一种丝素蛋白纳米纤维晶须的制备方法与流程

本发明涉及一种丝素蛋白纳米纤维晶须的制备方法，特别涉及一种利用超声辅助硫酸制备丝素蛋白纳米纤维晶须的方法，属于生物材料技术领域。

背景技术：

丝素蛋白，即蚕丝纤维，是一种天然蛋白纤维，主要来源于家蚕，它的基本结构由结晶区和非结晶区组成，其中结晶区主要是甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的残基组成，约占2/3，这些残基组成片状结构，结晶区的主要作用是维持机械强度，非结晶区主要由苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸组成，约占1/3，非晶区的主要作用是吸湿和抗紫外线。丝素蛋白的主要分子构象为2种，silkⅰ型和silkⅱ型：silkⅰ型是由α-螺旋和β-平行折叠构象交替堆叠而成，属于正交晶系；silkⅱ型是反平行β折叠的层状结构。丝素蛋白无毒、无免疫原性，生物相容性好，利于生物降解，可用于固定化细胞，作为酶和抗体的载体。

丝基材料的性质与在中尺度或纳米尺度上独特的空间排列结构密切相关，在任何一种尺度上的微小变化都能引起产物显著的性质变化。丝素蛋白纳米纤维晶须是由天然丝素蛋白经由纳米化和短纤化过程得到的具有纳米尺度且性能优异的固体产物。丝素蛋白纳米纤维晶须不仅具有普通丝素蛋白的基本结构和性能，还具有纳米纤维晶须的特征，如比表面积大、强度大和反应活性高等。丝素蛋白纳米纤维晶须比普通的丝素蛋白具有更多的反应位点，可用于高效地丝素化学改性。丝素蛋白纳米纤维晶须在作为生物传感器、给药材料、材料增强相、三维支架、仿生血管领域有很大的应用前景。

蚕茧中含有两大主要蛋白组分：丝素蛋白和丝胶蛋白，其中，丝胶蛋白包裹丝素蛋白，两者以复合体的形式存在。有研究表明，丝素蛋白和丝胶蛋白的同时存在在一定程度上会引起机体的免疫反应，在脱去丝胶蛋白后，剩余的丝素蛋白不会引发免疫反应。因此，利用碱性溶液先对蚕茧进行脱胶，对于丝素蛋白的生物性应用具有实际意义。

就目前而言，丝素蛋白纳米纤维晶须制备方法的局限几乎成为其应用的短板。现阶段制备丝素蛋白纳米纤维晶须所采用的方法主要是利用naoh/尿素水溶液经过溶解、透析和离心后得到，但是制备周期较长，操作步骤繁琐。还有制备再生丝素纳米纤维的方法，但是再生丝素纳米纤维的结构和强度远不及原生丝。中国专利(zl201911045481.7)“丝素纳米纤维和基于丝素纳米纤维的载银抗菌辅料的制备方法”中，将丝素蛋白置于naoh/尿素水溶液中得到溶解液后，透析溶解液，超声处理，冷冻离心，耗时约150h，得到丝素蛋白纳米纤维晶须水溶液。

丝素蛋白在生物医学上的应用十分广泛，因为它的生物相容性优于纤维素。将丝素蛋白变成丝素蛋白纳米纤维晶须，在一定程度上可以拓展其应用。利用超声辅助硫酸制备丝素蛋白纳米纤维晶须的方法，可以制备得到分散均匀，长径均匀的晶须，实验重复性好，耗时短，对于丝素蛋白纳米纤维晶须的制备具有重要意义。

技术实现要素：

为了克服目前制备丝素蛋白纳米纤维耗时长，制备工艺较为复杂，制备方法较少等问题，本发明的目的是提供一种丝素蛋白纳米纤维晶须的制备方法。

为实现上述目的，本发明的技术方案是采取以下步骤：

1)将蚕茧剪成大约1×1cm²的小块，使用1000ml0.5％(w/w)na2co3溶液进行煮沸30min脱胶，去离子水反复冲洗，重复3次，60℃烘干过夜，得到丝素蛋白；

