一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法与流程

本发明属于植物学领域，涉及一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法。

背景技术：

创建小麦干旱早衰表型旨在为进一步探究自噬调控苗期早衰的分子机理，挖掘优异抗衰老基因提供筛选标准。大量研究表明，干旱可以引起植物发生细胞自噬。当自噬发生时，细胞内会出现大量将有害物质清除掉的自噬泡，自噬相关蛋白atg8-pe的表达量显著增加，进而提高植物的抗旱性。目前阻断干旱胁迫下植物细胞自噬的方法，主要是通过干扰或敲除与自噬相关基因(atg8或atg18)的方法。这些方法虽然精准成熟，但实验操作步骤比较繁琐，实验所需成本高，获得所需植株表型的周期相对较长，而且成功率相对较低。如病毒介导的基因沉默技术，从病毒载体构建到侵染，再到表型特征观察需要2周，而基因干扰或基因编辑需要构建干扰载体或基因编辑载体，然后再进行遗传转化，获得阳性植株苗至少需要3个月，但不是每一次实验都能成功，成功率较低且耗时漫长。

因此，如何缩短上述方法所需的时间、降低实验成本、操作容易且提高实验效率，提供一种能够快速创建小麦幼苗干旱早衰表型的方法，成为本领域亟待解决的问题。

技术实现要素：

针对现有技术中的上述情况，本发明的发明人提供了一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法，该方法通过细胞自噬抑制剂抑制自噬泡膜状结构形成所必需的磷酸肌醇3磷酸激酶(pi3k)活性，创建小麦幼苗干旱早衰表型的时间则只需3天。通过本发明提供的方法，能够简单、快速的验证干旱胁迫下小麦细胞自噬功能，对开展其它植物干旱胁迫下的细胞自噬研究也提供重要的方法学基础。

与现有的基因编辑方法不同，本申请的方法，是通过细胞自噬抑制剂抑制自噬泡膜状结构形成所必需的磷酸肌醇3磷酸激酶(pi3k)活性实现的，并未对基因层面进行干扰或者编辑，因此其成功率明显高于现有技术，本发明的具体技术方案如下：

一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法，具体操作步骤如下：

1.选取籽粒饱满、大小一致、当年收获的小麦种子，置于恒温光照培养箱中培养10天；。设置培养温度25℃，日照16小时，黑暗8小时；

2.将20棵生长一致的小麦幼苗分成处理组和对照组，每组各10棵；

3.处理组置于20g/ml的peg-8000溶液中，并分别添加2mm、5mm和8mm的3-甲基腺嘌呤作为三个处理组，而对照组则只置于20g/ml的peg-8000溶液中，培养时间均为72小时；

4.实验处理完毕，观察处理组和对照组小麦植株表型差异；

5.按照现有方法分别提取处理组和对照组小麦叶片的总蛋白；

6.小麦叶片总蛋白的sds-page凝胶电泳，所用分离胶浓度为12％，电压100伏，电泳时间1.5小时；

7.按照现有方法对上述凝胶中的蛋白进行westernblot检测，利用小麦atg8的多克隆抗体识别凝胶中小麦叶片中的目的蛋白，检测atg8-pe形成的多少，条带越弱，表示抑制效果越明显，干旱效果越明显，小麦幼苗干旱早衰生理表型创建成功。

上述方法利用peg-8000处理小麦幼苗模拟干旱条件，较之现有模拟干旱条件的方法，既能维持幼苗较长时间的生长，又能观察到明显的干旱早衰表型，大大缩短了建立模型的时间，方便了研究人员的观察；再通过施加适当浓度的细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-ma)阻断干旱引起的小麦细胞自噬，进而对小麦苗期生理表型进行分析，建立干旱胁迫下小麦细胞自噬相关的生理表型模型；根据检测atg8-pe形成的条带多少即可判定模型构建成功与否，其中atg8-pe形成的条带越弱，并且干旱效果非常明显，则表示模型构建成功。

