一种核桃多肽营养液及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种多肽营养液，具体涉及一种核桃多肽营养液及其制备方法和应用。

背景技术：

国内外为了解决心血疾病这方面的难题，做出了较多的研究与努力，抗血栓药物方面的研究和开发迅猛发展，大量的药物不断涌现在市场中，为血栓这一疾病的预防和治疗提供了扎实的基础。张彬在对水蛭素的研究中发现经丙酮浸提过后的吸血蛭素抗凝血酶活性大于非吸血蛭素与未浸提过的吸血蛭素。而钟山首次从宽体金线蛭中分离纯化出国内第一个抗凝血多肽，名为“蚂蟥多肽”。qianz.y发现来自绵羊中的k-酪蛋白的糖肽可以随着量的增加而加强减少血小板聚集的能力。苗艳丽等人利用复合酶解法制备新鲜水牛奶的水解液，随后测定其抗凝血活性最高可达52.0atu/ml。现有的研究大多以吸血动物来源的抗凝血多肽为主，而在植物来源的抗凝血多肽鲜少有见报道，怎样拓展新的抗凝血多肽来源及植物源的抗凝血多肽活性有无更大的优势还需要进一步深入的研究。

核桃含有丰富的营养成分基质如蛋白质、脂肪、碳水化合物、维生素和矿物质以及其他活性成分，核桃及其副产物的利用研究一直是当代的热点之一，现如今对于核桃榨油后的核桃粕用于饲料、肥料，甚至是直接丢弃，导致利用率仍旧很低，怎样提高核桃的食源性利用价值和副产物的增值回收是亟待解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种核桃多肽营养液及其制备方法和应用，解决了核桃粕利用率低的问题，对脱脂核桃粕进行处理，利用核桃多肽粉获得多肽营养液，具有抗凝血酶活性和抗氧化活性。

为了达到上述目的，本发明提供了一种核桃多肽营养液，该核桃多肽营养液包含：核桃多肽粉、核桃香精、柠檬酸、木糖醇和水，其中，所述核桃多肽粉、核桃香精、柠檬酸和木糖醇与水的料液比为5％，所述核桃香精的添加量为0.08％，所述柠檬酸的添加量为0.12％，所述木糖醇的添加量为9％；所述核桃多肽粉包含以下多肽序列：如seqidno.1-16所示的氨基酸序列。

优选地，所述核桃多肽粉是通过将核桃蛋白经碱性蛋白酶酶解获得的；所述酶解，碱性蛋白酶的浓度为2％，酶解温度为50℃，ph为7。

优选地，所述核桃蛋白是通过将脱脂核桃粕的水溶液在ph8～9，55℃水浴搅拌后离心得到上清液，将上清液在ph4～5搅拌后离心得到的沉淀调节ph至中性，再经干燥而获得的。

本发明的另一目的是提供一种所述的核桃多肽营养液的制备方法，将核桃多肽粉和核桃香精、柠檬酸、木糖醇于水中混合均勾，灌装后在115℃、0.1mpa条件下杀菌，待杀菌完成后冷却，获得核桃多肽营养液。

优选地，所述核桃多肽粉的制备，包含：将核桃采用亚临界丁烷萃取核桃油，得到脱脂核桃粕；将脱脂核桃粕分散在水中，用调节ph为8～9，55℃水浴搅拌，8000r/min低温离心，保留上清液；将所述上清液ph调节为4～5，搅拌，8000r/min低温离心，沉淀ph调节至中性，冷冻干燥，得到核桃蛋白；将所述核桃蛋白加水配置成蛋白溶液，调至ph为7，加入碱性蛋白酶使其浓度为2％，在50℃温度下水解，期间维持ph为7，酶解结束后灭酶终止反应，在8000r/min低温离心，保留上清液；所述低温离心的温度为3～5℃，避免温度过高会导致蛋白质变性。

