一种防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法与流程

本发明涉及烟草农业微生物发酵技术领域，具体涉及一种防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法。

背景技术：

烟草黑胫病（tobaccoblackshank）是世界烟草生产中危害最严重的病害之一，特别是在温带、亚热带和热带发生较重，由致病疫霉菌引起的烟草黑胫病是我国烟草的主要根茎类病害之一，最早发生于黄淮烟区，目前各主要产烟区均有不同程度的发生，我国平均每年因烟草黑胫病造成的经济损失达1亿元以上；为此长期以化学防治为主，导致烟叶中农药残留增加，病原物抗药性增强、药效降低，农田微生态平衡的破坏和环境污染，从而对烟叶质量和人类生命安全造成严重威胁。而且生物农药是替代化学农药解决环境污染难题，实现无公害和绿色农产品生产的重要保障和根本出路；以生防菌为主的微生物农药是病害生物防治研究与应用最广泛的生物农药之一，目前已有许多具有优异生防功能的芽孢杆菌属、链霉菌属、假单胞菌属、木霉菌属等被分离出来，且有些已被制成商品制剂。但生物农药在我国农药市场中占有率低，尤其是微生物农药的研发及产业化还很薄弱，在烟草病害生物防治方面，还没有专用的生防制剂。

目前有关烟草黑胫病的生防菌筛选及防效的研究较多，但高效的生防菌发酵条件优化，并进行生防细菌与真菌复配形成剂型的研究较少。本发明以河南省烟草黑胫病菌优势生理小种1号小种为靶标，筛选出高效生防芽孢杆菌lb-9和木霉菌ycs-tr2，明确了最佳发酵培养基、发酵温度、发酵时间、起始发酵ph值，建立了发酵工艺。筛选出最佳的生防菌株组合及复配比例，研制出防治烟草黑胫病的高效复合生防新制剂。通过苗床基质拌菌、室内盆栽试验系统研究了复合生防菌剂对烟苗的促生长作用和对烟草黑胫病的防控效果，对烟草黑胫病的生物防治具有重要意义。

因此，提供一种便于防治效果好，抑菌效果好，避免化学农药污染，对漂浮烟苗能够促生长的防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法，具有广泛的市场前景。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明提供一种便于防治效果好，抑菌效果好，避免化学农药污染，对漂浮烟苗能够促生长的防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法，用于克服现有技术中缺陷。

本发明采用的技术方案为：一种防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法，所述的复合生防菌剂的菌种包括多粘类芽孢杆菌-lb-9以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2；其制备方法具体包括以下步骤：1)使用lb培养基培养多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株，以及使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；2)将步骤1)制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液和近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液的按照体积比1:1至1:2的配比进行混合，并将制取的混合液浓缩10倍，从而制取生防菌发酵液；3)制取助剂配方，助剂配方的原材料包括萘磺酸盐、硅酸镁铝、黄原胶、甘油以及卡松，并将步骤2)制取生防菌发酵液与助剂配方进行混合，从而制取复合生防菌剂。

所述的lb培养基包括葡萄糖10-15g、豆粕10-15g以及mgso40.2-0.3g/l，lb培养基的发酵起始ph7.0，lb培养基接种多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株的接种量为1-2%，多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株的培养温度为25-30℃，170-190r/min转速下振荡培养48-50h。

所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基包括玉米粉25-30g、葡萄糖15-20g、玉米蛋白粉15-20g、nacl1.3-1.5g、mgso40.4-0.5g/l、k2hpo40.8-1g以及caco32-2.2g/l，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的发酵起始ph6.0，马铃薯葡萄糖琼脂培养基接种近渐绿木霉菌-ycs-tr2的接种量为6-8%，近渐绿木霉菌-ycs-tr2的培养温度为25-30℃，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的装瓶量为150ml/500ml，发酵时间为7-8d。

所述的分别将制取的多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液和近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液倒入液体搅拌设备内进行搅拌，搅拌混合后的混合液通过接料器接入浓缩蒸发器进行浓缩处理。

