天然杀幼蚊剂的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2018年3月20日提交的名称为天然杀幼蚊剂的美国实用申请第15/926,434号(该申请要求于2017年11月28日提交的名称为天然杀幼蚊剂的美国临时专利申请第62/591,325号的优先权)的优先权权益。上面引用的申请的内容都通过引用以其整体被并入，如同充分阐述一样。

本发明涉及杀幼虫制剂及其施用方法，用于分别在约两小时和十五分钟内杀灭各龄期幼虫阶段和蛹；而对环境没有影响。特别地，杀幼虫剂及其施用方法涉及杀灭作为疟疾的主要媒介的冈比亚按蚊(anophelesgambiae)和斯氏按蚊(an.stephensi)以及作为登革热、寨卡病毒、基孔肯雅热和黄热病的主要媒介的埃及伊蚊(aedesaegypti)和白纹伊蚊(ae.albopictus)的幼虫和蛹。特别地，本发明涉及适于放置在人类以及圈养或非圈养的家养动物和非家养动物所常去的环境中的杀蛹和杀幼虫的组合物，并且特别适于消除蚊子的幼年期。

背景技术：

蚊子代表属于双翅目，长角亚目，蚊科的很多种昆虫。有分为41个属的大约3500种蚊子。

由蚊子传播的媒介传播疾病(疟疾、丝虫病、登革热、基孔肯雅病、黄热病、寨卡病毒和其他虫媒病毒)是世界热带和亚热带地区主要的公共卫生问题。在城市地区，特别是在雨季期间，差和效率低下的排水系统，以及农田的灌溉沟渠提供了一些蚊子繁殖场所。

在蚊子群体中，斯氏按蚊和冈比亚按蚊分别是亚洲和非洲的主要疟疾传播媒介；而埃及伊蚊和白纹伊蚊是虫媒病毒的主要媒介。

所有这些媒介传播疾病主要困扰贫困国家，那里有超过二十亿人生活在流行地区。

对抗媒介传播疾病的常用方法依赖于使用针对成虫和幼虫的化学杀虫剂或合成杀幼虫剂。但是，对不同种类的合成化合物(如拟除虫菊酯、有机磷酸酯、有机氯化物和氨基甲酸酯)显示出抗药性的蚊子的发展，决定了研究新型“安全”的制剂以控制蚊子种群。此外，可用化学产品对人类和动物的毒性，其高昂的运营成本以及随后的环境污染，都导致需要开发新的方法来控制媒介传播的疾病。

蚊子的生命周期

蚊子在其生命周期中经历四个发育阶段：卵，幼虫，蛹和成虫。前三个阶段是水生的，持续到两个星期左右，并取决于蚊子种类和外部环境条件。雌性蚊子的寿命约为三周，而雄性蚊子的寿命仅为两周。成年雌性每次产卵产50–200个卵。卵很小(约0.5×0.2mm)。卵单个地直接产在水上。卵不能抵抗干燥并且在2-3天之内孵化，但是在较冷的气候下孵化可能需要2-3周。

幼虫从卵中出来。按蚊属(anopheles)幼虫不呈现像其他蚊子(例如库蚊属(culex)和伊蚊属(aedes))一样的呼吸虹吸管，因此其身体与水面平行。相比之下，非按蚊的蚊子物种的摄食幼虫通过其后部的虹吸管将自身附着在水面上，其身体指向下方。蚊幼虫的头部发达，有用于进食的口刷、大胸部和九段腹部。幼虫以表面微层中的浮游动物、藻类、细菌和其他微生物为食。

为了产卵，雌性蚊子需要交配，使卵授精，和一次或多次采血以使卵发育。刚产卵后，新鲜产出的卵是软且白色的。由于昆虫的卵壳是防止胚胎受损和感染的重要屏障，因此，它经历了不同的硬化和变暗过程，从而赋予了其对外部环境更大的抵抗力。从这个意义上讲，氨基酸酪氨酸在卵膜黑化中起着至关重要的作用。在黑化途径中，酪氨酸羟化酶将酪氨酸转化为l-多巴，多巴脱羧酶将l-多巴转化为多巴胺，然后不同的酚氧化酶原(prophenoloxidase)参与由l-多巴形成l-多巴黑色素和由多巴胺形成多巴胺黑色素。

