β-内酰胺酶抑制剂的制作方法

2021-01-08 13:01:37|

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本发明涉及一种β-内酰胺酶抑制剂等。

背景技术：

针对细菌感染症，通常采用通过抗菌药的作用来抑菌或杀菌致病菌的治疗方法。然而，由于抗菌药的使用，会导致对于该抗菌药的耐药菌的出现。例如，对于β-内酰胺类抗菌药，存在会产生具有分解这类药物的活性的酶(β-内酰胺酶)的耐药性菌。迄今为止，针对新出现的产β-内酰胺酶菌，开发并使用了新结构的β-内酰胺类抗菌药。其中，碳青霉烯类抗菌药被用作最新的β-内酰胺类抗菌药。

但是，由于碳青霉烯类抗菌药的使用，出现了会产生具有分解该抗菌药的活性的酶(b类β-内酰胺酶，金属-β-内酰胺酶)的耐药性菌，从而产生了问题。该耐药性菌对包含碳青霉烯类抗菌药在内的多种β-内酰胺类抗菌药显示出耐药性。

针对β-内酰胺类抗菌药耐药性菌，将导致耐药性机制的酶即β-内酰胺酶的抑制剂与适当的β-内酰胺类抗菌药并用是一种有效的对策(专利文献1～3)。但是，针对b类β-内酰胺酶，能够用于临床的抑制剂尚未投入实际使用。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2015-155435号公报

专利文献2：国际公开第2013/180197号公报

专利文献3：日本特表2015-512440号公报

技术实现要素：

发明所要解决的课题

本发明的课题在于：提供一种具有β-内酰胺酶抑制活性的化合物。优选本发明的课题在于：提供一种具有b类β-内酰胺酶抑制活性的化合物。

用于解决课题的技术方案

本发明人鉴于上述课题进行了精心研究，结果发现，具有平面性的5元环的特定位置被氨基磺酰基和羧基取代而成的化合物所代表的通式(1)所示的化合物具有β-内酰胺酶抑制活性，特别是具有b类β-内酰胺酶抑制活性。本发明人基于该见解进一步进行研究，从而完成了本发明。即，本发明包括下述的方式。

项1.一种β-内酰胺酶抑制剂，其含有通式(1)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物，

式中：r¹表示-c(-r^a)-；r²表示-n(-r^b)n-、-o-或-c(-r^a)-；在r²为-n(-r^b)n-或-o-的情况下，r³表示-c(-r^a)-，在r²为-c(-r^a)-的情况下，r³表示-s-；r^a相同或不同，表示氢原子、卤素原子或可以被氨基取代的烃基；r^b表示氢原子、卤素原子、可以被取代的氨基或可以被氨基取代的烃基；n表示0或1；r⁶表示氢原子或烃基；r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烃基，或者r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成环；由实线和虚线的双线所示的键表示单键或双键。

项2.如项1所述的抑制剂，其中，上述β-内酰胺酶为b类β-内酰胺酶。

项3.如项1或2所述的抑制剂，其中，所述β-内酰胺酶为b1类β-内酰胺酶。

项4.一种β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌效果的增强剂，其含有通式(1)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物，

项5.一种抗菌剂，其含有通式(1)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物、以及β-内酰胺类抗菌化合物，

项6.一种抗菌剂，其含有β-内酰胺类抗菌化合物，并以与通式(1)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物联合给药的方式使用，

式中：r¹表示-c(-r^a)-；r²表示-n(-r^b)n-、-o-或-c(-r^a)-；r²为-n(-r^b)n-或-o-的情况下，r³表示-c(-r^a)-，在r²为-c(-r^a)-的情况下，r³表示-s-；r^a相同或不同，表示氢原子、卤素原子或可以被氨基取代的烃基；r^b表示氢原子、卤素原子、可以被取代的氨基或可以被氨基取代的烃基；n表示0或1；r⁶表示氢原子或烃基。r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烃基，或者r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成环；由实线和虚线的双线所示的键表示单键或双键。