本发明的另一目的是提供一种所述的核桃多肽营养液的应用，该核桃多肽营养液具有抗氧化活性与抗凝血酶活性。

本发明的核桃多肽营养液及其制备方法和应用，解决了核桃粕利用率低的问题，具有以下优点：

本发明的核桃多肽营养液，通过将脱脂核桃蛋白粕经碱性蛋白酶处理，得到高活性抗氧化与抗凝血酶多肽的核桃多肽粉，通过与核桃香精、柠檬酸和木糖醇的合理搭配，获得的核桃多肽营养液感官评分高。

附图说明

图1为本发明对比例1-5的感官得分结果。

图2为本发明对比例6-10的感官得分结果。

图3为本发明对比例11-15的感官得分结果。

图4为本发明对比例16-20的感官得分结果。

图5为本发明核桃香精和料液比相互作用的等高线。

图6为本发明柠檬酸和料液比相互作用的等高线。

图7为本发明木糖醇和料液比相互作用的等高线。

图8为本发明柠檬酸和核桃香精相互作用的等高线。

图9为本发明木糖醇和核桃香精相互作用的等高线。

图10为本发明木糖醇和柠檬酸相互作用的等高线。

图11为本发明葡聚糖凝胶色谱结果。

图12为本发明肽段经色谱分离的色谱图。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种核桃多肽营养液的制备方法，该方法包含：

将核桃多肽粉和核桃香精、柠檬酸、木糖醇于水中混合均勾，灌装后在115℃、0.1mpa条件下杀菌15min，待杀菌完成后冷却，获得核桃多肽营养液。

其中，料液比5％(核桃多肽粉与水的体积比)，核桃香精添加量0.08％(核桃香精占核桃多肽营养液的质量百分比)，柠檬酸添加量0.12％(柠檬酸占核桃多肽营养液的质量百分比)，木糖醇添加量9％(木糖醇占核桃多肽营养液的质量百分比)。

其中，核桃多肽粉的制备，具体如下：

首先，将新鲜核桃在55℃干燥后粉碎，采用亚临界丁烷萃取核桃油，重复萃取三次，直至核桃油完全萃出，得到脱脂核桃粕。放置4℃下低温冷藏备用；

其次，将烘干的脱脂核桃粕按一定的的料液比分散在蒸馏水中，配制成质量分数为5％的核桃蛋白溶液，用1mol/lnaoh溶液调节至ph＝8.5，55℃水浴搅拌2h，8000r/min低温离心(3～5℃)20min，弃去油层以及沉淀，保留上清液；

然后，将上清液用1mol/lhcl溶液调节ph＝4.5，搅拌1h，8000r/min低温离心20min，沉淀用蒸馏水水洗至中性，调节ph至中性后冷冻干燥24h，得到核桃蛋白；

最后，将核桃蛋白加蒸馏水配置成蛋白溶液，于水浴锅中一定温度和时间预处理后，调至ph为7，加入碱性蛋白酶使其浓度为2％，在50℃温度下水解4h，期间用1.0mol/l的naoh维持ph，酶解结束后放置于90℃水浴锅10min灭酶终止反应，在8000r/min低温离心20min，对沉淀进行干燥，烘干机60℃烘干2h。对核桃多肽分离，先采用大孔吸附树脂分离，再经超滤获得分子质量小于3kd的水解产物，最后经葡聚糖凝胶色谱分离分子质量小于3kd的水解产物，得到抗凝血酶活性与抗氧化活性最强的组分a，组分a为核桃多肽营养液中采用的核桃多肽粉。核桃多肽粉包含以下多肽序列：如seqidno.1-16所示的氨基酸序列。

在不同酶解条件下，碱性蛋白酶的水解度不同，在本发明的酶解条件下水解度最好。

对比例1-5

一种核桃多肽营养液的制备方法，与实施例1的基本相同，区别在于：添加量为0.08％、柠檬酸(食用级，购自厦门南雀科技有限公司)添加量为0.12％、木糖醇(食用级，购自厦门南雀科技有限公司)添加量为8％时，对比例1-4的料液比分别为5％、10％、15％、20％、25％。