幼虫通过四个阶段或龄期发育，然后发育成蛹。在每个龄期的末期，幼虫会长大，改变其外壳，以便进一步生长。第一阶段的幼虫长约1mm；第四阶段的幼虫通常长5–8mm。

从产卵到成年开始的过程取决于温度和环境条件，最短时间为7天。

幼虫可以在宽范围的栖息地中生存，并且已经在淡水或盐水沼泽、湿地、稻田、溪流和河流的边缘以及小的临时雨水池中发现了它们。

如果从侧面看，蛹具有逗号的形状。头部和胸部连接成头胸部，腹部弯曲在下面。如同幼虫一样，蛹必须经常通过在它们头胸部上的一对呼吸角来到表面呼吸。作为蛹几天后，头胸部的背面破裂，成年蚊子出现。在温带地区，蛹阶段持续约2-3天。

从卵到成虫的持续时间可以根据物种而有很大不同，并且它受外部环境的强烈影响。根据环境条件，蚊子可能会在7到14天之间从卵发育为成虫。

市场上可获得的大多数现有杀虫剂由有效成分构成，但其特征还在于对人和动物的特定毒性程度。

使用无毒制剂消除蚊幼虫和蛹不会污染水生环境，从而基本上消除了对动物和人类的中毒风险。

现有的已知可杀灭蚊子的参考文献包括us5196200、us5205065、us5228233、us5281621、us5327675、us5417009、us5464626、us5521165、us5633236、us5665781、us5698210、us5716602、us5855903、us6077521、us6267953、us6306415、us6562841、us6593299、us6605643、us6800294、us6809078、us6825006、us7198797、us7378557、us8454983、us8696987、us8900553、us9549898、us20070154504、us20080193387、us20080213198、us20090018192、us20100233146、us20100310685、us20110229543、us20130296370、us20160360758、us20170215432和wo2016018937。

本发明的目的是改善现有技术中的缺陷。

技术实现要素：

本发明的一个目的是改善现有技术，并提供杀幼虫制剂及其施用方法，用于分别在约两小时和十五分钟内杀灭各龄期幼虫阶段和蛹；而对环境没有影响。

本发明的一个目的是提供一种杀幼虫剂及其施用方法，用于杀灭作为疟疾的主要媒介的冈比亚按蚊和斯氏按蚊以及作为登革热、寨卡病毒、基孔肯雅热和黄热病的主要媒介的埃及伊蚊和白纹伊蚊的幼虫和蛹。

本发明的一个目的是提供一种杀幼虫和杀蛹制剂，其特征在于对动物(特别是鱼类)和对人类的毒性基本可以忽略。

本发明的一个目的是提供一种杀幼虫和杀蛹制剂，其成本低，在实践中使用相对简单并且施用安全。

本发明的一个目的是提供一种杀幼虫和杀蛹制剂，其包含：鲸蜡醇，水杨酸，酪氨酸，薄荷油，桉叶油，硅藻土和吐温20。

本发明的其他目的通过提供施用杀幼虫和杀蛹制剂的方法来实现，所述制剂包含：鲸蜡醇，水杨酸，酪氨酸，薄荷油，桉叶油，硅藻土和吐温20。

特别地，本发明的目的通过提供用于杀灭蚊子的乳剂来实现，该乳剂包含：在水中溶解的酪氨酸；和鲸蜡醇和水杨酸溶解在薄荷油中的溶液，其中所述乳剂被配置为用作杀幼虫剂和杀蛹剂以杀灭蚊子的幼虫和蛹。

在某些实施方式中，所述溶液还包含溶解在所述薄荷油中的硅藻土、吐温20和桉叶油。

在某些实施方式中，所述幼虫和蛹选自冈比亚按蚊和斯氏按蚊(疟疾的主要媒介)以及埃及伊蚊和白纹伊蚊(登革热、寨卡病毒、基孔肯雅热和黄热病的主要媒介)。

在某些实施方式中，所述乳剂分别在约两小时和十五分钟内杀灭幼虫和蛹。

在某些实施方式中，所述乳剂包含0.03g所述酪氨酸，200ml所述水，10g所述鲸蜡醇，10g所述水杨酸和100ml薄荷油。

在某些实施方式中，所述乳剂包含溶解到40ml桉叶油和60ml薄荷油中的0.03g所述酪氨酸，200ml所述水，10g所述鲸蜡醇，10g所述水杨酸，5g硅藻土和20滴吐温20。

