和厚朴酚在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用的制作方法

本发明涉及杀菌活性化合物，具体涉及和厚朴酚在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。

背景技术：

黄瓜霜霉病是由古巴假霜霉侵染而引起的一种严重病害。黄瓜霜霉病流行性较强，具备较快的传播速度以及较高的发生率，如果气候较为适宜，一旦发生仅仅1～2周即可导致黄瓜植株叶片全部枯萎死亡，使黄瓜结果受到直接影响。通常情况下，霜霉病可导致黄瓜减产30％～50％，如果病害较为严重其减产幅度会超过70％，甚至可能会导致绝产。因此霜霉病是黄瓜生产栽培中危害严重的病害之一，发病影响巨大，损失严重。目前，生产上仍以化学药剂防治作为控制该病流行的主要方法。但由于导致黄瓜霜霉病的古巴假霜霉极易产生抗药性，加之不科学的大量单一使用化学药剂，导致防效不理想，并且对生态环境造成污染。

和厚朴酚，来源于木兰科落叶乔木植物厚朴或凹叶厚朴的干皮、根皮及枝皮。化学名称为3',5-二烯丙基-[1,1'-联苯]-2,4'-二酚。英文名称：honokiol。分子式：c18h18o2。cas35354-94-6>95.0％。分子结构式为：

和厚朴酚，棕褐色至白色精细粉末，气香，味辛辣，微苦。单体为无色鳞片状晶体。熔点87.5℃。旋光度±0°。cm-1:3280，1610，1500，882，826。可溶于一般的有机溶剂，易溶于苯，乙醚，氯仿，乙醇等，难溶于水。在氯仿中与氯化铁作用成蓝色。与三氯化铁甲醇溶液反应，显蓝黑色，与millon试剂反应，现棕色沉淀，与间苯三酚盐酸溶液反应现红色沉淀。

和厚朴酚具有明显的、持久的中枢性肌肉松弛、中枢神经抑制作用，而且抗炎、抗菌、抗病原微生物、抗溃疡、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、降低胆固醇等药理作用，现有技术中用于治疗急性肠炎、细菌性或阿米巴痢疾、慢性胃炎等。其中，在抗菌作用方面，和厚朴酚对格兰氏阳性菌、耐酸性菌、丝状真菌有显著的抗菌活性，对变形链球菌有更加显著的抗菌作用，对葡萄球菌的抑制作用最强。临床上主要用作消除胸腹满闷、镇静中枢神经、运动员肌肉松弛、抗真菌、抗溃疡等药。另外，和厚朴酚新的用途可以拓展到精神类疾病。

但是，目前国内外尚无和厚朴酚对黄瓜霜霉病具有抑制作用的报道。

技术实现要素：

本发明的目的旨在针对现有技术的不足，提供和厚朴酚在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用。本发明通过毒力测定，证明了和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌具有良好的抑制活性，和厚朴酚作为杀菌剂，其高效、低毒，适合于植物病害防治的要求。

本发明的技术方案是这样实现的：

本发明提供了和厚朴酚在制备用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂中的应用，所述霜霉菌为黄瓜霜霉病菌、菠菜霜霉病菌、莴苣霜霉病菌、大葱霜霉病菌或者荔枝霜霉病菌。

进一步的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为2.50-30.00μg/ml。所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度低于2.50μg/ml时，对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放和游动的抑制不明显，同时对休止孢的萌发及其芽管伸长的抑制也不明显。

在和厚朴酚对黄瓜霜霉病的保护作用试验中，优选的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为12.00-20.00μg/ml，在此浓度范围内，保护作用的相对防效随浓度增加而提高。最优选的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为20.00μg/ml，在此浓度下，对黄瓜霜霉病的保护作用效果最佳，相对防治效果达到96.39％。

而在对黄瓜霜霉病的治疗作用试验中，优选的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为20.00-30.00μg/ml，当所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度低于15.00μg/ml时，对黄瓜叶片病斑扩展的抑制率和产孢抑制率分别低于70％和80％。优选的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为20.00-30.00μg/ml，在此浓度范围内，治疗作用的校正防效随浓度增加而提高。最优选的，所述杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为30.00μg/ml，在此浓度下，对黄瓜霜霉病的治疗作用效果最佳，病斑扩展的抑制率和产孢抑制率分别达到88.35％和90.71％，校正防效达到80.00％。

