一种具有降血脂及安神除烦功效的豆豉的制备方法与流程

本发明属于食品发酵领域，具体地说，涉及一种具有降血脂及安神除烦功效的豆豉的制备方法。

背景技术：

豆豉作为我国一种传统发酵食品，是以黄豆或黑豆为原料，利用毛霉、曲霉、根霉等微生物发酵而得，其历史悠久，种类繁多。发酵后的豆豉富含多种生理活性物质，但由于豆豉含盐量较高，产品功效性参差不齐，导致豆豉在我国多作为调味品，其功效性未得到较好的开发。而豆豉是以黑豆为原料，以桑叶、青蒿为辅料发酵而得；作为一味常用的传统中药，中医临床上有解表、除烦、宣发郁热的功效，用于寒热头痛、烦躁胸闷和虚烦不眠的治疗。

高脂血症主要指的是血浆中总胆固醇水平或甘油三酯水平过高，血脂过高容易引发心脑血管疾病，进而危害人类健康。研究表明，大豆异黄酮可以影响脂肪代谢，有效调节血脂。豆豉作为一种发酵大豆制品，富含大豆异黄酮，但对其调节血脂功效的研究较少。

抑郁症是一种慢性精神障碍性疾病，其临床特征表现为显著而持久的情感低落、意志活动抑制、思维迟缓及认知功能减退等，严重影响患者正常工作生活。其发病率逐年上升，预计到2020年将成为世界第二大疾病。抑郁症在中医中属于“郁症”范畴，心烦、胸闷及失眠等均属于郁症所表现的症状。中医临床上豆豉具有“除烦”功效，与其他中药配伍，可用于治疗郁症，如经典中药复方中的栀子豉汤、小补心汤，但对于豆豉的抗抑郁作用却鲜有报道。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种豆豉，该豆豉是以黑豆为原料，经复合菌种发酵制备而得，提高了豆豉的保健功效，该豆豉有助于调节血脂，安神除烦，缓解抑郁症状。

为实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：

一种具有降血脂及安神除烦功效的豆豉的制备方法，由如下步骤制成：

a.挑选：选择充分成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆；

b.发芽：将黑豆用清水冲洗干净后加入2-5倍质量的清水浸泡12-24h，取出黑豆沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔4-8h后再次润湿纱布，36-72h后可得发芽黑豆；

c.蒸煮灭菌：121℃高压灭菌蒸煮15min，冷却至35℃以下接种；

d.菌种的活化：将中国根霉du-106(保藏号为gdmccno:60888)和酿酒酵母分别接种1～2环于斜面活化培养基中，分别于28℃-32℃培养48h-72h；

e.发酵种子液的制备：挑取培养好的中国根霉du-106菌丝1-2环到扩大培养液体培养基中，28℃-32℃震荡培养48h-72h，制得中国根霉du-106种子液；挑取培养好的酿酒酵母1-2环到扩大培养液体培养基中，28℃-32℃震荡培养48h-72h，制得酿酒酵母种子液；称取乳酸芽孢杆菌du-106加入到乳酸菌增殖液体培养基中，35℃-37℃培养12-24h，制得乳酸芽孢杆菌du-106种子液。

f.接种发酵：将中国根霉du-106按照接种量为5％-15％(v/w)、乳酸芽孢杆菌du-106按照接种量为0.5％-1％(v/w)和酿酒酵母按照接种量为0.5％-1％(v/w)，三种菌同时或分批先后接种到蒸煮冷却后的发芽黑豆中，在20℃-35℃培养10-15d，得到豆豉；

g.干燥：采用热泵干燥法对豆豉进行干燥，设置为预干燥20℃-50℃，4-8h；后干燥20℃-50℃，2-4h，最终使产品的水分控制在低于8.0％。

上述中国根霉(rhizopusmicrosporusvar.chinensis)du-106，该菌株于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60888，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。

本发明以从南方小药酒及其酒曲中筛选得的根霉菌为出发菌株，经过超高压诱变后，样品涂布于酪蛋白平板初筛，挑选透明圈直径与菌落直径比值大的菌株，在蛋白胨麸皮水中发酵，再经过纤维蛋白平板法复筛，通过比较溶解圈的直径大小筛选一株具有高效溶栓活性的菌株，命名为中国根霉du-106。

本发明对上述中国根霉du-106进行菌落形态的观察，初步鉴定出中国根霉du-106属于毛霉科，根霉属。经18srrna检测分析，中国根霉du-106与小孢根霉(rhizopusmicrosporus)相似度最高，为100％，经its检测分析，中国根霉du-106与小孢根霉(rhizopusmicrosporus)相似度最高，为100％，结合生理生化特征，鉴定其为小孢根霉菌。