在某些实施方式中，在乳剂中酪氨酸与水的比例为0％至1％。

在某些实施方式中，鲸蜡醇与薄荷油的比例为0％至30％。

在某些实施方式中，水杨酸与薄荷油的比例为0％至30％。

在某些实施方式中，硅藻土与薄荷油的比率为0％至20％。

在某些实施方式中，吐温20与薄荷油的比例为0％至20％。

在某些实施方式中，桉叶油与薄荷油的比例为0％至70％。

在某些实施方式中，在施用所述乳剂后24小时后，幼虫死亡率为至少60％。

在某些实施方式中，在施用所述乳剂后18小时后，幼虫死亡率为至少70％。

在某些实施方式中，在施用所述乳剂后2小时和15分钟后，幼虫和蛹的死亡率分别为约100％。

本发明的其他目的通过提供一种用于杀灭蚊子的乳剂来实现，该乳剂包含：在水中溶解的酪氨酸；和包含薄荷油的基于油的溶液，其中所述乳剂被配置为用作杀幼虫剂/杀蛹剂以杀灭蚊子的幼虫和蛹。

在某些实施方式中，所述基于油的溶液包含鲸蜡醇和水杨酸。

在某些实施方式中，所述基于油的溶液包含硅藻土和吐温20。

本发明的其他目的通过提供一种将本发明的实施方式的杀幼虫剂/杀蛹剂乳剂作为杀幼虫剂/杀蛹剂施用以杀灭蚊子的幼虫和蛹的方法来实现。

在某些实施方式中，所述幼虫和蛹选自冈比亚按蚊和斯氏按蚊(疟疾的主要媒介)以及埃及伊蚊和白纹伊蚊(登革热、寨卡病毒、基孔肯雅热和黄热病的主要媒介)。

通过考虑以下附图和随附的详细描述，本发明的其他目的及其特定特征和优点将变得更加显而易见。应该理解的是，详细说明和具体实例虽然指示了本发明的优选实施方式，但是仅旨在用于说明的目的，而并不意图限制本发明的范围。

附图说明

图1示出了用不同的制剂处理的具体为斯氏按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊四种蚊子物种的存活测试的图。

具体实施方式

在下面的描述中，出于解释的目的阐述了许多细节。然而，本领域普通技术人员将意识到，可以在不使用这些特定细节的情况下实践本发明。

根据本发明的杀蛹和/或杀幼虫组合物的制剂旨在借助于低毒性的活性成分和赋形剂抑制斯氏按蚊和冈比亚按蚊(疟疾的主要媒介)；白纹伊蚊和埃及伊蚊(几种虫媒病毒的载体)的幼虫和蛹。

根据本发明的组合物包含鲸蜡醇。

鲸蜡醇，也称为1-十六烷醇和棕榈醇，是一种固体有机化合物，并且是醇类化合物的成员。它的化学式为ch3(ch2)15oh。在室温下，鲸蜡醇为蜡状白色固体或薄片的形式。它属于脂肪醇类。随着商业捕鲸的消亡，鲸蜡醇不再主要由鲸油生产，而是作为石油工业的最终产品，或由植物油(如棕榈油和椰子油)生产。从功能的角度来看，必须指出，已经进行的具体研究表明鲸蜡醇是双翅目的优良杀蛹化合物。

鲸蜡醇是一种长链醇，在医药和化妆品中可以用作乳化剂、某些产品的稳定佐剂、润肤剂、增粘剂、增泡剂和遮光剂。根据本发明的组合物还可包含精油：特别地，在抑制蚊子的幼虫和蛹中显示出最佳效果的实施方式包括薄荷精油。薄荷油是从薄荷(menthaxpiperita)的叶子中提取的精油。薄荷油因其芳香特性而被使用并且作为调味剂，并且用于治疗消化系统和呼吸系统疾病以及疼痛。所述精油确保在其中分布有该产品的水(池塘、湖泊或任何其他种类和/或大小的天然或人工水体)的自由表面上形成薄膜；这种厚度极小的薄膜可确保幼虫和/或蛹与所述化合物接触。