所述的复合防菌剂的各原料占比为92-93%的生防菌发酵液、5-5.5%的萘磺酸盐、1-1.3%的硅酸镁铝、0.2-0.3%的黄原胶、3-3.5%的甘油以及0.1-0.15%的卡松。

本发明有益效果是：首先，复合生防菌剂的菌种包括多粘类芽孢杆菌-lb-9以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2；其制备方法具体包括以下步骤：1)使用lb培养基培养多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株，以及使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；2)将步骤1)制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液和近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液的按照体积比1:1至1:2的配比进行混合，并将制取的混合液浓缩10倍，从而制取生防菌发酵液；3)制取助剂配方，助剂配方的原材料包括萘磺酸盐、硅酸镁铝、黄原胶、甘油以及卡松，并将步骤2)制取生防菌发酵液与助剂配方进行混合，从而便于制取复合生防菌剂，避免了化学农药的污染；其次，将lb-9发酵液与ycs-tr2发酵液分别以1:1、1:2比例混合后稀释成100倍液，分别取200μl稀释液涂布在琼脂培养基，然后将病原菌菌饼（直径5mm大小）放置在培养基中间，5d后调查病原菌直径，计算生防菌混合液对病原菌的抑制率[抑菌率(%)=(对照菌落的半径−对峙培养烟草疫霉菌落的半径)/对照菌落的半径×100%]，筛选出对烟草疫霉菌抑制效果最佳的菌株组合及复配比例，结果表明，lb-9与ycs-tr2分别以1:1、1:2混配后，对烟草疫霉的抑菌率均达到了90%以上，即本发明具有良好的抑菌效果；再次，通过人工气候室内进行盆栽试验，复合生防菌剂处理对烟草黑胫病的防治效果可达70%以上，即本发明具有良好的防治效果，使得本发明具有很好的社会和经济效益，是易于推广使用的产品。

具体实施方式

一种防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法，所述的复合生防菌剂的菌种包括多粘类芽孢杆菌-lb-9以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2；其制备方法具体包括以下步骤：1)使用lb培养基培养多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株，以及使用马铃薯葡萄糖琼脂培养基培养近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；2)将步骤1)制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液和近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液的按照体积比1:1至1:2的配比进行混合，并将制取的混合液浓缩10倍，从而制取生防菌发酵液；3)制取助剂配方，助剂配方的原材料包括萘磺酸盐、硅酸镁铝、黄原胶、甘油以及卡松，并将步骤2)制取生防菌发酵液与助剂配方进行混合，从而制取复合生防菌剂。

所述的lb培养基包括葡萄糖10-15g、豆粕10-15g以及mgso40.2-0.3g/l，lb培养基的发酵起始ph7.0，lb培养基接种多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株的接种量为1-2%，多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株的培养温度为25-30℃，170-190r/min转速下振荡培养48-50h；所述的马铃薯葡萄糖琼脂培养基包括玉米粉25-30g、葡萄糖15-20g、玉米蛋白粉15-20g、nacl1.3-1.5g、mgso40.4-0.5g/l、k2hpo40.8-1g以及caco32-2.2g/l，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的发酵起始ph6.0，马铃薯葡萄糖琼脂培养基接种近渐绿木霉菌-ycs-tr2的接种量为6-8%，近渐绿木霉菌-ycs-tr2的培养温度为25-30℃，马铃薯葡萄糖琼脂培养基的装瓶量为150ml/500ml，发酵时间为7-8d；所述的分别将制取的多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液和近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液倒入液体搅拌设备内进行搅拌，搅拌混合后的混合液通过接料器接入浓缩蒸发器进行浓缩处理；所述的复合防菌剂的各原料占比为92-93%的生防菌发酵液、5-5.5%的萘磺酸盐、1-1.3%的硅酸镁铝、0.2-0.3%的黄原胶、3-3.5%的甘油以及0.1-0.15%的卡松。

