一种甘薯茎叶多酚及其提取方法与流程

本发明涉及一种甘薯茎叶多酚及其提取方法。

背景技术：

甘薯(ipomoeabatataslam.)为旋花科(convolvulaceae)一年或多年蔓生草本植物，又称红薯、番薯、白薯、山芋、红芋、地瓜、红苕等。

甘薯茎叶是甘薯生产的主要副产品，一年可收获3-4次，其产量几乎与地下部分相同。甘薯茎叶富含多种营养素，可直接作为新鲜蔬菜食用，还可以作为食品工业的原料加工成各种甜点、饮料、固体饮料和功能性食品。目前，只有少量的甘薯茎叶被当作动物饲料，大部分甘薯茎叶被当作废弃物直接丢掉，造成资源的巨大浪费。甘薯茎叶中最主要的生物活性物质当数多酚类物质，含量丰富且具有较强的自由基清除活性、金属离子螯合活性、抗氧化、抗癌抗突变和抑菌等多种生理活性，广泛应用于日化、食品、药品等行业。

由于甘薯茎叶多酚类粗提物含有一些杂质，如不溶性固形物、糖和蛋白等，如何得到纯度较高的甘薯茎叶多酚成为本领域亟需解决的技术难题。并且，甘薯茎叶中多酚类物质包括酚酸类和黄酮类两种，单一组分的多酚类物质分子量从100-1000da不等，这一定程度上为甘薯茎叶多酚的提取增加了难度。

cn103393882a公开了一种甘薯茎叶多酚及其制备方法。该方法包括如下步骤：(1)采摘新鲜的甘薯茎叶，依次经洗净、干燥和粉碎后得到甘薯茎叶干粉；(2)用乙醇水溶液a对甘薯茎叶干粉进行超声浸提；经离心，收集上清液，去除乙醇得到甘薯茎叶多酚粗提液；(3)调整甘薯茎叶多酚粗提液的总酚浓度和ph值，然后泵入至大孔吸附树脂中；经吸附后，用水清洗所述大孔吸附树脂，然后用乙醇水溶液b对大孔吸附树脂进行解吸，收集解吸液，去除乙醇即得。上述方法存在如下缺陷：①有机残留物高，预处理难度大；②强度差，使用过程中破碎严重，使用寿命短；③粒径分布广，分离效果差；④同一生产企业生产的同一型号树脂，各批之间比表面积和功能基团含量差别大，在多酚类物质纯化中重现性差。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

针对现有技术存在的不足，本发明提出了一种甘薯茎叶多酚的提取方法，以及该方法所得的甘薯茎叶多酚。

作为本发明的第一目的，提供了一种甘薯茎叶多酚的提取方法，以明显提升甘薯茎叶多酚的质量。

具体而言，本发明所提供的提取方法以乙醇水溶液对甘薯茎叶干粉进行超声浸提；所得提取液经离心分离后取上清液；以及，所述方法还包括：将所述上清液依次经过孔径为0.22-1.2μm的微滤膜、截留分子量为8-12kda的超滤膜、截留分子量为400-600da的纳滤膜。

本发明意外发现，将上清液依次经过孔径为0.22-1.2μm的微滤膜、截留分子量为8-12kda的超滤膜、截留分子量为400-600da的纳滤膜后，可将生物活性较强的多酚部分进行浓缩富集，进而提高其附加值。