所述组合物还可包含酪氨酸。酪氨酸是细胞用于合成蛋白质的20种标准氨基酸之一。它是具有极性侧基的非必需氨基酸。它的密码子是uac和uau。酪氨酸实际上存在于许多高蛋白食品中，例如鸡肉，火鸡，鱼，牛奶，酸奶，干酪，奶酪，花生，扁桃仁，南瓜籽，芝麻籽，大豆制品，利马豆，鳄梨和香蕉。

所述组合物还可包含吐温20。它是广泛用于生化应用中的非离子型去污剂。它已被用作乳化剂，用于制备稳定的水包油型乳剂。

所述实施方式包含水杨酸。水杨酸是一种单羟基苯甲酸，具有细菌抑制、杀真菌和角质软化作用。它可溶于水，在自然中可生物降解，生物蓄积潜力低。水杨酸及其衍生物也用于制药和化妆品工业。同样地，水杨酸在环境温度下也是固体类型的物质，并且在这种情况下也通过加热而发生溶解用的液化。

硅藻土是由称为硅藻的微小水生生物的化石残骸制成的。它们的骨架由称为二氧化硅的天然物质制成。将硅藻土添加到配方中以摄入后破坏幼虫和蛹。

薄荷油是无色的浅黄色液体，具有强烈的宜人的气味和强烈的芳香味。薄荷油是在调味料、药物、糖果和药品中使用最广泛的精油。

桉树精油获自高大常绿的桉树的新鲜叶子。根据其在世界上的位置，该树在科学上被归类为蓝桉(eucalyptusglobulus)(也被称为发烧树(fevertree))、蓝胶树(bluegumtree)或长喙桉树(stringybarktree)。桉叶油的众多健康益处已经引起了全世界的关注，并且刺激了人们对其在芳香疗法和传统医学中的用途的探索。

根据所述实施方式，一种可能的赋形剂是水。

从实践的角度来看，下文在材料和方法中引用了在申请中有关具有无可争议的有效性且毒性可忽略的特定制剂的一些可能的实施方式。

所涉及的赋形剂量应被纯粹认为是定义各种组分之间的比例。

因此，发现本发明实现了预期的目标和目的。

这样构思的本发明易于进行多种修改和变型，所有这些修改和变型都在所附权利要求的范围内。

所有细节可以进一步用其他技术上等效的细节代替。

此外，应注意，在专利申请过程中发现的任何已知内容均应理解为不主张权利，并且是放弃声明(disclaimer)的主题。

实际上，所使用的材料以及形状和尺寸可以是根据需要的任意材料以及形状和尺寸，而不因此放弃所附权利要求的保护范围。

材料/方法

组分

组分：酪氨酸，鲸蜡醇，水杨酸，薄荷油，桉叶油，硅藻土和吐温20。

测试了几种制剂以评价它们的杀幼虫/杀蛹活性：

-i)在200ml繁殖水中溶解的0.03g酪氨酸；

-ii)溶解到100ml薄荷油中的10g鲸蜡醇和10g水杨酸溶解(溶液a)。

-iii)溶解到40ml桉叶油和60ml薄荷油中的10克鲸蜡醇、10克水杨酸、5克硅藻土和20滴吐温20(溶液b)；

在使用前将溶液a和b剧烈振摇以获得优异的乳剂。

-iv)除了5滴溶液a外，将0.03g酪氨酸直接溶解到含有幼虫、蛹的繁殖水中(200ml)；

-v)除了5滴溶液b外，将0.03g酪氨酸直接溶解到含有幼虫、蛹的繁殖水中(200ml)；

-vi)仅含有繁殖水的阴性对照。

幼虫/蛹的收集和饲养

在卡梅里诺大学(camerinouniversity)的蚊子养虫室中，将冈比亚按蚊、斯氏按蚊、白纹伊蚊和埃及伊蚊的幼虫和蛹饲养在200ml的繁殖水中，并喂食小鼠干粮粉。成虫前的发育阶段在以下条件下生长：28℃，80％相对湿度和12h光照后12h黑暗的光周期。