本发明所获得的中国根霉du-106，在麸皮蛋白胨培养基中可以产生高活性溶栓酶，将其运用于淡豆豉的发酵，可制备一种具有溶血栓功效淡豆豉粉。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明利用高脂大鼠模型和抑郁大鼠模型，评价本发明所述豆豉的功效。结果表明，本发明所述的豆豉可以明显降低高脂大鼠tg、tc、ldl-c的含量，具有降血脂作用。本发明所述的豆豉可以改善crs模型抑郁大鼠体重增加缓慢、糖水消耗程度降低的现象，缓解抑郁大鼠应激后的绝望程度，具有安神除烦作用。

附图说明

图1为中国根霉du-106的18srrna系统发育树；

图2为中国根霉du-106的its系统发育树。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、达成目的与功效易于理解，以下结合具体实施例对本发明进行进一步描述。

实施例1：中国根霉du-106菌株的诱变与筛选

1.1培养基的制备

斜面培养基：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然，121℃灭菌15min。

酪蛋白培养基(初筛培养基)：取20ml0.1mna2hp04溶液，2ml0.1mkh2p04溶液，添加0.4％酪蛋白，4g琼脂，178ml水，ph值7.2，121℃高压灭菌30min。麸皮蛋白胨培养基：取5g麸皮加入100ml的水，浸泡1小时，煮沸1小时，取汁，补水至100ml，再加1g蛋白胨，121℃高压灭菌15min。

纤维蛋白平板(复筛培养基)：称取nacl8g，kcl0.2g，na2hpo4·12h2o3.63g，kh2po40.24g，溶于900ml蒸馏水中，用盐酸调ph值至7.4，加蒸馏水定容至1l，制得pbs缓冲液，常温保存备用。取25mg牛纤维蛋白溶于10mlpbs溶液中，制得牛纤维蛋白溶液。取0.3g琼脂糖溶于20mlpbs溶液中，使用微波炉加热至其刚刚沸腾溶解，摇匀，制得1.5％的琼脂糖溶液，放在45℃水浴锅中备用。在平板中加入12μl的凝血酶溶液(100u/ml)，再加入5ml牛纤维蛋白溶液，轻轻转动平板使两种溶液混匀，混匀后立刻用移液枪加入5ml1.5％的琼脂糖溶液，继续转动平板混合均匀，直至平板成凝固状，停止转动，室温静置4h以上。

1.2菌株诱变及筛选

样品采集于南方小药酒及其酒曲，取适量样品于盛有100ml无菌生理盐水的三角瓶中稀释，将上述样品涂布于灭过菌的斜面培养基，37℃培养24h。培养后用无菌生理盐水将斜面上的孢子洗离，制得孢子悬液，浓度为1×10⁶个/ml。

取4ml菌悬液分装于无菌袋中，排尽袋中空气并封口后，置于250mpa超高压诱变处理5min。超高压仪器型号：uhp900-2×2(ⅱ)。

吸取诱变后的孢子悬液200μl涂布酪蛋白平板，37℃培养24h，挑选透明圈直径与菌落直径比值大的进行多次重复划线，分离纯化菌株，直至为单菌落。

把酪蛋白平板初筛得的菌株接种到在麸皮蛋白胨培养基中，30℃，165r/min振荡培养48h，发酵液离心。用打孔器在纤维蛋白上均匀打孔，每孔直径6毫米，取发酵上清液10μl点滴于小孔中，37℃培养18h，通过比较溶解圈的直径大小筛选高产溶栓酶的菌株。并将其命名为中国根霉du-106。

实施例2：菌株鉴定

2.1形态观察

将筛选得的菌种在酪蛋白培养基上的培养特征的观察，中国根霉du106气生菌丝强，呈蜘蛛网状，产孢子能力强，孢子数多，生长速度快，孢囊抱子较小。

将菌株以上形态及培养特征与《真菌分类学》中鉴定相关内容进行对照，初步鉴定，中国根霉du106属于毛霉科，根霉属。

2.2分子鉴定

按照真菌基因组dna提取试剂盒的说明对中国根霉du-106菌株的dna进行提取，对提取的细菌dna进行pcr，pcr扩增后的序列，由广州艾基生物技术有限公司进行测序，获得完整的18srrna基因序列及its序列，将测序所得的序列结果于ncbi中genbank数据库进行blast比对，采用mega6构建进化树。结果如图1和图2所示。

综合18srna和its序列测序结果，中国根霉du-106与rhizopusmicrosporus相似度最高，因此其在分类学上应属于rhizopus属，rhizopusmicrosporus种，中文名：小孢根霉。建议英文文章中翻译为：rhizopusmicrosporusvar.chinensisdu-106.