项7.一种通式(1a)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物，其中，

式中：r²表示-n(-r^b)-或-o-；r^a相同或不同，表示氢原子、可以被氨基取代的直链或支链烷基(其中，在r²为-n(-r^b)-的情况下，碳原子数为1～5，在r²为-o-的情况下，碳原子数为2～5)、可以被氨基取代的碳原子数3～7的环状烷基或者可以被氨基取代的苯基；r^b表示氢原子、可以被直链或支链烷基取代的氨基或者可以被氨基取代的烷基；r⁶表示氢原子；r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烷基(其中，不包括r⁷和r⁸两者为烷基的情况)，或者r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成环。

项8.如项7所述的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物，其中，r^b所示的烷基为碳原子数1～4的直链烷基。

项9.一种药物，其含有项7或8所述的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物。

项10.一种试剂，其含有项7或8所述的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物。

发明的效果

根据本发明，能够提供β-内酰胺酶抑制活性、特别是具有b类β-内酰胺酶抑制活性的化合物。通过利用本发明，能够提供具有β-内酰胺环的现有的β-内酰胺酶抑制剂和β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌效果的增强剂等。另外，本发明的化合物的毒性较低，因此能够更安全地使用。

附图说明

图1表示药敏试验(试验例1等)的试验方法的概要。

图2表示试验例2的β-内酰胺酶抑制活性测定试验的结果。纵轴表示亚胺培南(imipenem)残留分解活性，横轴表示测试物质的浓度。在各图表的上方示出所使用的b类β-内酰胺酶。

图3表示试验例3的药敏试验的结果。纵轴表示mic，横轴表示所使用的抗菌药和测试物质的种类(化合物a)和浓度(μg/ml)。各图分别表示各测试菌株的数据。

图4表示试验例4的药敏试验的结果。纵轴表示mic，横轴表示所使用的抗菌药和测试物质的种类(化合物a)和浓度(μg/ml)。各图分别表示各测试菌株的数据。

图5表示试验例5的通过x射线晶体结构分析得到的imp-1与化合物a的复合体结构的示意图。

图6表示试验例5的通过x射线晶体结构分析得到的vim-2与化合物a的复合体结构的示意图。

图7表示试验例5的通过x射线晶体结构分析得到的ndm-1与化合物a的复合体结构的示意图。

图8表示试验例5的通过x射线晶体结构分析得到的ndm-1与化合物i的复合体结构的示意图。

图9表示试验例7的毒性评价试验结果。纵轴表示反映活细胞的吸光度，横轴表示测试物质的浓度。横轴中，dmso表示未添加测试物质的情况。

图10表示试验例12的动物试验的结果。纵轴表示存活率，横轴表示实验用菌株(β-内酰胺酶表达株)感染后经过的天数。a表示测试物质(化合物a)。

图11表示在试验例13的动物试验中使用导入有编码imp-1的质粒的大肠杆菌株作为实验用菌株时的结果。纵轴表示存活率，横轴表示实验用菌株(β-内酰胺酶表达株)感染后经过的天数。i表示测试物质(化合物i)。

图12表示试验例13的动物试验中使用导入有编码ndm和vim的质粒的细菌(k.pnuemoniae)作为实验用菌株时的结果。纵轴表示存活率，横轴表示实验用菌株(β-内酰胺酶表达株)感染后经过的天数。i表示测试物质(化合物i)。

图13表示试验例14的动物试验的结果。纵轴表示存活率，横轴表示实验用菌株(β-内酰胺酶表达株)感染后经过的天数。x2d表示测试物质(化合物x2d)。

具体实施方式

在本说明书中，关于“含有”和“包含”的表述，包含“含有”、“包含”、“基本由……构成”和“仅由……构成”这些概念。

1.化合物

作为一种方式，本发明涉及一种由通式(1)所示的化合物、或其盐、水合物或者溶剂合物(在本说明书中，也将其记作“本发明的化合物”。)。下面对此进行说明。

<1-1.r¹、r²和r³>

r¹表示-c(-r^a)-。r²表示-n(-r^b)n-、-o-或-c(-r^a)。在r²为-n(-r^b)n-或-o-的情况下，r³表示-c(-r^a)-，在r²为-c(-r^a)-的情况下，r³表示-s-。r²优选为-n(-r^b)n-。