杀幼虫/杀蛹测试

基于用于杀幼虫测定的who标准化规程和指南进行了蚊子的杀幼虫/杀蛹测试。

使用不同的实验产品进行了筛选，评估包括第一、第二、第三和第四龄幼虫和蛹的群体的死亡率：

-在200ml繁殖水中溶解的0.03g酪氨酸；

-溶解到100ml薄荷油中的10g鲸蜡醇和10g水杨酸溶解(溶液a)。

-溶解到40ml桉叶油和60ml薄荷油中的10克鲸蜡醇、10克水杨酸、5克硅藻土和20滴吐温20(溶液b)；

在使用前将溶液a和b剧烈振摇以获得优异的乳剂。

-除了5滴溶液a外，将0.03g酪氨酸直接溶解到含有幼虫、蛹的繁殖水中(200ml)；

-除了5滴溶液b外，将0.03g酪氨酸直接溶解到含有幼虫、蛹的繁殖水中(200ml)；

-仅含有繁殖水的阴性对照。

对于每种蚊子物种，为了减少幼虫应激，在所述测定前24小时，我们准备了6个托盘[15cm(宽)，15cm(长)和6.5cm(深)]，每个受测产品一个，含200ml繁殖水，其中包括40只蚊幼虫(第一、第二、第三、第四龄)和10个蛹。每个测定包括3个重复。

对于成虫前发育阶段(幼虫和蛹)，从开始就每30分钟记录一次死亡率。幼虫和蛹没有做任何动作就被认为死亡。记录死亡的幼虫和蛹，并计算平均死亡百分率。

结果与讨论

单独的酪氨酸在施用后24小时后引起约60％的幼虫死亡率。溶液a和b显示了在施用后18小时后确定70％的幼虫死亡，而所有蛹在大约一小时内死亡。由在200ml繁殖水中除了5滴溶液a和b以外还含0.03g酪氨酸组成的杀幼虫剂显示了更强的杀幼虫/杀蛹活性，确定了施用2小时后100％蚊幼虫阶段的死亡和15分钟后100％蛹的死亡。还对于每个物种，准备了其中仅在200ml繁殖水中包括40个幼虫(从第一龄到第四龄)和10个蛹的阴性对照。从阴性对照样品中未记录到死亡的幼虫或蛹。

该结果显示，所有测试的化合物执行协同和互补作用，从而增加了单独测试的每种单一成分的功效。

结论

发明人已经开发出创新型低成本和安全的杀幼虫和杀蛹组合物，其特征在于对动物(特别是鱼类)和人类的毒性很小。

开发了所述杀幼虫/杀蛹制剂作为对抗斯氏按蚊、冈比亚按蚊、埃及伊蚊和白纹伊蚊蚊子物种(几种疾病的媒介，例如，疟疾、登革热、寨卡病毒、基孔肯雅热和黄热病)的工具；通过使用少量选定的低毒性成分能够杀灭幼虫和蛹阶段。

本发明的主要优点之一是其上述杀灭蚊子的成年前阶段的快速作用时间。此外，该杀幼虫制剂的最重要特征与其化合物的性质有关：由于酪氨酸对蚊子的生理至关重要，因此它不会经历蚊子对常见杀幼虫剂和杀虫剂中存在的合成化合物产生的抗药性机制。

结果表明，我们的安全的杀幼虫剂/杀蛹剂可以是对人和动物的毒性和副作用尚未得到很好表征的常用化学产品的有力竞争者。

至此已经描述了用于实践本发明方法的几个实施方式，可以容易地理解其优点和目的。在不脱离本发明的范围的情况下，本领域技术人员可以并且能够做出与以上描述的变化。

因此，本发明不受所描述的实施方式的限制，所述实施方式仅以示例的方式给出，而不是以限制的方式给出。

参考文献

rodolfoquevedoandnelson-dallosmarthal.(2015).larvicidalactivityofsingleandmacrocyclictyrosinederivativesagainstthreeimportantvectormosquitoes.researchonchemicalintermediates(单和大环酪氨酸衍生物对三种重要媒介蚊的杀幼虫活性).41(8):5283–5292.

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