细胞膜片保护液的制作方法

本公开涉及组织工程与再生医学领域，尤其涉及细胞膜片保护液及其在储存和运输细胞膜片中的用途。

技术背景

目前，由退行性疾病或者外伤引起的组织器官损伤的发病率(如心衰，帕金森，老年痴呆等疾病)呈逐年上升趋势，传统的医疗手段很难彻底治愈这些疾病。干细胞包括多能性干细胞和成体干细胞，具有分化成多种功能细胞的潜能，还可以分泌多种有利于组织器官修复的细胞因子，是修复损伤组织器官的理想细胞。

目前，世界上已经有大量干细胞修复受损组织器官治疗疾病的基础研究和临床研究。这些研究中，大部分采用了细胞直接注射的方法或者细胞与生物材料结合一起移植的方法，这两种方法均有一定的局限性。细胞直接注射会导致大批量的干细胞丢失，不但会影响干细胞治疗的效果，还会带来如肺动脉栓塞等副作用。细胞和生物材料结合共移植解决了细胞丢失的问题，但是生物材料在体内的降解会引发不同程度的炎症反应，而且支架的降解过程和降解产物可能会引起局部组织的病变。

细胞膜片技术提供了一种新的干细胞移植及应用的技术。干细胞在培养过程中会通过胞外基质在细胞和细胞之间以及细胞和培养皿之间建立连接。通过改变温度，调节温敏智能培养皿改变细胞与培养皿的接触情况，可以不用酶消化的方法，将细胞和细胞外基质从温敏智能培养皿底部分离，得到完整的细胞膜片。以该方法得到的细胞膜片细胞密度高、厚度均一、结构完整。由于该方法制备得到的细胞膜片未损失任何细胞外基质，其中的细胞外基质组分例如黏连蛋白可以使细胞膜片贴附于目的组织或器官表面而不依赖于其额外的缝合、粘结剂等。

细胞膜片从在实验室中制造出来到在医院中用于病人身上，需要经历储存和运输过程。在此过程中，如果细胞膜片保存液不合适的话，细胞膜片内细胞的活性和分泌因子就不能得到保证，细胞膜片的完整性和膜片内细胞的连接也会被破坏，严重影响细胞膜片的临床应用。

因此，开发一种细胞膜片运输保护液，保证细胞膜片在储存和运输过程中，细胞活性以及细胞分泌因子量不会受影响，细胞膜片的完整性和膜片内的细胞连接不受影响，是十分必要的。

技术实现要素：

本公开提供了一种细胞膜片保护液，其能够在细胞膜片的储存和运输过程中保持细胞膜片内细胞的活性和细胞因子分泌能力，并保持细胞膜片的完整性和膜片内的细胞连接，保护细胞免于凋亡。

相应的，在一个方面，本公开涉及一种细胞膜片保护液，其包含以下组分：

a.缓冲盐溶液；

b.细胞外基质组分；

c.还原剂；

d.细胞代谢所需物质；和

e.激素类物质。

在一些实施方案中，所述缓冲盐溶液的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水(pbs)、hanks缓冲液、hepes缓冲液和杜氏磷酸盐缓冲盐水(dpbs)。还可以使用本领域已知的其它的缓冲盐溶液，特别是在细胞和组织相关实验中使用的缓冲盐溶液。

细胞外基质组分的非限制性实例包括胶原、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻黏连蛋白。在本公开的细胞膜片保护液的一些实施方案中，所述细胞外基质组分包括选自胶原、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻黏连蛋白的一种或多种，例如选自胶原、明胶、纤连蛋白、层粘连蛋白和玻黏连蛋白的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种或全部5种细胞外基质组分。

还原剂的非限制性实例包括维生素c、硒酸钠、丙酮酸钠和谷胱甘肽。在本公开的细胞膜片保护液的一些实施方案中，所述还原剂包括选自维生素c、硒酸钠、丙酮酸钠和谷胱甘肽的一种或多种，例如选自维生素c、硒酸钠、丙酮酸钠和谷胱甘肽的至少1种、至少2种、至少3种或全部4种还原剂。

