溶液调节上清液的ph值至5.4，离心留取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；将大米谷蛋白与蒸馏水以8-10g:100ml的比例混合，并调节ph值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；

步骤2：将甜菜果胶(分子量为30kda)与蒸馏水以3-5g:100ml的比例混合，然后加入到步骤1获得的大米谷蛋白溶液中，并在室温下充分搅拌4小时，使得大米谷蛋白和甜菜果胶充分混合；

步骤3：将漆酶以5-7u:1ml的比例加入到步骤2获得的混合溶液中，在40℃下保温静置4小时，然后将混合溶液在90℃下恒温水浴加热15分钟使蛋白质充分变性，结束后立即置于冰水浴冷却至室温，形成复合凝胶，4℃储存。

对于本方法使用的漆酶诱导交联大米谷蛋白-甜菜果胶制备复合凝胶来说，当大米谷蛋白/甜菜果胶浓度配比发生变化时，体系的ph值也会发生改变，这不仅会改变凝胶的微观结构，也会改变蛋白质和甜菜果胶之间的静电作用力，因此凝胶的硬度和持水性也会发生相应的变化。另外，大米谷蛋白的酪氨酸和甜菜果胶中的阿魏酸是漆酶作用的重要位点，适当浓度的漆酶添加对于大米谷蛋白/甜菜果胶复合凝胶凝胶强度和持水性的提升具有重要意义。

与已有技术相比，本发明的有益效果体现在：

1、本发明使用的交联剂是漆酶，它是一种多酚氧化酶，能结合多个铜离子，属于铜蓝氧化酶，作为一种生物催化剂，漆酶不仅具有高效率的催化效果，而且其催化的最终产物是水，因此也是一种绿色催化剂。

2、利用漆酶交联甜菜果胶和大米谷蛋白，与其他方法相比，本方法具有高效、绿色和安全等优点。

3、本发明使用漆酶交联大米谷蛋白和甜菜果胶形成复合凝胶，与纯大米谷蛋白凝胶相比，本发明制备的复合凝胶其凝胶硬度提高到6.80n，持水性增加到83.14％。由此可知，由漆酶交联制备的甜菜果胶和大米谷蛋白复合凝胶的凝胶硬度和持水性大大增加，提高了其在食品领域中的应用价值。

4、本发明安全性好，无环境污染，工艺简单，无需复杂设备，易于工业化生产。

附图说明

图1是实施例1中大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性。样品1、2和3分别代表大米谷蛋白凝胶、无漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶和漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶。从图1中可以看出，漆酶诱导交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的凝胶硬度和持水性分别为5.83n和80.98％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，无漆酶交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性显著增大，使用漆酶诱导大米谷蛋白和甜菜果胶交联形成的复合凝胶，其凝胶硬度和持水性又进一步增大。

图2是实施例2中大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性。样品1、2和3分别代表大米谷蛋白凝胶、无漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶和漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶。从图2中可以看出，漆酶诱导交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的凝胶硬度和持水性分别为6.80n和83.14％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，无漆酶交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性显著增大，使用漆酶诱导大米谷蛋白和甜菜果胶交联形成的复合凝胶，其凝胶硬度和持水性又进一步增大。

图3是实施例3中大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性。样品1、2和3分别代表大米谷蛋白凝胶、无漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶和漆酶交联的甜菜果胶-大米谷蛋白复合凝胶。从图3中可以看出，漆酶诱导交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的凝胶硬度和持水性分别为6.21n和79.08％。与纯大米谷蛋白凝胶相比，无漆酶交联的大米谷蛋白-甜菜果胶复合凝胶的硬度和持水性显著增大，使用漆酶诱导大米谷蛋白和甜菜果胶交联形成的复合凝胶，其凝胶硬度和持水性又进一步增大。

具体实施方式

非限定实施方式叙述如下：

实施例1：

1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的nacl溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05m的naoh溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，取上清液，使用1m的hcl溶液调节上清液的ph值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；将大米谷蛋白与蒸馏水以8g:100ml的比例混合，并调节ph值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；

2、将甜菜果胶(分子量为30kda)与蒸馏水以3g:100ml的比例混合，然后加入到上述大米谷蛋白溶液中，并在室温下充分搅拌4小时，使得大米谷蛋白和甜菜果胶以8g:3g的比例充分混合。

3、将漆酶以5u:1ml的比例加入到上述混合溶液中，在40℃下保温静置4小时。然后将混合溶液在90℃下恒温水浴加热15分钟使蛋白质充分变性，结束后立即置于冰水浴冷却至室温，形成复合凝胶在4℃储存。

经测定，漆酶交联制备的甜菜果胶和大米谷蛋白复合凝胶的凝胶硬度由1.33n增加到5.83n，持水性由35.09％增加到80.98％。

实施例2：

1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的nacl溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05m的naoh溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，取上清液，使用1m的hcl溶液调节上清液的ph值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；将大米谷蛋白与蒸馏水以9g:100ml的比例混合，并调节ph值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；

2、将甜菜果胶(分子量为30kda)与蒸馏水以4g:100ml的比例混合，然后加入到上述大米谷蛋白溶液中，并在室温下充分搅拌4小时，使得大米谷蛋白和甜菜果胶以9g:4g的比例充分混合。

3、将漆酶以6u:1ml的比例加入到上述混合溶液中，在40℃下保温静置4小时。然后将混合溶液在90℃下恒温水浴加热15分钟使蛋白质充分变性，结束后立即置于冰水浴冷却至室温，形成复合凝胶在4℃储存。

经测定，漆酶交联制备的甜菜果胶和大米谷蛋白复合凝胶的凝胶硬度由1.61n增加到6.80n，持水性由39.19％增加到83.14％。

实施例3：

1、将碎米研磨过100目筛后，将碎米粉与蒸馏水以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为5wt％的nacl溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，将所得沉淀物与浓度为0.05m的naoh溶液以1g:10ml的比例混合，室温下搅拌2小时后离心，取上清液，使用1m的hcl溶液调节上清液的ph值至5.4，离心取沉淀，水洗两次，冷冻干燥得到大米谷蛋白；将大米谷蛋白与蒸馏水以10g:100ml的比例混合，并调节ph值至大米谷蛋白完全溶解，4℃过夜，使其充分水合；

2、将甜菜果胶(分子量为30kda)与蒸馏水以5g:100ml的比例混合，然后加入到上述大米谷蛋白溶液中，并在室温下充分搅拌4小时，使得大米谷蛋白和甜菜果胶以10g:5g的比例充分混合。

3、将漆酶以7u:1ml的比例加入到上述混合溶液中，在40℃下保温静置4小时。然后将混合溶液在90℃下恒温水浴加热15分钟使蛋白质充分变性，结束后立即置于冰水浴冷却至室温，形成复合凝胶在4℃储存。

经测定，漆酶交联制备的甜菜果胶和大米谷蛋白复合凝胶的凝胶硬度由1.45n增加到6.21n，持水性由37.33％增加到79.08％。

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