进一步的，所述植物为黄瓜、菠菜、莴苣、大葱或者荔枝。更优选的，所述植物为黄瓜。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的杀菌剂，含有和厚朴酚。

进一步的，所述杀菌剂活性成分为和厚朴酚。

进一步的，所述杀菌剂为和厚朴酚的二甲基亚砜/水溶液。本发明中，二甲基亚砜/水溶液可以理解的是，将一定质量的和厚朴酚于一定体积的二甲基亚砜中配成和厚朴酚母液，过滤除菌冷藏保存待用，使用时用灭菌自来水将厚朴酚母液按照所需的比例稀释，即得一定浓度的和厚朴酚的二甲基亚砜/水溶液。

基于同一个发明构思，本发明还提供了一种用于防治由霜霉菌引起的植物病害的方法，使用含和厚朴酚的杀菌剂。

本发明的有益效果是：

1、本发明中和厚朴酚作为一种可降解、无污染、对环境友好的小分子化合物，病原菌不易产生抗药性，对非靶标生物及人畜安全，能够保证农产品的高品质，符合可持续发展的要求，其研究和市场应用前景广阔。

2、本发明试验结果显示，和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，当浓度为5.00μg/ml、4.00μg/ml及3.33μg/ml时，游动孢子释放抑制率均为100％，而浓度为2.50μg/ml时释放抑制率也达92.68％；和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用；和厚朴酚能够抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展，各处理显著优于对照，效果显著；和厚朴酚同样有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，单位病斑面积产孢量随药剂浓度的升高而降低，各处理显著优于对照，效果显著，其中药剂浓度为30.00μg/ml时，校正防效达到80.00％，此时治疗效果最佳；和厚朴酚对离体黄瓜叶片霜霉病的保护效果较好，其中药剂浓度为20.00μg/ml时，相对防效达到96.39％，此时保护效果最佳。综上，本发明通过室内毒力测定，证明了和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌具有良好的抑制活性。和厚朴酚作为杀菌剂，具有高效和低毒的优点，适合于植物病害防治的要求。

3、本发明中的杀菌剂可作用的植物病害并不是特别限制于黄瓜霜霉病，还可以是菠菜霜霉病、莴苣霜霉病、大葱霜霉病或者荔枝霜霉病等。

附图说明

图1为不同浓度药剂处理对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响(a：5.00μg/ml和厚朴酚；b：2.00μg/ml和厚朴酚；c：无菌水对照)；

图2为黄瓜叶片喷施不同浓度的和厚朴酚处理组和喷施无菌水对照组的病斑照片图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的内容，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

除非另有定义，本说明书所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

实验材料：本实施例中的和厚朴酚购自东京化成工业株式会社。称取10mg于1ml二甲基亚砜中配成10mg/ml和厚朴酚母液，过滤除菌于4℃冰箱保存待用。

实施例1：和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响

1、实验方法：

本实施例中，采用凹玻片法测定和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响。

用灭菌自来水制备浓度为10⁵个/ml的孢子囊悬浮液，将和厚朴酚药剂按比例稀释并与孢子囊悬浮液等体积混匀，药剂终浓度分别为5.00μg/ml、4.00μg/ml、3.33μg/ml、2.50μg/ml、2.00μg/ml、1.65μg/ml、1.25μg/ml，以灭菌自来水和孢子囊悬浮液等体积混匀为对照。各处理分别取30μl滴加在凹玻片上，将凹玻片放入铺有湿滤纸的培养皿中，置于4℃，rh>80％黑暗的冰箱中保湿培养1h，再在20℃培养箱中培养1h。待对照中80％以上的孢子囊释放出游动孢子，在显微镜下观察100个孢子囊的空囊率及游动的游动孢子比率，并分别计算游动孢子的释放抑制率和游动抑制率，以及显微拍照。每处理设3个重复，试验重复3次。