细胞代谢所需物质的非限制性实例包括转铁蛋白、人血清白蛋白、腐胺、乙醇胺、肉毒碱、亚油酸和亚麻酸。在本公开的细胞膜片保护液的一些实施方案中，所述细胞代谢所需物质包括选自转铁蛋白、人血清白蛋白、腐胺、乙醇胺、肉毒碱、亚油酸和亚麻酸的一种或多种，例如选自转铁蛋白、人血清白蛋白、腐胺、乙醇胺、肉毒碱、亚油酸和亚麻酸的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种或全部7种细胞代谢所需物质。

激素类物质的非限制性实例包括氢化可的松、胰岛素和孕酮。在本公开的细胞膜片保护液的一些实施方案中，所述激素类物质包括选自氢化可的松、胰岛素和孕酮的一种或多种，例如选自氢化可的松、胰岛素和孕酮的至少1种、至少2种或全部3种激素类物质。

在一些实施方案中，本公开的细胞膜片保护液包括以下组分：

a.缓冲盐溶液：pbs、hanks缓冲液或hepes缓冲液；

b.细胞外基质组分：明胶、纤连蛋白、玻黏连蛋白，或其任意组合；

c.还原剂：维生素c、谷胱甘肽、硒酸钠、丙酮酸钠，或其任意组合；

d.细胞代谢所需物质：转铁蛋白、亚油酸、亚麻酸、腐胺、人血清白蛋白、肉毒碱、乙醇胺，或其任何组合；和

e.激素类物质：胰岛素、孕酮，或其组合。

在一些实施方案中，本公开的细胞膜片保护液包括以下组分：

a.缓冲盐溶液：pbs；

b.细胞外基质组分：明胶；

c.还原剂：维生素c和谷胱甘肽；

d.细胞代谢所需物质：转铁蛋白、亚油酸和亚麻酸；以及

e.激素类物质：胰岛素。

在一些实施方案中，本公开的细胞膜片保护液包括以下组分：

a.缓冲盐溶液：hanks缓冲液；

b.细胞外基质组分：纤连蛋白；

c.还原剂：维生素c和硒酸钠；

d.细胞代谢所需物质：转铁蛋白、腐胺、人血清白蛋白和肉毒碱；以及

e.激素类物质：胰岛素和孕酮。

在一些实施方案中，本公开的细胞膜片保护液包括以下组分：

a.缓冲盐溶液：hepes缓冲液；

b.细胞外基质组分：玻黏连蛋白；

c.还原剂：丙酮酸钠、谷胱甘肽和硒酸钠；

d.细胞代谢所需物质：亚油酸、亚麻酸和乙醇胺；以及

e.激素类物质：胰岛素和孕酮。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞外基质组分的胶原的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞外基质组分的明胶的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞外基质组分的纤连蛋白的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞外基质组分的层粘连蛋白的浓度可以是1-50mg/l，例如2-20mg/l，例如2-10mg/l，例如约5mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞外基质组分的玻黏连蛋白的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为还原剂的维生素c的浓度可以是50-2000mg/l，例如100-1000mg/l，例如200-1000mg/l，例如约500mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为还原剂的硒酸钠的浓度可以是0.001-0.1mg/l，例如0.005-0.05mg/l，例如0.01-0.05mg/l，例如约0.02mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为还原剂的丙酮酸钠的浓度可以是5-200mg/l，例如10-100mg/l，例如10-50mg/l，例如约25mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为还原剂的谷胱甘肽的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的转铁蛋白的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的人血清白蛋白的浓度可以是500-5000mg/l，例如1000-5000mg/l，例如约2000mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的腐胺的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的乙醇胺的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的肉毒碱的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的亚油酸的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为细胞代谢所需物质的亚麻酸的浓度可以是0.1-10mg/l，例如0.5-5mg/l，例如0.5-2mg/l，例如约1mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为激素类物质的氢化可的松的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为激素类物质的胰岛素的浓度可以是1-50mg/l，例如5-30mg/l，例如5-20mg/l，例如约10mg/l。

在本公开的细胞膜片保护液的任何实施方案中，作为激素类物质的孕酮的浓度可以是0.001-0.1mg/l，例如0.005-0.05mg/l，例如0.005-0.02mg/l，例如约0.01mg/l。