对比例6-10

一种核桃多肽营养液的制备方法，与实施例1的基本相同，区别在于：在料液比为10％、柠檬酸添加量为0.12％、木糖醇添加量为8％时，对比例6-10的核桃香精添加量分别为0、0.04％、0.08％、0.12％、0.16％。

对比例11-15

一种核桃多肽营养液的制备方法，与实施例1的基本相同，区别在于：在料液比为10％、核桃香精添加量为0.08％、木糖醇添加量为8％时，对比例11-15的柠檬酸添加量分别为0.04％、0.08％、0.12％、0.16％、0.2％。

对比例16-20

一种核桃多肽营养液的制备方法，与实施例1的基本相同，区别在于：在料液比为10％、核桃香精添加量为0.08％、柠檬酸添加量为0.12％时，对比例16-20的木糖醇添加量分别为2％、4％、6％、8％、10％。

对比例21-22

一种核桃多肽营养液的制备方法，与实施例1的基本相同，区别在于：在核桃多肽粉制备时，对比例21-22分别采用木瓜蛋白酶和胰蛋白酶进行酶解，得到的核桃多肽粉中的水解度和核桃多肽含量均低于实施例1，其中，实施例1的碱性蛋白酶的水解度dh为19.56％，多肽含量为1.210mg/ml；木瓜蛋白酶的水解度dh为9.24％，多肽含量为0.812mg/ml；胰蛋白酶的水解度dh为11.70％，多肽含量为0.936mg/ml。

实验例1感官评价实验

对本发明实施例1和对比例1-19的核桃多肽营养液进行感官评价实验，具体如下：

试验涉及到的核桃多肽营养液感官指标参考中华人民共和国植物蛋白饮料核桃露(乳)标准(gb/t31325-2014)进行，对核桃色泽、滋味及气味、甜度以及组织状态进行评价，具体评价得分标准如表1。

而且，以料液比(a)、核桃香精添加量(b)、柠檬酸添加量(c)、木糖醇添加量(d)为自变量，以配比之后所得感官得分为目标函数值，建立对应函数关系。拟合方程为：

y＝78-6.83a-11.67b+3.25c-4.75d+18.25ab+15.75ac+12.50ad+3.75bc+1.50bd-14.75cd-17.42a²-7.92b²-10.04c²-8.29d²

上述拟合方程的r²＝0.9173，且该模型显著值都小于0.0001，表明线性关系表现优良，拟合度良好。

表1核桃乳感官评价得分标准

如图1所示，为本发明对比例1-5的感官得分结果，由图可知，对比例1-5随着料液比的增加，感官得分增加，但料液比大于10％后，感官得分又降低，以10％时感官得分最高，为83分。

如图2所示，为本发明对比例6-10的感官得分结果，由图可知，对比例6-10随着核桃香精添加量的增加，感官得分增加，但核桃香精添加量大于0.08％时，感官得分又降低，以0.08％时感官得分最高，为86分。

如图3所示，为本发明对比例11-15的感官得分结果，由图可知，对比例11-15随着柠檬酸添加量的增加，感官得分增加，但柠檬酸添加量大于0.12％时，感官得分又降低，以0.12％时感官得分最高，为85分。

如图4所示，为本发明对比例16-20的感官得分结果，由图可知，对比例16-20随着木糖醇添加量的增加，感官得分增加，但木糖醇添加量大于8％时，感官得分又降低，以8％时感官得分最高，为68分。

如图5-10所示，根据等高线的位点不同可判断交互作用是否显著，等高线呈椭圆形则说明交互作用显著，并随着椭圆长半轴变长交互越显著，而圆形则表示交互不显著。从图可知，料液比与核桃香精添加量对营养液感官得分影响交互作用显著，随着料液比与香精添加量的增加，感官得分呈现先上升后下滑的趋势；料液比与柠檬酸添加量交互作用对营养液感官得分影响显著，当料液比数值过大和柠檬酸添加量过高之后，口感反而会适得其反。当各成分配比为实施例1中添加量时，感官得分最高，为89.42。

