一种用于生物样本超低温冷冻及封闭式保存的冷冻载杆的制作方法

本实用新型涉及生物样品保存领域，尤其涉及一种用于生物样本超低温冷冻及封闭式保存的冷冻载杆。

背景技术：

医学、生命科学(包括辅助生殖)、食品、化工等领域均需要用到超低温保存。超低温保存需要使用冷源，冷源包括但不限于液氮等常规制冷剂。

以人辅助生殖领域为例，该领域需要进行胚胎、卵子等细胞样本的冷冻保存，液氮是主要的冷源。玻璃化冷冻因为降温速率快(20,000℃/min以上)、复苏存活率高(≥95％)成为目前人胚胎和卵子冷冻的主要方法。然而，玻璃化冷冻技术潜在的污染风险一直困扰着辅助生殖从业人员。在玻璃化冷冻过程中，需要将装载在冷冻载杆上的胚胎样本与液氮等冷源直接接触。这是因为，只有直接接触液氮才能达到超快速降温，从而保证复苏存活率。而市售液氮等冷源在生产、运输以及液氮罐等其他储存罐内长期保存等环节均有可能被细菌、病毒、真菌等病原微生物污染。致病微生物可以耐受低温并在复苏后具有污染和交叉感染风险，所以开放式玻璃化冻存的胚胎具有潜在的污染风险。为了避免污染或交叉污染，封闭式拉细麦管(cps，closedpulledstraws)、麦管套麦管(straw-in-straw)和rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法被应用于辅助生殖临床，但存活率欠佳，未能广泛使用。cps、麦管套麦管和rapid-i等封闭式玻璃化冷冻方法均是将装载胚胎的冷冻载体插入外套管封闭后再投入液氮实现样本冻结，降温速率慢(仅约2,000℃/min左右)，导致解冻存活率低。

中国专利(申请号201720870512.2)提供一种在液氮工厂生产无菌液氮的设备和方法。虽然生产的液氮无菌，但液氮在运输、储存和使用过程中维持无菌的状态极其困难。而且，细菌或病毒感染患者的胚胎还可能在液氮罐内间接将病原传递给其他“健康”胚胎，导致胚胎发生交叉感染。

技术实现要素：

本实用新型所要解决的技术问题是，提供一种用于超低温冷冻及保存方法的样品载体，尤其是一种用于生物样本超低温冷冻及封闭式保存的冷冻载杆。通过使用本实用新型的载体，能够在可封闭套管中按照开放式载体的操作方法实现生物样本的无菌保存，彻底避免开放式载体玻璃化冷冻的污染或交叉污染风险，并且不影响降温速率、不会降低胚胎存活率。

在一个实施方案中，本实用新型提供的冷冻载杆可用于超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述方法包括如下步骤：

1)提供一具有开口的无菌容器；

2)在所述无菌容器内盛装或制备制冷剂；

3)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述制冷剂中进行玻璃化冷冻；

4)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。

在另一个实施方案中，本实用新型的载体用于超低温冷冻及封闭式保存方法，其中所述方法包括如下步骤：

1)提供一具有开口的无菌容器；

2)将所述无菌容器置于初始冷源中，且所述无菌容器开口的高度高于所述初始冷源的液面层；

3)在所述无菌容器中形成液化气体，作为无菌制冷剂；

4)将承载在载体上的待冷冻样品置于所述无菌制冷剂中进行玻璃化冷冻；

5)密封所述无菌容器，并将所述密封无菌容器与密封在其中的玻璃化冷冻样品一起超低温保存。

在一个实施方案中，前述方法的无菌容器是管状容器；在更优选的实施方案中，所述管状容器一端开口；在更优选的实施方案中，所述管状容器具有侧面开口；在更优选的实施方案中，所述管状容器的主体部分是圆柱形；在更优选的实施方案中，所述管状容器的内径为1mm至30mm，优选1.5mm至20mm，更优选2mm至10mm，更优选为2.5mm至6mm，更优选为3至5mm，更优选为3.5至4.5mm；在更优选的实施方案中，所述管状容器的长度为2cm至40cm，优选5cm至30cm，更优选10cm至29cm，更优选为14cm至28cm，最优选为14cm或28cm。在一个更优选的实施方案中，所述管状容器在密封后的长度不变。

与在常规开放式环境下进行玻璃化冷冻不同，前述超低温冷冻在容积相对较小的管状容器中进行。在这种情况下，冷冻载体的外径和外套管(即管状容器)内径会非常接近。当承载有待冷冻样品的冷冻载体插入外套管时，温度急剧升高，外套管内的液氮、液态空气等制冷剂瞬间蒸发，产生的气流对载杆以及其上的样本会产生向上或者侧向的冲力。这种冲力由于环境条件以及操作动作的不同，方向存在极大的不确定性，将导致冷冻载体以及载体上的生物样品上窜或者向不确定的方向运动，影响冷冻效果，从而降低胚胎等生物样品的存活率，严重时会将样品冲离冷冻载体，造成冷冻失败。