如本文所用，术语“约”意味着包括规定值的和距规定值的+/-20％或更小，优选+/-10％或更小，更优选地+/-5％或更少，只要此类变化适合于在所公开的发明中进行。应当理解，修饰语“约”所指的值本身也是具体地且优选地公开的。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液具有接近中性或接近生理环境的ph值。例如，在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液的ph为6.0-8.0。在优选的实施方案中，所述细胞膜片保护液的ph为7.0-7.4。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液是与细胞等渗或接近等渗的。例如，在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液的渗透压为240-340mosm/l。在优选的实施方案中，所述细胞膜片保护液的渗透压为约280mosm/l。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液可以进一步包含血清，例如所述血清可以选自胎牛血清、新生牛血清、小牛血清和人血清。在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液中血清的含量为1-20％，例如5-10％。

在另一些实施方案中，所述细胞膜片保护液不包含血清。

不包含血清的细胞膜片保护液提供了额外的优势。这是因为当将细胞膜片施用至受试者例如患者时，异体甚至异种来源的血清具有潜在的免疫风险，并且是病原微生物等的潜在载体。使用自体来源的血清虽然避免了免疫风险，但是其来源有限，批次之间质量难以控制，不利于细胞膜片保护液体系的稳定。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液是干细胞膜片保护液。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液是间充质干细胞膜片保护液。所述间充质干细胞可以具有不同的来源，例如来源于选自以下的组织：羊水、羊膜、绒毛膜、绒毛膜绒毛、蜕膜、胎盘、脐带血、华通氏胶、脐带、成人骨髓、成人外周血和成人脂肪组织。

在一些实施方案中，所述充质干细胞选自脐带间充质干细胞、胎盘间充质干细胞、脂肪间充质干细胞和骨髓间充质干细胞。

在一些实施方案中，所述细胞膜片保护液用于细胞膜片的储存。在另一些实施方案中，所述细胞膜片保护液用于细胞膜片的运输。

在一个方面，本公开涉及本公开的细胞膜片保护液在储存细胞膜片中的用途。

在另一个方面，本公开涉及本公开的细胞膜片保护液在运输细胞膜片中的用途。

在上述用途的一些实施方案中，所述细胞膜片是干细胞膜片，例如间充质干细胞膜片。

在一个方面，本公开涉及一种储存细胞膜片的方法，该方法包括：

a.将所述细胞膜片保持在本公开的细胞膜片保护液中；和

b.储存所述细胞膜片。

在一些实施方案中，所述细胞膜片在0-37℃的温度例如约4℃或室温(约25℃)下储存。

在一些实施方案中，所述细胞膜片可以储存12小时至两周的时间，例如约24小时，约48小时，约72小时，约48小时，约5天，约6天，约一周或约两周的时间。

在另一个方面，本公开涉及一种储存细胞膜片的方法，该方法包括：

a.将所述细胞膜片保持在本公开的细胞膜片保护液中；和

b.运输所述细胞膜片。

在一些实施方案中，所述细胞膜片在0-37℃的温度例如约4℃或室温(约25℃)下运输。

在一些实施方案中，所述细胞膜片可以运输12小时至两周的时间，例如约24小时，约48小时，约72小时，约48小时，约5天，约6天，约一周或约两周的时间。

附图说明

图1显示了使用本公开的细胞膜片保护液(配方b)运输前和运输后间充质干细胞膜片的示例性照片。

图2显示了使用本公开的细胞膜片保护液运输前和运输后间充质干细胞膜片的细胞因子hgf、il-6和vegf分泌水平的柱状图。

图3显示了使用本公开的细胞膜片保护液(配方b)运输前和运输后对间充质干细胞膜片中的纤连蛋白和整联蛋白-β1进行荧光染色的结果图。

图4显示了使用本公开的细胞膜片保护液运输前和运输后间充质干细胞膜片中的细胞凋亡水平的检测结果的柱状图。

具体实施方式

实施例1.间充质干细胞膜片制备

在制备脐带间充质干细胞膜片前，首先在温敏培养皿表面包被一层有利于间充质干细胞贴附的基质。使用的基质为纤连蛋白，浓度为10mg/l。将所述温敏培养皿包被8小时。随后，弃去包被液，将间充质干细胞的单细胞悬液加入智能培养皿中。待细胞贴附后增殖12小时后，将温度降低至25℃。细胞将成片层状从温敏智能培养皿底部脱离，成为有细胞外基质完整连结的细胞膜片。其中，膜片呈灰白色，结构致密，表面光滑平整。

实施例2.细胞膜片保护液的制备

制备了具有以下配方a、配方b和配方c的示例性细胞膜片保护液，用于进一步实验。

配方a：

缓冲盐溶液：pbs

细胞外基质组分：明胶(1mg/l)