实验例2测定指标

1、实施例1中多肽含量的测定

(1)标准曲线的测定

准确量取用5％tca(三氯乙酸)配制的0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4mg/mlgly-gly-tyr-arg四肽标准溶液于6支10ml容量瓶中，加水补至刻度线，取上述溶液各6ml，然后加入双缩脲试剂4ml，充分震荡摇匀后，室温孵育0.5h，3000r/min离心5min，于540nm处进行吸光值测定。用第一支空白蛋白质溶液作为对照液。以蛋白质浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

(2)实施例1核桃多肽营养液的测定

准确量取实施例1核桃多肽营养液2.5ml，加入相同量的10％tca水溶液，充分震荡均匀，室温孵育10min，然后在3000r/min下离心15min，将上清液用5％tca水溶液定容至50ml容量瓶中，充分震荡摇匀，然后在一定酶解条件下酶解后，结果对照标准曲线求得样品溶液中的多肽含量(mg/ml)，结果如下表2。

2、脂肪含量测定

按照gb/t5009.6-2003规定的“第二法酸水解法”测定实施例1核桃多肽营养液的脂肪含量，结果如下表2。

3、大肠菌落、致病菌、霉菌和酵母菌测定

按照gb/t4789.21-2008规定测定实施例1核桃多肽营养液的大肠菌落、致病菌、霉菌和酵母菌，结果如下表2。

表2为本发明实施例1核桃多肽营养液的多肽、脂肪和菌含量测定结果

实验例3核桃多肽肽段分析

1、核桃多肽分离

(1)大孔吸附树脂分离：将da201-cⅱ型号的大孔吸附树脂采用95％乙醇24h浸泡，然后用去离子水冲洗数次直至溶液清澈无浑浊，再以湿法装柱，分别用70％、30％乙醇浸泡和冲洗树脂，接着加入三倍乙醇体积并要求无白色浑浊现象，最后用去离子水充分冲洗至无乙醇味。接着，用5％hcl溶液通过树脂层，并保持冲洗4h，随后用去离子水以2ml/min流速洗至中性。再用5％naoh溶液通过树脂层，重复上述操作，完成后储存备用。将预处理搅拌均匀的黏糊状树脂匀速且一次性加入层析柱中，使层析柱中无气泡，无缝隙，底部活塞处于开启状态，使水缓慢从底部流出。

当液面降至与吸附树脂的面齐平时，开始进样，蛋白质水解液以2ml/min的流速通过交换柱，树脂层中无气泡，开始洗脱，收集流出液体，于220nm处测定其吸光值，待洗脱达到动态吸附饱和终点时即停止洗脱，以1ml/min流速75％乙醇解吸。根据即测定吸光值保留所需物质，真空冷冻干燥24h，冷藏备用。

(2)超滤：将经过大孔吸附树脂的核桃蛋白水解产物用超滤离心管进行超滤处理，分别采用膜分子截流分子质量为10kd和3kd的超滤膜网进行分离，得到大于10kd(a’3)、3～10kd(a’2)、小于3kd(a’1)的3种分子质量的水解产物，分别收集，测定其抗凝血酶活性与抗氧化活性；

(3)葡聚糖凝胶色谱法：准确称取型号sephadexg-25的凝胶4.5g，置于烧杯中，倒入去离子水中，水浴微沸1-2h，丢弃漂浮在上层的凝胶颗粒，将溶胀完全的树脂经超声处理30min去除气泡。待凝胶冷却后静置12h，匀速倒入垂直于地面放置的凝胶柱中，将装好的柱放置在4℃层析柜中。将柱的顶部与泵相连，将柱的下端与检测器相连，用0.02m，ph＝6.8磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液将超滤得到的抗凝血酶活性最强组分a1配成30mg/ml溶液，过0.22μm滤膜，采用sephadexg-25葡聚糖凝胶柱(1.6cm×30cm)进行分离，上样量3ml，以蒸馏水为洗脱液，洗脱流速0.5ml/min，于220nm波长处检测，每3min收集一管组分，得到峰面积不同的三个峰(参见图11)，将收集的三个峰的组分从左到右分为a、b、c，将其冻干，评价其抗氧化活性与抗凝血酶活性，测定抗凝血酶活性与抗氧化活性。