实施例1：使用葡萄糖10g、豆粕10g以及mgso40.2g/l制成lb培养基,相应接种量1%的多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株进行培养，以及使用玉米粉25g、葡萄糖15g、玉米蛋白粉15g、nacl1.3g、mgso40.4g/l、k2hpo40.8g以及caco32g/l制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，相应接种8%的近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株进行培养，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；将lb-9发酵液与ycs-tr2发酵液按照1:1比例混合后稀释成100倍液，分别取200μl稀释液涂布在琼脂培养基，然后将病原菌菌饼（直径5mm大小）放置在培养基中间，5d后调查病原菌直径，计算生防菌混合液对病原菌的抑制率[抑菌率(%)=(对照菌落的半径−对峙培养烟草疫霉菌落的半径)/对照菌落的半径×100%]，筛选出对烟草疫霉菌抑制效果最佳的菌株组合及复配比例，结果表明抑菌率达到了97.72%。

实施例2：使用葡萄糖13g、豆粕15g以及mgso40.3g/l制成lb培养基,相应接种量2%的多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株进行培养，以及使用玉米粉30g、葡萄糖20g、玉米蛋白粉20g、nacl1.5g、mgso40.5g/l、k2hpo41g以及caco32.2g/l制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，相应接种8%的近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株进行培养，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；将lb-9发酵液与ycs-tr2发酵液按照1:1比例混合后稀释成100倍液，分别取200μl稀释液涂布在琼脂培养基，然后将病原菌菌饼（直径5mm大小）放置在培养基中间，5d后调查病原菌直径，计算生防菌混合液对病原菌的抑制率[抑菌率(%)=(对照菌落的半径−对峙培养烟草疫霉菌落的半径)/对照菌落的半径×100%]，筛选出对烟草疫霉菌抑制效果最佳的菌株组合及复配比例，结果表明抑菌率达到了97.23%。

实施例3：使用葡萄糖10g、豆粕10g以及mgso40.2g/l制成lb培养基,相应接种量1%的多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株进行培养，以及使用玉米粉25g、葡萄糖15g、玉米蛋白粉15g、nacl1.3g、mgso40.4g/l、k2hpo40.8g以及caco32g/l制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，相应接种8%的近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株进行培养，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；将lb-9发酵液与ycs-tr2发酵液按照1:2比例混合后稀释成100倍液，分别取200μl稀释液涂布在琼脂培养基，然后将病原菌菌饼（直径5mm大小）放置在培养基中间，5d后调查病原菌直径，计算生防菌混合液对病原菌的抑制率[抑菌率(%)=(对照菌落的半径−对峙培养烟草疫霉菌落的半径)/对照菌落的半径×100%]，筛选出对烟草疫霉菌抑制效果最佳的菌株组合及复配比例，结果表明抑菌率达到了94.95%。

实施例4：使用葡萄糖15g、豆粕13g以及mgso40.3g/l制成lb培养基,相应接种量2%的多粘类芽孢杆菌-lb-9菌株进行培养，以及使用玉米粉30g、葡萄糖20g、玉米蛋白粉20g、nacl1.5g、mgso40.5g/l、k2hpo40.9g以及caco32.2g/l制成马铃薯葡萄糖琼脂培养基，相应接种8%的近渐绿木霉菌-ycs-tr2菌株进行培养，从而分别制取多粘类芽孢杆菌-lb-9发酵液以及近渐绿木霉菌-ycs-tr2发酵液；将lb-9发酵液与ycs-tr2发酵液按照1:2比例混合后稀释成100倍液，分别取200μl稀释液涂布在琼脂培养基，然后将病原菌菌饼（直径5mm大小）放置在培养基中间，5d后调查病原菌直径，计算生防菌混合液对病原菌的抑制率[抑菌率(%)=(对照菌落的半径−对峙培养烟草疫霉菌落的半径)/对照菌落的半径×100%]，筛选出对烟草疫霉菌抑制效果最佳的菌株组合及复配比例，结果表明抑菌率达到了95.33%。