作为本发明的较佳技术方案，将所述上清液依次经过孔径为0.45μm的微滤膜、截留分子量为10kda的超滤膜、截留分子量为400-600da的纳滤膜。

作为优选，当所述超滤膜的操作压力为0.1-0.15mpa(尤其是0.1mpa)时，有利于去除上清液中的果胶和蛋白等大分子物质。

作为优选，当所述纳滤膜的操作压力为0.2-0.6mpa(尤其是0.3mpa)时，有利于富集生物活性较强的甘薯茎叶多酚。

作为优选，所述甘薯茎叶干粉的粒径为80～100目；

进一步地，所述甘薯茎叶干粉由包括如下步骤的方法制得：将甘薯茎叶依次经洗净、冷冻干燥、粉碎；

更进一步地，所述甘薯茎叶取自甘薯藤蔓顶端10～15cm的部位。

在上述技术方案中，所述甘薯茎叶最好为新鲜的甘薯茎叶，其采摘时期可为甘薯茎叶生长任一阶段，如薯块收获前期或收获时以降低对薯块产量的影响。

作为优选，所述乙醇水溶液的质量浓度为60～80％(尤其是70％)；

作为优选，所述甘薯茎叶干粉与所述乙醇水溶液的料液比为1g：10～30ml；其中，1g：20ml尤为理想。

在上述技术方案中，选取上述乙醇水溶液与上述甘薯茎叶干粉按照上述料液比混合，才能够使二者充分混合接触，进而提升多酚物质的溶出。

作为优选，所述超声浸提的时间为20～50min；优选为30min；进一步地，控制超声的功率为450～500w。本发明发现，引入超声处理不单是大幅度缩短了浸泡时间，还能意外地明显改变甘薯茎叶干粉中活性成分的结合状态(主要是对细胞壁的理想干预)，促进多酚物质的充分溶出。

作为优选，所述离心在4000～7500r转速下进行10～15min，尤其是在7500r转速下进行10min；在上述条件下离心相关杂质能够更多地吸附在固形物上进而有利于后续纯化。

作为优选，所述方法还包括对所述离心后的残渣进行超声浸提1～3次的步骤，以最大程度确保多酚物质全部溶出。

本发明所提供的提取方法，工艺简单，提取效率高，活性成分的损失少，甘薯茎叶多酚的生物活性显著高于现有技术。

现有技术中，膜分离过程会造成膜污染的问题，导致膜通量下降、生产效率降低以及关键成分的损失等。基于此，本发明所述方法还包括清洗超滤膜和纳滤膜的步骤：

分别采用去离子水、0.08～0.12％hcl、0.08～0.12％naoh、去离子水依次清洗超滤膜和纳滤膜，直至流出液呈中性。

采用上述方式清洗超滤膜和纳滤膜，可使膜通量恢复到较高水平，克服了现有膜分离技术使用过程中的缺陷。

在上述技术方案中，第二次用去离子水清洗至流出的渗透液为中性，可用一次性ph试纸测定。

作为优选，首次去离子水的清洗时间为0.5-2h；优选为1h；

作为优选，0.08～0.12％hcl的清洗时间为0.5-2h；优选为1h；

作为优选，0.08～0.12％naoh的清洗时间为0.5-2h；优选为1h。

本发明中，上述清洗超滤膜和纳滤膜的方法，可单独使用。

作为本发明的第二目的，提供了一种甘薯茎叶多酚，其利用上述方法制得。

本发明的有益效果：

(1)本发明的提取方法操作简单，能耗较低，可实现规模化工业生产；

(2)该方法所用到的试剂、材料、仪器设备均是常见规格，生产成本低，且无毒环保；

(3)该方法所制得的甘薯茎叶多酚的抗氧化活性和抗紫外活性均较强，具有较高的商业应用开发价值。

(4)该方法所用设备清洗便捷，可长期循环使用。

附图说明

图1为实施例5中超滤/纳滤膜组件装置流程图；

图中：1、原料液槽；2、输液泵；3、压力表；4、超滤/纳滤组件；5、流量计；6、循环阀；7、浓液阀；8、流量计阀。

图2为实施例5中超滤和400-600da纳滤过程中膜通量的变化。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：超滤膜和纳滤膜对多酚的截留率

(1)原料的采集及预处理：于11月中旬采摘甘薯茎叶，采摘部位为藤蔓顶端10cm部位。将新鲜的甘薯茎叶洗净、沥干后，于-40℃冰箱里预冻24h，取出放入冷冻干燥机，干燥处理72小时后，采用万能粉碎机粉碎，制得甘薯茎叶干粉，作为以下实验原料；

(2)多酚的粗提取：称取步骤(1)中的甘薯茎叶干粉10g，按照料液比1：20加入70％的乙醇水溶液200ml，混匀，于超声波清洗机中超声浸提30min，提取后7500r离心10min，收集上清液，残渣重复提取两次，合并上清液，旋转蒸发去除乙醇后，得甘薯茎叶多酚粗提液；