游动孢子释放抑制率(％)＝(对照组游动孢子释放率-处理组游动孢子释放率)/对照组游动孢子释放率×100％

游动孢子游动抑制率(％)＝(对照组游动孢子游动率-处理组游动孢子游动率)/对照组游动孢子游动率×100％

2、和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响结果：

试验结果如表1所示，和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子的释放有明显的抑制作用，其中浓度为5.00μg/ml、4.00μg/ml及3.33μg/ml时，游动孢子释放抑制率均为100％，而浓度为2.50μg/ml时释放抑制率也达92.68％，由不同浓度处理的游动孢子释放抑制率得回归曲线y＝-8.0706x+7.1479(r²＝0.8164)，有效抑制中浓度ec50＝1.85μg/ml。但在2.50μg/ml以下的浓度，对游动孢子游动的抑制不明显。

表1和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放及游动的影响

注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(duncan氏新复极差法)

图1显示了不同浓度药剂处理对黄瓜霜霉病菌游动孢子释放的影响(a：5.00μg/ml和厚朴酚；b：2.00μg/ml和厚朴酚；c：无菌水对照)，从图1中可以看出，处理a的和厚朴酚浓度高，影响孢子囊的原生质割裂和游动孢子的分化，因此图1-a中多个孢子囊均没有游动孢子释放；处理b的和厚朴酚浓度较低，因此图1-b中孢子囊中有分化好的游动孢子，孢子囊外也有两个释放的游动孢子；图1-c中没有和厚朴酚，因此孢子囊的原生质割裂和游动孢子的分化较完整，孢子囊中的游动孢子释放较快，游动孢子大都释放出去，孢子囊已空，仅有上边的孢子囊有1个游动孢子，囊内还有1、2个游动孢子。

实施例2：和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响

1、实验方法：

采用凹玻片法测定和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响。

用灭菌自来水制备浓度为10⁵个/ml的孢子囊悬浮液。将药剂按比例稀释并与孢子囊悬浮液等体积混匀，药剂终浓度分别为10.00μg/ml、6.67μg/ml、5.00μg/ml、2.50μg/ml、1.25μg/ml，以灭菌自来水和孢子囊悬浮液等体积混匀为对照，每处理组设4个重复。将孢子囊悬浮液20μl滴加到凹玻片上，放在13℃、rh＞80％黑暗的培养箱中保湿培养4-5h。待大于80％的游动孢子形成休止孢，再继续培养4h后，待对照休止孢萌发率大于45％，进行拍照记录并测量芽管长度。

2、和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响结果：

表2和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长的影响

注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(duncan氏新复极差法)

由表2可知，和厚朴酚对黄瓜霜霉病菌休止孢萌发及芽管伸长均有明显的抑制作用，各处理组与对照组间均差异显著。由不同浓度处理的休止孢萌发抑制率得回归曲线y＝2.7848x+4.734(r²＝0.9184)，有效抑制中浓度ec50＝1.25μg/ml；由不同浓度处理的芽管伸长抑制率得回归曲线y＝1.6571x+4.5909(r²＝0.9831)，有效抑制中浓度ec50＝1.77μg/ml。

实施例3：和厚朴酚对黄瓜霜霉病的治疗作用

一、实验方法：

本试验采用离体叶片喷雾法测定和厚朴酚对黄瓜霜霉病病斑扩展和产孢的影响来判断其治疗作用。

和厚朴酚设10种不同浓度处理，分别为：30.00μg/ml、25.00μg/ml、20.00μg/ml、15.00μg/ml、10.00μg/ml、6.67μg/ml、5.00μg/ml、2.50μg/ml、1.25μg/ml和对照，每个处理重复3次。

用灭菌自来水制备浓度为10⁵个/ml的孢子囊悬浮液。选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，于叶片背面接种孢子囊悬浮液，每个叶片5个点，每个点滴10μl，置于白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替的培养箱中培养4d，此时病斑产生但未产孢，调查初始病斑面积。再用小喷壶将上述不同浓度的和厚朴酚均匀喷施到叶片表面至流失，空白对照喷无菌水，培养3～6d至产孢，调查最终病斑面积。根据不同浓度处理的初始值与最终值计算病斑面积的扩展抑制率；单位病斑面积产孢量调查采用1ml无菌水将各处理叶片上产生的霉层洗下制成孢子囊悬浮液，摇匀后取10μl在10x10倍显微镜下检查孢子囊数量，并换算每毫升孢子囊悬浮液中所含的孢子囊数量，进而计算单位体积单位病斑面积的产孢量，根据处理及对照叶片的产孢量，比较计算稀释不同倍数发酵滤液处理的产孢抑制率。