为了研究复合生防菌剂是否对漂浮烟苗生长是否有促进作用，复合生防菌剂的各原料占比为92.5%的生防菌发酵液、5%的萘磺酸盐、1%的硅酸镁铝、0.2%的黄原胶、3%的甘油以及0.1%的卡松进行混合，采用漂浮育苗的方式，在河南省农科院烟草所温室大棚内进行。供试漂浮盘为200穴苗盘（长宽高为66cm×33cm×5.5cm），育苗基质为烟草漂浮育苗专用，共设置4个处理方案，每个处理方案重复3次实验，每个处理方案为一个200穴育苗盘。处理方案1[t1]采用30ml复合生防菌水剂兑清水250ml，混匀后与750g基质拌匀装盘；处理方案2[t2]采用60ml复合生防菌水剂兑清水250ml，混匀后与750g基质拌匀装盘；处理方案3[t3]用90ml采用复合生防菌水剂兑清水250ml，混匀后与750g基质拌匀装盘；处理方案4[t4（ck）]采用250ml清水与750g基质拌匀装盘。

播种后50天，分别从每个处理方案的漂浮盘中选取长势均匀的烟苗20株，参照烟草农艺性状调查方法（yc/t142-2010）测定其农艺性状，利用dps7.05软件进行显著性检验，采用duncan新复极差法进行差异显著性比较，表1为烟苗生长速度及长势表，表2为烟苗农艺性状。从表1可以看出，t1-t2处理的出苗率稍高于对照处理，成苗期比对照早2天，长势强，苗色绿；t3处理的出苗率稍低于对照处理，成苗期比对照晚3天，且苗色呈黄绿色。由此说明，合适浓度的复合生防菌剂能促进烟草种子萌发及烟苗生长；从表2可以看出，t1、t2处理的烟苗农艺性状指标（株高、茎围、根系鲜重、地上部鲜重）均高于对照处理，其中t1处理的烟苗株高、根系鲜重、地上部鲜重与t4（ck）处理相比，均达到了显著差异水平。由此说明，复合生防菌剂可以显著促进烟苗根系及烟株生长，具有较好的促生长作用。

为了试验复合生防菌剂对烟草黑胫病的室内盆栽防治效果，在人工气候室内进行盆栽试验，烟草的品种选用中烟100，首先将病疫霉菌接种在燕麦培养基上，在25-30℃黑暗环境下培养7-14d，当菌丝体生长旺盛，菌落边缘基本接近培养皿（φ9cm）周边，无性孢子囊大量形成但尚未大量脱落的时候，将致病疫霉菌丝体从平板上刮下来放入灭过菌的10ml离心管中，加入5ml无菌水，在振荡器上振荡2min，然后用300目的筛网过滤除去菌丝体，得上清，即孢子囊悬浮液，镜检调节浓度为104个孢子/ml，用于接种试验；然后将4-5叶期的烟苗移栽于花盆中（直径为上口100mm×高90mm），烟苗的培育环境为室温25-28℃、湿度50-60%以及一天光照12h且黑暗12h，5～7d后每株浇10ml复合生防菌剂；再然后，在24h后给烟苗接种烟草疫霉菌，采用伤根灌根法，每株灌疫霉菌孢子悬浮液10ml。

接种后20d调查发病率和发病级数，其分级标准参照中华人民共和国烟草行业标准（yc／t39-1996）规定执行，计算发病率[发病率（%）=发病株数/调查总株数×100]、病情指数[病情指数=∑（各级病株数×各级病级代表值）/（调查总株数×最高级代表值）×100]以及防止效果[防治效果（%）=（对照区病情指数-防治区病情指数）/对战区病情指数×100]，同时根据调查的化学药剂处理数据以及清水处理数据进行统计，将统计的数据制成统计表3；从表3可以看出，复合生防菌剂处理对烟草黑胫病的防治效果可达70%以上，虽然稍低于化学药剂处理，但生防菌剂对农田微生态平衡、环境保护和实现无公害绿色农产品生产具有重要意义，对烟草黑胫病的生物防治具有重要的指导价值。

综上所述，本发明通过提供一种防治效果好，抑菌效果好，避免化学农药污染，对漂浮烟苗能够促生长的防治烟草黑胫病的复合生防菌剂的制备方法，使得本发明具有广泛的市场前景。

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除