(3)将甘薯茎叶多酚粗提液经过0.45μm有机系微滤膜之后得到超滤原液，体积为600ml；

(4)将步骤(3)中所得溶液经过10kda超滤膜至截留液体积为100ml，此时超滤渗透液的体积为500ml；操作压力为0.1mpa；

(5)将步骤(4)中超滤渗透液分别作为200-300da、400-600da、800-1000da纳滤原液，将纳滤截留液体积保留至100ml，此时纳滤渗透液体积为400ml；操作压力为0.3mpa。

(6)采用folin-ciocalteu比色法测定超滤样品溶液中总酚浓度：0.5ml的待测液，加入1.0ml稀释了10倍的folin-ciocalteu试剂，30℃反应30min，加入10％(w/v)的碳酸钠溶液，30℃反应30min，在736nm下测定吸光光度值。

vrf＝v0/vr①

式中：vrf为体积浓缩倍数；

v0为超滤前溶液体积，ml；

vr为超滤截留液体积，ml；

截留率r(％)＝(1-cp/cf)×100②

式中：cp为渗透液中该物质的浓度，μg/ml；

cf为原料液中该物质的浓度，μg/ml；

结果见表1，由结果可知，超滤膜对甘薯茎叶多酚的截留率较低。纳滤膜对甘薯茎叶多酚的截留率较高，纳滤膜对甘薯茎叶多酚的截留率随着纳滤膜截留分子量的增大而升高。这是因为超滤膜的孔径比较大，截留分子量为10kda，因此分子量＜10kda的物质都可以通过。而纳滤膜的孔径比较小，因此对多酚的截留率较高。

表1超滤和纳滤膜对多酚的截留率

实施例2：超滤和不同截留分子量纳滤组分的多酚浓度

采用folin-ciocalteu比色法测定实施例1各步骤的样品溶液中总酚含量：0.5ml的待测液，加入1.0ml稀释了10倍的folin-ciocalteu试剂，30℃反应30min，加入10％(w/v)的碳酸钠溶液，30℃反应30min，在736nm下测定吸光光度值。

以绿原酸标准品在0-0.1mg/ml范围内建立标准曲线，得回归方程为y＝8.7671x+0.0068，r²＝0.9994。

根据该标准曲线，由样品溶液在736nm下测定吸光光度值，得到样品溶液总酚含量，单位为mgcae/ml，表示为绿原酸的当量浓度。

结果见表2，由结果可知，甘薯茎叶多酚在400-600da纳滤膜截留液中得到最大程度富集，此部分的多酚浓度最高，达到837.5μgcae/ml，相较于初始溶液多酚浓度提高了2倍。

表2不同超滤/纳滤组分的多酚浓度

实施例3：超滤和不同截留分子量纳滤组分的抗氧化活性

采用frap法测定实施例1各步骤的样品溶液中的抗氧化活性。frap溶液的配制为：10mmol/ltptz溶液和20mmol/lfecl3溶液及300mm的醋酸缓冲溶液(ph＝3.6)以体积比1：1：10充分混匀后，置于37℃水浴锅中保温30min，制得frap溶液。用蒸馏水将各部分样品多酚粗提液配制成相同质量浓度的溶液，取0.15ml样品溶液，加入2.85mlfrap溶液，室温下避光反应30min，立即于593nm处测定吸光值。以蒸馏水代替样品作为空白对照。采用浓度为10、20、50、70、100、200μg/ml的水溶性维生素e标准品建立标准曲线，得线性回归方程y＝0.0029x+0.017，r²＝0.9918。样品溶液的三价铁离子还原活性表示为μg水溶性维生素e当量(troloxequivalent,te)/ml样品溶液。

结果见表3，可知400-600da纳滤截留液部分具有最强的抗氧化活性，抗氧化活性高达80.08μgte/ml。

表3不同超滤/纳滤组分的抗氧化活性

实施例4：不同超滤/纳滤组分的抗紫外活性

采用体外紫外分光光度法测定实施例1各步骤的样品溶液的防晒系数spf(sunprotectionfactor)。将各部分样品稀释至相同浓度。使用紫外分光光度计，在290～320nm波长范围内，每隔5nm测定3次吸光度，以蒸馏水作为空白对照。以抗坏血酸作为阳性对照。应用mansur方程计算spf。