还原剂：维生素c(500mg/l)；谷胱甘肽(10mg/l)

细胞代谢所需物质：转铁蛋白(10mg/l)；亚油酸(1.0mg/l)；亚麻酸(1.0mg/l)

激素类物质：胰岛素(10mg/l)

配方b：

缓冲盐溶液：hanks缓冲液

细胞外基质组分：纤连蛋白(10mg/l)

还原剂：维生素c(500mg/l)；硒酸钠(0.02mg/l)

细胞代谢所需物质：转铁蛋白(10mg/l)；腐胺(10mg/l)；人血清白蛋白(2000mg/l)；肉毒碱(2mg/l)

激素类物质：胰岛素(10mg/l)；孕酮(0.01mg/l)

配方c：

缓冲盐溶液：hepes缓冲液

细胞外基质组分：玻黏连蛋白(10mg/l)

还原剂：丙酮酸钠(25mg/l)；谷胱甘肽(10mg/l)；硒酸钠(0.02mg/l)

细胞代谢所需物质：亚油酸(1mg/l)；亚麻酸(1mg/l)；乙醇胺(1mg/l)

激素类物质：胰岛素(10mg/l)；孕酮(0.01mg/l)。

实施例3.运输前后细胞分泌因子的检测

将如实施例1所述制备的间充质干细胞膜片置于具有配方a、配方b和配方c的细胞膜片保护液中，并于4℃进行运输48小时。使用配方b的细胞膜片保护液中运输前后细胞膜片的示例性照片如图1所示。从该照片可见，在运输前和运输后，细胞细胞膜片保持了完整性，其形态没有发生明显变化，具有边缘光滑，表面平整，且没有松散或褶皱的特点。

间充质干细胞对于自身组织修复和免疫相关疾病的治疗效果主要通过分泌和表达免疫抑制因子、细胞因子、生长因子等调控炎症和组织稳态来实现。在本实施例中，在运输前和运输后使用酶联免疫吸附测定(elisa)试剂盒，根据制造商的说明对间充质干细胞细胞膜片的上清液中分泌的细胞因子hgf(r&d，目录号dhg00b)、il-6(r&d，目录号val102)和vegf(lifetechnologies，目录号khg0112)的水平进行检测。具体操作如下：将细胞膜片置于新鲜培养基中。16小时后，收集上清液并置于15ml离心管中，于400g离心5分钟去除死细胞。取上清液直接用于elisa检测或在-80℃冻存用于后续elisa检测。

结果如图2所示。从该结果可见，在使用本公开的细胞膜片保护液运输前后，间充质干细胞分泌的细胞因子水平没有显著变化，表明其保持了间充质干细胞的活性。

实施例4.细胞膜片中连接蛋白的检测

将上述得到的间充质干细胞膜片用多聚甲醛或福尔马林固定液固定，随后通过石蜡切片法或冰冻切片法将细胞膜片制成厚度为4-10μm的组织切片进行染色，以观察细胞膜片中细胞外基质所含蛋白情况，同时使用dapi染料对细胞核进行染色，用于辅助定位。

图3显示了在配方b的细胞膜片保护液中运输前后，使用荧光素标记的抗纤连蛋白和整联蛋白-β1抗体对间充质干细胞膜片染色的结果。该结果表明，间充质干细胞膜片中含有大量的纤连蛋白和整联蛋白-β1，其作为膜片中的细胞外基质以连接间充质干细胞。并且，在运输前后细胞膜片中的连接蛋白纤连蛋白和整联蛋白-β1的量没有明显变化，表明在本公开的细胞膜片保护液中进行运输的细胞膜片很好地保持了其细胞间连接。

实施例5.细胞膜片中的细胞凋亡检测

此外，检测了运输前后细胞膜片中的间充质干细胞的凋亡情况。其具体检测步骤使用annexinv-fitc凋亡检测试剂盒(lifetechnologies，目录号bms500fi)，按照制造商的说明进行。

检测结果如图4所示。该结果表明，在使用具有配方a、配方b和配方c的细胞膜片保护液运输前后，细胞膜片中的间充质干细胞的存活率没有明显变化，表明上述细胞膜片保护液很好地保护了间充质干细胞免于细胞凋亡。

以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。

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