综合形态特点及分子生物学鉴定结果，鉴定菌株为小孢根霉(rhizopusmicrosporus)的1个新种，命名为，于2019年11月6日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为gdmccno:60888。

实施例3：一种具有降血脂及安神除烦功效的豆豉的制备方法

a.挑选：挑选充分成熟，颗粒饱满均匀、无虫蚀、无霉烂变质的黑豆。

b.发芽：取500g黑豆以清水冲洗干净，加入2倍质量清水浸泡12h，取出黑豆沥干，平铺于泡沫箱中，盖上经润湿后的纱布，避光放置，每隔6h后再次润湿纱布，48h后可得发芽黑豆。

c.蒸煮灭菌：121℃高压灭菌蒸煮15min，冷却至35℃以下接种。

d.菌种的活化：将中国根霉du-106和酿酒酵母分别接种1～2环于斜面活化(pda)培养基中，分别于32℃和28℃培养48h。

e.发酵种子液的制备：挑取培养好的中国根霉du-106菌丝1-2环到扩大培养液体培养基中，32℃震荡培养48h，制得中国根霉du-106种子液。挑取培养好的酿酒酵母1-2环到扩大培养液体培养基中，28℃恒温培养48h，制得酿酒酵母种子液。称取0.1g的乳酸芽孢杆菌du-106(保藏编号为gdmccno：60621，记载于公开号为cn109943510a的中国发明专利中)加入到100ml乳酸菌增殖液体培养基中，37℃培养24h，制得乳酸芽孢杆菌du-106种子液。

所述的培养基制备方法如下：

扩大培养液体培养基：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，ph自然，121℃高压灭菌15min。乳酸菌增殖培养基：葡萄糖5g，蛋白栋5g，酵母提取物1g，氯化钙0.1g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph6.5，115℃灭菌20min。

f.接种发酵：先将中国根霉du-106(接种量为15％(v/w))接种到蒸煮冷却后的发芽黑豆中，在28℃培养3d；再将乳酸芽孢杆菌du-106(接种量为1％(v/w))和酿酒酵母(接种量为1％(v/w))接种到发芽黑豆中，在30℃培养7d，得到豆豉。

g.干燥：采用热泵干燥法对豆豉进行干燥，机器型号：ddc06tsl，参数设置为预干燥30℃，8h；后干燥30℃，2h。最终使产品的水分控制在低于8.0％。

步骤d中所述的培养基制备方法：菌种活化斜面培养基(pda斜面培养基)：新鲜马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，蒸馏水1000ml，ph自然，121℃灭菌15min。

实施例4降血脂活性评价

2.1实验动物

spf级雄性sd大鼠50只，体重180g-220g，由广东省医学实验动物中心提供。

2.2实验方法

spf级雄性sd大鼠，50只，体重180g-220g。购买后适应环境7天。将检疫后合格的sd大鼠按体重随机分为5组，每组10只。空白对照组大鼠给予正常饲料喂养，高脂模型组及各实验组大鼠给予高脂饲料喂养。豆豉低剂量组(doc-l)及高剂量组(doc-h)灌胃豆豉的剂量分别为830mg/kgbw、1660mg/kgbw，药物组灌胃1000mg/kgbw的辛伐他丁，空白对照组及高脂模型组同时灌胃相应剂量的生理盐水。灌胃周期均8周。实验期未，空腹12h，5％戊巴比妥钠麻醉后，采集大鼠的血液标本，测定血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)等指标，均采用试剂盒测定。

2.3检测指标评价

大鼠血清总胆固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白(hdl-c)、低密度脂蛋白胆固醇(ldl-c)测定结果如表1所示。

表1大鼠血清中tc、tg、ldl-c、hdl-c的含量(mmol/l)

注：与空白对照组比较**p<0.01*p<0.05；与高脂模型组比较##p<0.01#p<0.05

由表1可知，与空白对照组相比，高脂组大鼠tc含量极显著增高(p<0.01)，tg含量显著增高(p<0.05)，ldl-c含量极显著增高(p<0.01)，hdl-c含量显著降低(p<0.05)；表明大鼠高脂血症模型成功建立，其主要特征为大鼠tc、tg水平明显升高。

与高脂模型组相比，doc-l组和doc-h组的tc、tg水平均显著降低(p<0.01)。在降低tc水平方面，doc-l组和doc-h组均优于药物组；在降低tg水平方面，doc-l组tg含量降低水平更明显，与药物组接近。

在脂蛋白方面，doc-h组显著降低高脂大鼠的低密度脂蛋白(ldl-c)水平(p<0.05)，而doc-l组无显著差异(p>0.05)。已知ldl是人体血浆胆固醇的主要载体，ldl分子内的胆固醇通过受体机制运至细胞加以利用。当机体中ldl水平过高，过剩的胆固醇在细胞内及血管内皮细胞堆积，导致动脉硬化。降低ldl水平，有利于减少胆固醇在血管内的沉积，从而减少粥样硬化的发生率。此外，提高机体高密度脂蛋白(hdl-c)含量，可以促进胆固醇逆向转运可有效缓解高脂血症、防治动脉硬化发生。但本实施例中的豆豉对高脂模型大鼠血清中hdl-c含量没有显著影响。