2)将步骤1)得到的丝素蛋白置于100～200w超声反应器中，45～75℃酸性溶液中，反应30～180min，采用5倍酸溶液体积的室温去离子水终止反应，清洗酸液，得到反应物；

3)将步骤2)得到的反应物利用去离子水稀释，用碱性溶液中和，并将丝素纳米晶须悬浮液中由中和反应产生的盐分除去，得到高纯度丝素纳米晶须悬浮液；

4)将步骤3)得到的高纯度丝素纳米晶须悬浮液于200～400w的超声细胞粉碎机中粉碎10～30min，得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液；

5)将步骤4)得到的分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液冻干，得到丝素蛋白纳米纤维晶须。

所述的酸性溶液为h2so4溶液，质量分数为45～60wt％，蚕丝纤维与h2so4溶液的质量比为1:10～20；碱性溶液为质量分数为0.05～0.2wt％naoh溶液和饱和ca(oh)2溶液中的一种。

所述碱性溶液中和的中和反应为利用去离子水清洗除盐和利用透析袋透析除盐方式中的一种；利用去离子水清洗除盐的方式是利用去离子水稀释中和液，充分震荡后，在7830rpm下离心分离10～30min，重复3次；利用透析袋透析除盐的方式是将中和液在室温下透析72-120h，透析袋截留分子量3500～7000kda。

所述超声细胞粉碎机粉碎运行方法为每工作10s，休息15s。

与背景技术相比，本发明具有的有益效果是：

本发明在制备丝素蛋白纳米纤维晶须的方法中引入利用硫酸制备丝素蛋白纳米纤维晶须的方法，扩充了丝素蛋白纳米纤维晶须制备方法的范围，有利于加快突破丝素纤维纳米纤维晶须制备方法的局限，同时提出了利用超声辅助进行传质，有利于得到分散均匀，长径均匀的晶须，实验重复性好，产物回收率佳，耗时短，对于丝素蛋白纳米纤维晶须的制备具有重要意义。

附图说明

图1是实施例4制备的丝素蛋白纳米纤维晶须的场发射扫描电镜照片。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。

下述实施例中的试验方法，若无特殊说明，均为常规方法。

实施例1

1)将蚕茧剪成大约1×1cm²的小块，使用1000ml0.5％(w/w)na2co3溶液进行煮沸30min脱胶，去离子水反复冲洗，重复3次，60℃烘干过夜，得到丝素蛋白；

2)配置60wt％h2so4溶液后，将其置于恒温水浴锅中预热至45℃，转移至100w超声反应器中，将步骤1)中得到的丝素蛋白中较为明显的缠结部分拉开，放入预热好的h2so4溶液中反应30min，丝素蛋白与h2so4溶液的质量比为1:10，采用5倍酸溶液体积的室温去离子水终止反应，清洗酸液，得到反应物；

3)将步骤2)得到的反应物利用去离子水稀释，用0.2wt％naoh溶液中和，利用去离子水清洗除盐的方法，将丝素纳米晶须悬浮液中由中和反应产生的盐分除去：用去离子水稀释震荡后，在7830rpm下离心分离30min，重复3次后，得到高纯度丝素纳米晶须悬浮液；

4)将步骤3)中得到的高纯度丝素纳米晶须悬浮液于200w的超声细胞粉碎机中每工作10s休息15s粉碎10min，得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液；

5)将步骤4)中得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液冻干，最终得到丝素蛋白纳米纤维晶须。

实施例2

1)将蚕茧剪成大约1×1cm²的小块，使用1000ml0.5％(w/w)na2co3溶液进行煮沸30min脱胶，去离子水反复冲洗，重复3次，60℃烘干过夜，得到丝素蛋白；

2)配置45wt％h2so4溶液后，将其置于恒温水浴锅中预热至75℃，转移至100w超声反应器中，将步骤1)中得到的丝素蛋白中较为明显的缠结部分拉开，放入预热好的h2so4溶液中反应30min，丝素蛋白与h2so4溶液的质量比为1:10，采用5倍酸溶液体积的室温去离子水终止反应，清洗酸液，得到反应物；