2、抗凝血酶活性测定

将纤维蛋白原溶液与凝血酶溶液均用0.154mol/lnacl配制。首先，设定酶标仪目标温度为37℃，测定波长在405nm。选定酶标板上目标小井，在小井中依次加入40μl的tris-hcl缓冲溶液和140μl的1mg/ml(w/v)纤维蛋白原溶液，充分振荡混合均匀，室温孵育10min。随后，加入10μl凝血酶溶液(12u/ml)，充分混合均匀，测定吸光度。测定样品时，用40μl样品溶液代替tris-hcl缓冲溶液。空白对照采用tris-hcl缓冲溶液代替凝血酶溶液。所得数据按照以下公式进行计算。

式中，y为水解物抑制率；ai为加有抑制物的吸光值；ae为未加抑制物的吸光值；ao为空白吸光度。

3、总抗氧化活性测定

(1)dpph自由基清除率

准备0.1mmol/ldpph-无水乙醇溶液，无光照环境下保存。准确量取1ml待测溶液以及1mldpph溶液于同一试管中，振荡均匀后暗黑环境中保育30min。在517nm处测定吸光度为a1。以加入1ml蒸馏水作为空白对照在517nm处测定其吸光值为a2，以vc作为标曲的制备。其计算公式如下：

式中，a1为待测样液与dpph溶液吸光值；a2为蒸馏水与dpph混合液的吸光值。

dpph自由基清除结果：随着多肽浓度增加，对dpph自由基的清除能力越强。在浓度为0.0-1.0mg/ml的浓度范围内，a’1(＜3kda)、a’2(3～10kda)、a’3(＞10kda)组分对dpph自由基的清除活性呈直线上升趋势，而对vc的清除活性在0.4-1mg/ml范围内达到最大平台值，在较低浓度下清除率明显低于vc(抗坏血酸)，但随着浓度的增加，其间差距逐渐缩小。明显发现在浓度为1mg/ml时，a组分对于dpph自由基清除率为71.02％明显大于b、c组分，分别为26.78％、19.45％，表明小分子量核桃多肽具有猝灭dpph自由基的能力，其是一种具有清除自由基能力的抗氧化剂，而且不同分子量的核桃多肽的活性是显著不同的。

(2)羟自由基清除活性

取不同分子量多肽溶液1.0ml，加入2.0ml9mmfeso4、1.0ml9mm水杨酸和1.0ml9mmh2o2，振荡均匀，37℃环境保育30min，8000r/min离心10min。以蒸馏水作为对照，vc作为标曲的制备，510nm下测吸光值，其计算公式如下：

式中，a为加入相同体积的蒸馏水的吸光值；b为样品测定的吸光值。

羟自由基清除结果：核桃多肽对羟自由基有比较有利的清除作用，且都随着浓度的增加，清除率液逐渐增加。核桃多肽组分a的清除率在浓度为1mg/ml之后就和组分b、c拉开了较大的差距。但三组分对于vc来说还是比它弱了一些，说明核桃多肽液具有一定的抗氧化活性，并且分离出来的三组分中组分a效果最好。

(3)abts自由基清除能力的测定

加入蒸馏水配制7mmol/l的abts储备液和2.5mmol/l的过硫酸钾溶液，按1：1比例混合均匀，暗黑条件下静置保育12-16h，为abts储备液，稀释至其在734nm处吸光度为0.7±0.01。取稀释后的abts储备液1.0ml与1ml待测溶液混合，暗黑保育10min，于734nm处测定吸光度。用蒸馏水作为对照，用trolox-甲醇绘制标准曲线作为对照。按公式计算abts自由基的清除率：