综上，豆豉在剂量分别为830mg/kg、1660mg/kg下均可显著降低高脂模型大鼠的tc、tg水平(p<0.01)，且高剂量的豆豉(1660mg/kg)还可以显著降低高脂模型大鼠ldl-c含量(p<0.05)。说明豆豉可以明显降低高脂大鼠tg、tc、ldl-c的含量，具有一定的降血脂作用。

实施例5安神除烦活性评价

本实施例运用抑郁动物模型来评价豆豉安神除烦功效，通过慢性束缚刺激方法(chronicrestraintstresscrs)建立抑郁动物模型。

3.1实验动物

spf级雄性sd大鼠30只，体重180g-220g，由广东省医学实验动物中心提供。

3.2实验方法

正式试验开始前，30只spf级sd大鼠适应性饲养15天(12h昼/夜，温度25±1℃，湿度55-65％)，在此期间进行1％的糖水消耗训练。15天后，将其随机分为3组：健康对照组(hc)、豆豉组(doc)和crs模型组。除hc组外的所有大鼠进行crs(慢性束缚应激)刺激三周，抑郁建模结束时对各组大鼠进行糖水消耗实验及抑郁行为学测试(迫游泳实验、明暗穿梭实验)。

造模后doc组灌胃豆豉剂量为8330mg/kgbw，crs模型组灌胃0.3ml生理盐水，灌胃时间4周，期间doc组及crs模型组同时也进行crs刺激。健康对照组，整个实验过程不做任何药物干预，自由摄取水和食物。灌胃结束后，对各组大鼠进行糖水消耗实验及抑郁行为学测试。实验全过程中每隔一周记录各组大鼠体重。

3.3活性评价

3.3.1体重

实验大鼠体重变化如表2，应激前，各组大鼠体重无显著差异(p>0.05)。随着应激时间的增长，与hc组对比，应激后的大鼠体重增长缓慢；应激3周后，与hc组对比，crs模型组和doc组的体重均显著降低(p<0.05)，且crs模型组与doc组无显著差异，表明经crs刺激后大鼠体重增加缓慢。

灌胃结束后，与crs模型组相比，doc组大鼠体重显著增高(p<0.05)，说明实施例3制备得的豆豉可改善crs模型大鼠体重增加缓慢的现象。

表2各组大鼠体重变化(g，n＝8)

注：与空白对照组比较**p<0.01*p<0.05；与crs模型组比较##p<0.01#p<0.05

3.3.2糖水偏好

应激前，各组大鼠糖水偏好程度无显著差异(p>0.05)。应激3周后，对比hc组，crs模型组和doc组大鼠的糖水偏好程度均显著降低(p<0.05)，说明crs刺激使大鼠糖水消耗程度降低，快感缺失程度明显。灌胃4周后，与crs模型组相比，doc组大鼠的糖水偏好程度显著增加(p<0.05)，说明实施例3制备得的豆豉可改善crs模型大鼠糖水消耗程度降低的现象。

表3各组大鼠糖水偏好程度变化(g，n＝8)

注：与空白对照组比较*p<0.05；与crs模型组比较#p<0.05

3.3.3抑郁行为学测试

大鼠强迫游泳实验及明暗穿梭实验结果如表4所示。大鼠强迫游泳实验中，记录大鼠游泳5mim内不动的时间。应激3周后，对比hc组，crs模型组和doc组大鼠游泳不动时间均显著增加(p<0.05)，说明crs刺激使大鼠行为绝望程度增加。灌胃4周后，与crs模型组相比，doc组大鼠的游泳不动时间程度显著降低(p<0.05)，说明实施例3制备得的豆豉可改善crs模型大鼠应激后的绝望程度。而在明暗穿梭实验中，灌胃后doc组和crs模型组大鼠在暗处所处时间无显著差别。大鼠抑郁行为学测试说明，说明实施例3制备得的豆豉可改善大鼠抑郁症状。

表4大鼠行为学测试中游泳不动时间及暗处所处时间的变化(min，n＝8)

注：与空白对照组比较**p<0.01*p<0.05；与crs模型组比较#p<0.05

综上，实施例3制备得的豆豉(830mg/kg)可改善crs模型抑郁大鼠体重增加缓慢、糖水消耗程度降低的现象，缓解抑郁大鼠应激后的绝望程度，可改善其抑郁症状，具有安神除烦作用。

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