式中：cf为校正因子，10；i(λ)为太阳光谱强度；ee(λ)为波长λ下辐射的红斑效应；abs(λ)为在波长λ波长下吸光度；ee(λ)×i(λ)是常量，它们由sayre等测定；ee(λ)×i的在不同波长下的值分别是290nm，0.0150；295nm，0.0817；300nm，0.2874，305nm，0.3278；310nm，0.1864；315nm，0.0837；320nm，0.0180。

结果见表4，由结果可知，抗紫外活性最强的部分是400-600da纳滤截留液，spf值为10.37。高于阳性对照的抗坏血酸组。

表4不同超滤/纳滤组分的抗紫外活性

实施例5：超滤膜及400-600da纳滤膜过程中膜通量的变化及清洗效率

如图1所示，实施例1中步骤(4)、(5)可在超滤/纳滤膜组件装置中进行；

以去离子水的膜通量记为初始通量。膜分离过程中每隔5分钟记录一次样品渗透液体积，根据公式④计算膜通量并绘制膜通量变化曲线，见附图2。

膜分离结束后的清洗步骤为，首先用去离子水清洗1h，然后用0.1％hcl清洗30min，再用0.1％naoh清洗30min，最后再用去离子水清洗直至流出的渗透液经ph试纸检测为中性。清洗完成之后再次测定去离子水的膜通量，根据公式⑤计算膜通量分数。

膜通量j＝δv/(am×t)④

式中：j为膜通量，l/(m²·h)；

δv为收集的渗透液体积，l；

am为有效膜面积，m²；

t为时间，h。

膜通量分数i＝j1/j0⑤

式中：j1为初始通量，l/m²h；

j0为清洗之后膜通量，l/m²h。

由图2可知，随着膜分离的进行，超滤和纳滤的膜通量均逐渐下降。可能的原因是，在过滤过程中滤膜表明对多酚有吸附作用，随着时间的增加对溶剂的流动阻力增加，因此通量下降。由表5可知，超滤膜在清洗之后膜通量恢复到初始通量的89.24％，400-600da纳滤膜经过清洗之后膜通量恢复到初始通量的98％。超滤和纳滤的膜通量均恢复到初始通量的80％以上，说明本清洗方法便捷有效，可使滤膜长期重复使用。

表5超/纳滤膜清洗之后膜通量分数

实施例6：蒲薯53甘薯茎叶多酚的制备

(1)原料的采集：于11月中旬采摘蒲薯53号甘薯茎叶，采摘部位为藤蔓顶端15cm部位；

(2)预处理：将新鲜的蒲薯53号甘薯茎叶洗净、沥干，放入托盘中于-40℃冰箱预冻24h，取出放入冷冻干燥机，干燥处理72小时后，采用万能粉碎机粉碎，制得甘薯茎叶干粉；

(3)多酚的提取：取步骤(2)中的甘薯茎叶干粉，按照料液比1：20加入70％的乙醇水溶液，混匀，于超声波清洗机中超声浸提30min，提取后7500r离心10min，收集上清液，残渣重复提取2两次，合并上清液。

(4)采用0.45μm微滤膜，将步骤(3)中上清液进行过滤，以除去固体颗粒和不溶性杂质。用10kda超滤膜，压力0.1mpa，室温下对微滤液进行超滤。将超滤渗透液室温下过400-600da纳滤膜，操作压力0.3mpa。保留纳滤渗透液，50℃旋转蒸发去除乙醇后，-40℃预冻处理24h，再进行冷冻干燥处理72h，得到蒲薯53甘薯茎叶多酚纯品。

采用高效液相色谱对本实施例所得的蒲薯53甘薯茎叶多酚进行定量分析；具体方法如下：

用80％的甲醇溶解纯化所得的蒲薯53甘薯茎叶多酚，配制成200μg/ml的样品溶液，过0.45μm膜后进行色谱分析，色谱条件如下：zorbaxeclipsplusc18色谱柱(4.6×150mm，5μm)，检测波长326nm，流速1min/ml，进样量20μl，柱温30℃，流动相a：0.5％(w/v)磷酸溶液，b：乙腈。梯度洗脱程序：0-15min：20-65％b；15-15.1min：65-80％b；15.1-20min：80％b。根据样品吸收图谱中各吸收峰的保留时间和峰面积对样品中各组分进行定量分析结果如表6所示。可知，蒲薯53甘薯茎叶多酚含量为59.02％。

表6甘薯茎叶多酚组分及构成

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

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