式中，a为abts试剂与空白溶剂混合液的吸光值；b为abts试剂与样液混合液的吸光值。

abts自由基清除结果：葡聚糖凝胶分离出来的三组分对于abts自由基清除能力呈现一定的量效关系，随着多肽浓度的增加其清除率也呈现逐渐增加的趋势。组分a的abts自由基清除率不论在什么浓度下都高于组分b与组分c，并且随着浓度到5mg/ml时，其清除值与vc已经很靠近。虽然三种组分并未超过vc的清除能力，但是也说明其具有一定的abts自由基清除能力。

(4)fe²⁺螯合能力测定

配制100mmfeso4·7h2o并用蒸馏水稀释至0.15、0.3、0.6、0.9、1.2和1.5mm，每个梯度加入等体积0.5mltptz溶液、5.0ml醋酸-醋酸钠缓冲液(0.3mol/l，ph＝3.6)，振荡混合均匀，于593nm测定其吸光值。以不同浓度feso4溶液为横坐标，测定的吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

按照体积比为1：1：10＝(0.3mol/l，ph＝3.6)醋酸-醋酸钠溶液：20mmol/lfecl3：10mmol/ltptz配制frap工作液。取一定量多肽样品溶液加入4.5mlfrap工作液中，37℃稳定孵育20min，在593nm处检测其吸光度a1，用蒸馏水代替样品作为对照测定其吸光度为a0。vc作为对照标曲的制备，对应标准曲线找出a1-a0差值对应的feso4溶液浓度。

fe²⁺螯合能力结果：葡聚糖凝胶分离出来的三组分在fe²⁺螯合能力上，随着多肽浓度的增加其清除率也呈现逐渐增加的趋势。组分a的fe²⁺螯合能力不论在什么浓度下都高于组分b与组分c，并且随着浓度到5mg/ml时，其清除值始终向vc靠近。虽然三种组分并未超过vc，但也说明其具有一定的fe²⁺螯合能力。

4、高活性多肽氨基酸含量及序列测定

对最终分离的高抗凝血酶活性与高抗氧化活性组分采用氨基酸自动分析仪测定其氨基酸组成与含量。

通过液相二级质谱(lc-ms/ms)对高活性组分的分子量及肽段序列进行了检测，并采用软件对该结果进行分析，其肽段得分越高则该肽在被检测物中存在的可能性就越大。色谱条件：缓冲液a液为0.1％甲酸水溶液，b液为0.1％甲酸乙腈水溶液(乙腈为84％)。色谱柱以95％的a液平衡。样品上样到色谱柱(2cm×100μm5μm-c18)，再经分析柱(75μm×100mm3μm-c18)分离，流速为300nl/min。相关液相梯度如下：2小时梯度：0-110min；b液线性梯度从0％-55％；110-115min，b液线性梯度从55-100％；115-120min；b液维持在100％。肽段经色谱分离后使用质谱仪进行质谱分析。

高活性多肽氨基酸含量结果：1-440nm用于检测有关脯氨酸，而1-570nm则用于检测脯氨酸以外的其他氨基酸，经分析可知，检测成分中无杂质干扰，且出峰时间与出峰的形状比较匹配，说明检测分离结果良好。本发明的核桃多肽中氨基酸含量位居第一的为谷氨酸，紧跟其后的则是精氨酸与天门冬氨基酸，其含量分别为17.9g/100g、10.97g/100g、8.44g/100g。

高活性多肽的序列测定结果：采用lc-ms-ms对上述层析出来的高抗凝血酶活性与高体外抗氧化活性的核桃多肽进行三次重复平行多肽肽段分析。将三次平行核桃多肽样品经过lc-ms-ms检测后会形成特定的峰形即核桃多肽质谱分析basepeak图谱如图12。然后将结果在uniprot_juglans_regia蛋白库里进行模拟蛋白酶水解，再通过pd-mascot查库分析软件进行分析，匹配对应来源蛋白质。将图形与蛋白库中输出的结果相分析，筛选出多肽得分高于二十分的16条多肽(如表3)，肽段得分越高说明其活性越强。

表3高抗凝血酶活性多肽序列及分子量

尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。

序列表

<110>西华大学

<120>一种核桃多肽营养液及其制备方法和应用

<160>16

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