病斑扩展量＝病斑最终面积平均值-病斑初始面积平均值

病斑扩展抑制率(％)＝[(对照的平均病斑扩展量-处理的平均病斑扩展量)/对照的平均病斑扩展量]x100％

病情指数＝[∑(各级病叶数×相对级数)/(调查总叶数×9)]x100

校正防效(％)＝1-[(处理的药后病情指数×ck的药前病情指数)/(处理的药前病情指数×ck的药后病情指数)]×100％

单位病斑面积产孢量抑制率(％)＝[(对照的单位病斑面积产孢量-处理的单位病斑面积产孢量)/对照的单位病斑面积产孢量]x100％

二、和厚朴酚对黄瓜霜霉病的治疗作用结果：

表3和厚朴酚对黄瓜霜霉病的治疗作用

注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(duncan氏新复极差法)

由表3可知，和厚朴酚能够抑制已发病黄瓜叶片的病斑扩展，各处理与对照间均差异显著，由不同浓度处理的校正防效得回归曲线y＝0.6847x+4.7158(r²＝0.9314)，有效抑制中浓度ec50＝2.60μg/ml。当杀菌剂中和厚朴酚的有效使用浓度为30.00μg/ml，在此浓度下，对黄瓜霜霉病的治疗作用效果最佳，病斑扩展的抑制率和产孢抑制率分别达到88.35％和90.71％。

和厚朴酚同样有效抑制黄瓜霜霉病菌的产孢量，单位病斑面积产孢量随药剂浓度的升高而降低，各处理与对照间均差异显著。

实施例4：和厚朴酚对黄瓜霜霉病的保护作用

一、实验方法：

本试验采用离体叶片喷雾法测定和厚朴酚对黄瓜霜霉病的保护作用。

和厚朴酚设9种不同浓度处理，分别为：20.00μg/ml、15.00μg/ml、12.00μg/ml、10.00μg/ml、6.67μg/ml、5.00μg/ml、2.50μg/ml、1.25μg/m和对照,每个处理重复3次。

用灭菌自来水制备浓度为10⁵个/ml的孢子囊悬浮液。选取大小一致的黄瓜叶片，用自来水冲洗后吸干水分，背面朝上置于垫有湿滤纸的培养皿中，待用。在叶片背面先喷施不同浓度的和厚朴酚，待药液稍干后接种病原菌。采用点滴法接种，每个叶片5个点，每个点滴10μl。以喷施无菌水为对照。培养条件为白天22℃，夜晚18℃，12h光暗交替。7d后测量病斑大小，根据病斑大小计算病情指数和防治效果。

二、和厚朴酚对黄瓜霜霉病的保护作用结果：

表4和厚朴酚对离体黄瓜叶片霜霉病的保护作用

注：同一列数字后面的字母表示在p＜0.05水平差异显著(duncan氏新复极差法)

由表4可知，和厚朴酚对离体黄瓜叶片霜霉病的防治效果较好，其中药剂浓度为20.00μg/ml时，相对防效达到96.39％，当药剂浓度在5.00μg/ml以下时，相对防效不足50％。根据不同浓度处理对离体黄瓜叶片霜霉病的抑制率得回归曲线y＝2.0409x+3.9442(r²＝0.9666)，有效抑制中浓度ec50＝3.29μg/ml。

图2显示喷施不同浓度的和厚朴酚和喷施无菌水对照组的病斑照片图，从图2中可以看出，随着和厚朴酚浓度的加大，叶片病斑面积变小，病情指数降低，相对防效逐渐提高。当和厚朴酚药剂浓度为20.00μg/ml时，黄瓜叶片没有病斑产生，说明和厚朴酚药剂浓度为20.00μg/ml时，起到很好的抑制效果。综上所述，和厚朴酚非常有潜力应用于黄瓜霜霉病菌的防治中。进一步的，和厚朴酚非常有潜力应用于菠菜霜霉病、莴苣霜霉病、大葱霜霉病或者荔枝霜霉病等的防治中。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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