本实用新型提供的冷冻载体则能够解决上述问题，明显提高胚胎等生物样品的存活率。在一个实施方案中，所述用于承载待冷冻样品的载体是冷冻载杆；在更优选的实施方案中，所述冷冻载杆包括样品承载端和手持端；在更优选的实施方案中，所述手持端呈中空且两端开口的结构。

在另一个实施方案中，本实用新型提供的冷冻载杆包括样品承载端、手持端以及在样品承载端和手持端之间的连接部分；在更优选的实施方案中，所述连接部分呈中空且两端开口的结构；在更优选的实施方案中，所述手持端和连接部分均呈中空且两端开口的结构。相比于现有技术中的实心杆，空心的手持端和连接部分可以让部分混乱的气流从中空管子中间穿过，按指定方向排向上方。

在另一个实施方案中，本实用新型提供的冷冻载杆所述样品承载端端面呈弧形卷起。端面呈弧形，能够有效保护其承载的冷冻样品在制冷剂“往上冲”时仍保持在原位，而不会被急剧气化的制冷剂“冲走”。在另一个实施方案中，所述样品承载端的两个侧面和端面中的至少一个呈弧形卷起，实际上这样就可以起到对气流的引导和阻挡作用，因为根据我们的实验发现，虽然气流的产生是必然的，但是通常情况下，只要有一个边缘翘起，就会挡住部分窜动的气流，起到较好的气流导向作用。在这种情况下，生物样本基本不会受到大的冲击，可以比较稳定的待在原位。在更优选的方案中，所述样品承载端的端面和两个侧面均呈弧形卷起。这种形状的冷冻载杆能够为其承载的冷冻样品提供更好的保护。

在另一个实施方案中，所述冷冻载杆直接插入无菌容器中，样品承载端在承载有样品后也不需要用护套保护后再插入无菌容器(外套管)内。这与目前公知的开放载杆不同，如cryotop等载杆都需要有保护套对承载有样品的样品承载端提供保护。这是因为，本实用新型提供的载杆在使用时，在承载样品后，将载杆直接插入到盛装有液态空气(液氮含量约85％)等制冷剂的外套管中，对样品进行玻璃化冷冻，由于是洁净过程产生的制冷剂，所以可以直接放入而不必担心产生污染问题。当然，由于没有保护套的保护，样品承载端需要具有一定的硬度，以避免弯折可能会损伤样本。同时，冷冻介质产生的气流也会对冷冻载杆上的样本产生各种影响。

本实用新型提供的冷冻载杆既可用于封闭式冷冻，也可以用于非封闭式冷冻。在用于封闭式冷冻时，在完成冷冻后，不需要将载杆从外套管中取出，而是将载杆封闭在外套管中，然后将冷冻样品、载杆以及外套管一起进行常规冷冻保存。

附图说明

图1是超低温冷冻及封闭式保存方法的装置的示意图；

图2是超低温冷冻及封闭式保存方法的装置的截面示意图；

图3是本实用新型提供的用于超低温冷冻及封闭式保存的一个载杆的纵截面示意图。

图4是本实用新型提供的用于超低温冷冻及封闭式保存的一个载杆的纵截面示意图。

图5是本实用新型提供的用于超低温冷冻及封闭式保存的一个载杆的纵截面示意图(c)和横截面示意图(d)。

具体实施方式

实施例1.超低温冷冻及封闭式保存方法

以下结合图1和图2详述本实用新型提供的载体可适用的超低温冷冻及封闭式保存方法。

步骤1、提供一容器b。所述容器b为一敞口结构，其中所述容器b的敞口即为第二开口11。所述容器b的尺寸也可根据需求进行选择，本实用新型对此不进行限定。在本实施例中，所述容器b为长260mm*宽150mm*深115mm无盖泡沫箱。所述容器b内盛放有一初始冷源12。在本实施例中，所述容器b内盛放的所述初始冷源12为市售的液氮。所述初始冷源12具有一液态层12a及一位于所述液态层12a上方的蒸汽层12b，其中，所述蒸汽层12b为液态层12a的液体挥发形成。为了清楚显示两者的区别，在附图中采用不同的阴影线绘示所述液态层12a及所述蒸汽层12b。具体地说，所述容器b的深度是115mm，所述容器b内初始冷源12的液态层12a的深度为90mm，蒸汽层12b的厚度为25mm，即蒸汽层12b的厚度等于容器b的深度与液态层12a的深度之差。

步骤2、提供一无菌容器a，其具有一第一开口10。所述无菌容器a为塑料管，其内底部具有金属配重块；所述容器开口位于顶端。所述管状容器的直径(内径)分别为3.5mm。塑料管开口处与millipore-0.22um滤器连接。