上述处理组中3-甲基腺嘌呤的浓度过小，抑制效果不明显；浓度过大会对幼苗造成毒害，故而选择上述的添加浓度；

通过比对后发现，当施加细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤的浓度为5mm时，小麦幼苗出现植株萎蔫和根部变短，说明细胞自噬受到抑制后，干旱产生的一些有害物质不能被清除，进而导致了幼苗表现明显早衰和根部生长迟缓现象(图1)；westernblot检测结果显示，与自噬相关的atg8-pe蛋白表达量明显下降，进一步证明细胞自噬确实受到明显抑制(图2)，表明小麦幼苗干旱早衰生理表型创制成功。

可见本发明所提供的利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法，创建小麦幼苗干旱早衰表型的时间只需3天，实验成本低、成功率可达99％以上，且易操作和观察。通过本发明提供的方法，能够简单、快速的验证干旱胁迫下小麦细胞自噬功能，对开展其它植物干旱胁迫下的细胞自噬研究也提供重要的方法学基础。

附图说明

图1为实施例中处理组和对照组生长72小时的小麦幼苗表型图片，

通过图1可知，处理组幼苗表现明显早衰和根部生长迟缓现象；

图2为westernblot检测结果示意图，图中β-actin用作内参，

由图可知，处理组中与自噬相关的atg8-pe蛋白表达量明显下降，进一步证明细胞自噬确实受到明显抑制。

具体实施方式

实施例1

一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法，具体操作步骤如下：

1.选取籽粒饱满、大小一致、当年收获的小麦种子，置于恒温光照培养箱中培养10天；。设置培养温度25℃，日照16小时，黑暗8小时；

2.将20棵生长一致的小麦幼苗分成处理组和对照组，每组各10棵；

3.处理组置于20g/ml的peg-8000溶液中，并分别添加2mm、5mm和8mm的3-甲基腺嘌呤作为三个处理组，而对照组则只置于20g/ml的peg-8000溶液中，培养时间均为72小时；

4.实验处理完毕，观察处理组和对照组小麦植株表型差异。

实施例2

一种利用细胞自噬抑制剂创建小麦幼苗干旱早衰生理表型的方法，其表型差异的判定方法，具体检测方法为：

1.按照常规方法，分别提取实施例1中处理组和对照组小麦叶片的总蛋白。

2.小麦叶片总蛋白的sds-page凝胶电泳，所用分离胶浓度为12％，电压100伏，电泳时间1.5小时。

3.按照现有方法对上述凝胶中的蛋白进行westernblot检测，利用小麦atg8的多克隆抗体识别凝胶中小麦叶片中的目的蛋白，检测atg8-pe形成的多少，条带越弱，表示抑制效果越明显，干旱效果越明显，小麦幼苗干旱早衰生理表型创建成功。

更为具体的步骤为：

(1)各取实施例1获得的对照组和实验组小麦叶片0.2g，在液氮中充分研磨后，分别加入植物组织蛋白裂解液500μl，冰上裂解15min，然后12000r/min离心15min，取上清液400μl，并加入100μl5x蛋白上样缓冲液，沸水浴10min，-80℃保存用于后续实验。

(2)将提取的小麦叶片总蛋白每孔加样20μl，进行sds-page凝胶电泳；所用分离胶浓度为12％，电压100伏，电泳时间1.5小时；

(3)采用湿法转膜，将植物总蛋白转移到硝酸纤维素薄膜上，用兔源小麦atg8的多克隆抗体作为一抗，过夜孵育，然后碱性磷酸酶标记的山羊抗兔的二抗孵育5h。最后用nbt和bcip发色液进行发色，显现抗体识别到的目的带。

对处理组和对照组的小麦幼苗进行观察，结果发现处理组施加细胞自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤后，小麦幼苗出现植株萎蔫和根部变短，说明细胞自噬受到抑制后，干旱产生的一些有害物质不能被清除，进而导致了幼苗表现明显早衰和根部生长迟缓现象(图1)，其中3-甲基腺嘌呤的浓度为5mm时效果最好，3-甲基腺嘌呤的浓度为8mm时效果与5mm时基本持平，因此从成本考虑，优选采用5mm作为最佳浓度进行模型的创建；westernblot检测结果显示，与自噬相关的atg8-pe蛋白表达量明显下降，进一步证明细胞自噬确实受到明显抑制(图2)。

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