r^a相同或不同，表示氢原子、卤素原子或可以被氨基取代的烃基。在本发明的某个方式中，优选r^a为烃基。

作为r^a所示的卤素原子，可以列举例如：氟原子、氯原子、溴原子、碘原子等。

作为r^a所示的烃基，不受特别限制，可以列举例如：烷基、芳基等、以及这些基团任意组合而成的基团(例如，芳烷基、烷基芳基、烷基芳烷基)等。在本发明的某个方式中，优选烃基为烷基或芳基。在该方式中，在存在两个r^a的情况下，优选排除两个r^a均为芳基的情况。r^a所示的烷基中也包含直链、支链或环状(优选为直链或支链，更优选为直链)中的任意种。该烷基(直链或支链的情况下)的碳原子数不受特别限制，例如为1～12，优选为1～8，更优选为1～5，进一步优选为1～4，更进一步优选为1～2。该烷基(环状的情况下)的碳原子数不受特别限制，例如为3～7，优选为4～6。另一方面，在本发明的某个方式中，该烷基的碳原子数的下限例如为2、3、4、5、6、7、8。作为该烷基的具体例，可以列举：甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、正戊基、新戊基、正己基、3-甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基、正十一烷基、正十二烷基等。

r^a所示的芳基不受特别限制，优选碳原子数为6～12的芳基，更优选为6～12，进一步优选为6～8。该芳基也可以为单环式或多环式(例如2环式、3环式等)中的任意种，优选为单环式。作为该芳基，具体而言，可以列举例如：苯基、萘基、联苯基、并环戊二烯基(pentalenyl)、茚基、蒽基、并四苯基、并五苯基、芘基、苝基、芴基、菲基等，优选列举苯基。

r^a所示的芳烷基不受特别限制，可以列举例如：直链或支链的碳原子数1～6(优选为1～2)的烷基的氢原子(例如1～3个，优选为1个氢原子)被上述芳基取代而成的芳烷基等。作为该芳烷基，具体而言，可以列举例如：苄基、苯乙基等。

r^a所示的烷基芳基不受特别限制，可以列举例如：上述芳基的氢原子(例如1～3个，优选为1个氢原子)被直链或支链的碳原子数1～6(优选为1～2)的烷基取代而成的烷基芳基等。作为该烷基芳基，具体而言，可以列举例如：甲苯基、二甲苯基等。

r^a所示的烷基芳烷基不受特别限制，可以列举例如：上述芳烷基的芳香环上的氢原子(例如1～3个，优选为1个氢原子)被直链或支链的碳原子数1～6(优选为1～2)的烷基取代而成的烷基芳烷基等。

在r^a所示的烃基被氨基取代的情况下，其氨基不仅包含-nh2，也包含-nh2的氢原子被烃基取代而成的取代氨基。关于取代氨基中的烃基，与r^a所示的烃基同样。

r^b表示氢原子、卤素原子、可以被取代的氨基或可以被氨基取代的烃基。在本发明的某个方式中，优选r^b为氢原子或烃基，更优选r^b为烃基。关于r^b所示的卤素原子和r^b所示的可以被氨基取代的烃基，与关于r^a的上述记载同样。

作为r^b所示的可以被取代的氨基，可以列举例如：-nh2、-nh2的氢原子被烃基取代而成的取代氨基等。关于烃基，与r^a所示的烃基同样。

n表示0或1。在本发明的某个方式中，优选n为1。

<1-2.5元环>

在通式(1)中，由实线和虚线的双线所示的键表示单键或双键。包含该键的由通式(1)中的通式(a)：

[式中：r¹、r²和r³与上述相同。]

所示的部分结构中的5元环不受特别限制。该5元环优选具有平面性。作为该5元环的具体例，可以列举：呋喃、吡咯、噻吩等，更优选列举：呋喃、吡咯等，进一步优选列举吡咯。

<1-3.r⁶>

r⁶表示氢原子或烃基。在本发明的某个方式中，优选r⁶为氢原子。对于r⁶所示的烃基，与关于r^a的上述记载同样。

<1-4.r⁷和r⁸>

r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烃基，或者r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成环。在本发明的某个方式中，优选r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烃基，更优选r⁷和r⁸中至少一个为氢原子，进一步优选r⁷和r⁸均为氢原子。

对于r⁷所示的烃基和r⁸所示的烃基，与关于r^a的上述记载同样。

r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成的环不受特别限制，例如为单环或双环。作为该环，例如通式(x)、通式(y)：