步骤3、将所述无菌塑料管(外套管)插在试管架后置于盛有液氮的泡沫盒(容器b)内，利用液氮冷却制得无菌液态空气。在进行的对比实验中，部分塑料管开口10的高度高于所述初始冷源12的蒸汽层12b，即所述开口10突出于所述蒸汽层12b的界面，其并未被所述蒸汽层12b覆盖(即无菌容器a开口处高于容器b的上沿)；而剩余部分塑料管开口10的高度低于所述初始冷源12的蒸汽层12b，但高于所述初始冷源12的液态层12a(即无菌容器a开口处位于液面层12a与容器b上沿之间的蒸汽层12b内)。在该步骤中，所述初始冷源12接触所述塑料管的外侧壁，使得所述塑料管内壁的温度与所述初始冷源12的温度无限接近，所述塑料管内的空气(主要是氮气和氧气)在该温度下会冷凝液化，则随着空气的液化，所述塑料管内会形成负压，外部空气或12b蒸汽层内的氮气会不断进入所述塑料管内，并液化，以形成无菌制冷剂13。其中，所述空气为经过净化的空气。

步骤4、将一承载有冷冻样品的载体15投入所述无菌制冷剂13中进行玻璃化冷冻。在附图中采用虚线绘示所述承载有样品的载体15。在本实施例中，所述承载有样品的载体15是冷冻载杆。

步骤6、去除所述无菌容器开口10处的湿气或雾气的步骤。具体地说，制备无菌冷源过程中，在所述开口10处可能会有水汽等沉积，在密封所述开口10之前，需采用热源靠近开口10或无菌纱布擦拭第一开口10处等方式去除水汽，以便于密封所述第一开口10。

步骤7、密封所述无菌容器的开口10，并将密封的所述无菌容器a置于一含有制冷剂的存储罐中存储，以使得样品能够进行长期存储，待需要使用时再取出，解冻后使用。

实施例2：用于超低温冷冻及封闭式保存的载杆

图3显示了一个冷冻载杆示意图。该图显示了冷冻载杆纵截面。如图3所示，本实用新型的冷冻载杆包括样品承载端21和手持端23。其中所述手持端为中空的管状结构，中空部分231的两端有开口。传统实心手持端，由于中间没有气体通道，造成液化空气一旦气化，产生的大量气体只能沿着手持端外壁和外套管之间狭小的间隙流动，会让整个载杆产生不期望的移动，进而很可能产生不期望的碰撞。与手持端为实心的结构相比，中空结构可以减少载杆的横截面积，并为上冲的气流提供一个相对“宽阔”的快速消散通道，能够有效避免冷冻载体随着急剧气化的制冷剂“上蹿”和发生不期望的移动，气流变平缓，也有利于生物样本的稳定。

图4显示了另一个冷冻载杆示意图。该图显示了冷冻载杆纵截面。如图4所示，本实用新型的冷冻载杆包括样品承载端21、手持端23和位于所述样品承载端和手持端之间的连接部分22。其中所述手持端23为扁平结构，以易于手持操作；样本承载端21为一薄片，该承载端21通常为塑料制品，但是具备一定的厚度和强度，可以保证冷冻过程中整个承载端21不产生弯曲或者变形。连接部分22为一中空的管状结构，中空部分221有两端开口。与连接部分为实心的结构相比，中空结构能够有效避免冷冻载体及生物样本随着急剧气化的制冷剂“上蹿”产生不期望的移动或者振动。

图5显示了另一个冷冻载杆的示意图，其中图5c为纵截面图，图5d为横截面图，本实用新型的冷冻载杆包括样品承载端21、手持端23和位于所述样品承载端和手持端之间的连接部分22。其中所述手持端23为扁平结构，以易于手持操作。连接部分22为一中空的管状结构，中空部分221的两端开口。样本承载端21为一薄片，以承载样品。样品承载端21的两个侧面212、213和端面211中的至少一个呈弧形卷起，比如端面211呈弧形卷曲朝上的时候，就可以利用其形成的弧形曲面，保护放在其弧形曲面内侧的载体样品免受急剧气化的制冷剂“上蹿”带来的影响。当然，由于制冷剂气化产生的气流是各个方向的，所以侧面212和/或213向上卷起一个弧度，也能起到一定的阻挡和保护作用。因为根据目前的实验状况分析，虽然气流整体是向上运动，但是在各个高度层面上，并没有确定的流动方向，所以仅有一面或者两面向上卷起，除了可以挡住卷边外侧吹向样本的气流，引导从下方吹向样本的气流之外，从生物样本上方乱入的气流也会给样本施加朝向卷起侧边的力，实际上也都可以起到降低生物样本移位的作用。在最理想情况下，承载端的端面211以及两个侧面212和213均呈弧形卷起，虽然这种形状工艺要求稍微高一些，对材料的要求也高一些，但可以在这三个面之间形成一承载凹部。样品承载在该凹部内，类似放在勺子的中央，虽然不是四面封闭，但是已经能够最大限度地保护待冷冻样品，避免待冷冻样品被急剧气化的制冷剂冲走或偏离正常位置。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

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