3)将步骤2)得到的反应物利用去离子水稀释，用0.05wt％naoh溶液中和，利用去离子水清洗除盐的方法，将丝素纳米晶须悬浮液中由中和反应产生的盐分除去：用去离子水稀释震荡后，在7830rpm下离心分离10min，重复3次后，得到高纯度丝素纳米晶须悬浮液；

4)将步骤3)中得到的高纯度丝素纳米晶须悬浮液于200w的超声细胞粉碎机中每工作10s休息15s粉碎10min，得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液；

5)将步骤4)中得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液冻干，最终得到丝素蛋白纳米纤维晶须。

实施例3

1)将蚕茧剪成大约1×1cm²的小块，使用1000ml0.5％(w/w)na2co3溶液进行煮沸30min脱胶，去离子水反复冲洗，重复3次，60℃烘干过夜，得到丝素蛋白；

2)取适当长度截留分子量为7000kda的透析袋，用去离子水进行煮沸10min，用去离子水洗涤3次，备用；

3)配置45wt％h2so4溶液后，将其置于恒温水浴锅中预热至45℃，转移至200w超声反应器中，将步骤1)中得到的丝素蛋白中较为明显的缠结部分拉开，放入预热好的h2so4溶液中反应180min，丝素蛋白与h2so4溶液的质量比为1:20，采用5倍酸溶液体积的室温去离子水终止反应，清洗酸液，得到反应物；

4)将步骤3)得到的反应物利用去离子水稀释，用饱和ca(oh)2溶液中和，利用透析袋透析除盐的方式，将丝素纳米晶须悬浮液中由中和反应产生的盐分除去：将悬浮液倒入步骤2)中处理好的透析袋中，然后置于去离子水中磁力搅拌透析120h，每12h换1次去离子水，得到高纯度丝素纳米晶须悬浮液；

5)将步骤4)中得到的高纯度丝素纳米晶须悬浮液于400w的超声细胞粉碎机中每工作10s休息15s粉碎30min，得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液；

6)将步骤5)中得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液冻干，最终得到丝素蛋白纳米纤维晶须。

实施例4

1)将蚕茧剪成大约1×1cm²的小块，使用1000ml0.5％(w/w)na2co3溶液进行煮沸30min脱胶，去离子水反复冲洗，重复3次，60℃烘干过夜，得到丝素蛋白；

2)取适当长度截留分子量为3500kda的透析袋，用去离子水进行煮沸10min，用去离子水洗涤3次，备用；

3)配置50wt％h2so4溶液后，将其置于恒温水浴锅中预热至55℃，转移至200w超声反应器中，将步骤1)中得到的丝素蛋白较为明显的缠结部分拉开，放入预热好的h2so4溶液中反应60min，丝素蛋白与h2so4溶液的质量比为1:20，采用5倍酸溶液体积的室温去离子水终止反应，清洗酸液，得到反应物；

4)将步骤3)得到的反应物利用去离子水稀释，用0.05％naoh溶液中和，利用透析袋透析除盐的方式，将丝素纳米晶须悬浮液中由中和反应产生的盐分除去：将悬浮液倒入步骤2)中处理好的透析袋中，然后置于去离子水中磁力搅拌透析72h，每12h换1次去离子水，得到高纯度丝素纳米晶须悬浮液；

5)将步骤4)中得到的高纯度丝素纳米晶须悬浮液于300w的超声细胞粉碎机中每工作10s休息15s粉碎30min，得到分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液；

6)将步骤5)中得到的分散性良好的丝素纳米晶须悬浮液冻干，最终得到丝素蛋白纳米纤维晶须。

从实施例4制备的丝素蛋白纳米纤维晶须的场发射扫描电镜照片可看出，其形貌接近于棒状，由于具有较高的比表面积和丰富的表面羟基，制备的丝素蛋白纳米纤维晶须出现了轻微的相互吸引和团聚现象。

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