式中：r⁷¹和r⁷²分别表示烷基。p和r分别表示1～3的整数。q和s分别表示0或1～3的整数。

关于r⁷¹和r⁷²所示的烷基，与关于r^a的上述记载同样。关于r⁷¹和r⁷²，在分别存在多个的情况下，可以与相同的碳原子键合，也可以与彼此不同的碳原子键合。

<1-5.优选的通式(1)化合物>

在本发明的一个方式中，在通式(1)中，优选列举通式(1a)：

式中：r^a、r^b、n、r⁶、r⁷和r⁸与上述相同。

在本发明的另一方式中，在通式(1)中，优选列举通式(1b)：

式中：r^a、r⁶、r⁷和r⁸与上述相同。

通式(1)、(1a)、(1b)中，优选的方式如下所述：

r²表示-n(-r^b)-或-o-。

r^a相同或不同，表示氢原子、可以被氨基取代的直链或支链烷基(其中，在r²为-n(-r^b)-的情况下，碳原子数为1～5，在r²为-o-的情况下，碳原子数为2～5)、可以被氨基取代的碳原子数3～7的环状烷基、或者可以被氨基取代的苯基。

r^b表示氢原子、可以被直链或支链烷基取代的氨基、或者可以被氨基取代的烷基。

r⁶表示氢原子。

r⁷和r⁸相同或不同，表示氢原子或烷基(其中，不包括r⁷和r⁸两者为烷基的情况)，或者r⁷和r⁸彼此键合并与相邻接的氮原子一起形成环。

作为通式(1)所示的化合物，具体而言，例如可以列举以下的化合物。

在上述化合物中，优选列举：化合物e、化合物i、化合物x2d等。

<1-6.异构体>

通式(1)所示的化合物包含立体异构体和光学异构体，这些不受特别限定。

<1-7.盐、水合物、溶剂合物>

作为通式(1)所示的化合物的盐，只要为药学上可接受的盐，就不受特别限制。作为该盐，能够采用酸性盐、碱性盐中的任意种。作为酸性盐的例子，可以列举：盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、硝酸盐、磷酸盐等无机酸盐；乙酸盐、丙酸盐、酒石酸盐、富马酸盐、马来酸盐、苹果酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、对甲苯磺酸盐等有机酸盐，作为碱性盐的例子，可以列举：钠盐和钾盐等碱金属盐；以及钙盐、镁盐等碱土金属盐；与氨的盐；与吗啉、哌啶、吡咯烷、单烷基胺、二烷基胺、三烷基胺、单(羟基烷基)胺、二(羟基烷基)胺、三(羟基烷基)胺等有机胺的盐等。

通式(1)所示的化合物也能够采用水合物、溶剂合物。作为溶剂，例如可以列举药学上可接受的有机溶剂(例如乙醇、甘油、乙酸等)等。

2.制造方法

通式(1)所示的化合物能够通过各种方法来合成。例如，通式(1)中r⁶为烃基(r^6a)且r⁷和r⁸均为氢原子时的化合物(化合物1d)能够按照或依据例如以下的反应式来合成。

式中，r¹、r²、r³、r⁷和r⁸与上述相同。r^6a表示烃基。

另外，通式(1)中r⁶为氢原子且r⁷和r⁸均为氢原子时的化合物(化合物1e)能够通过使用强碱等对例如作为化合物1d的羧基的保护基团的r^6a-进行脱保护来获得。

此外，关于r⁷和r⁸中的至少一个为烃基的化合物，能够通过用烃取代化合物1d或化合物1e的氨基来获得。

另外，除这些方法以外，通式(1)所示的化合物也能够利用paal-knorr反应来合成。即，在利用paal-knorr反应的情况下，使适当的酮酸酯与酮的偶联物(二酮酸酯)在酸或氨、伯胺等的存在下进行反应，合成呋喃或吡咯(化合物1c)，然后，按照上述反应式合成通式(1)所示的化合物。

在r^a、r^b等中存在氨基的情况下，例如，能够通过paal-knorr反应得到化合物c上的氨基根据需要被适当的保护基团(例如邻苯二甲酰亚胺等)所保护的化合物(化合物c’)，并在反应工序中的适当的时期进行脱保护(例如使用肼等进行脱保护)，由此合成通式(1)所示的化合物。

<2-1.化合物1a→化合物1b>

在本工序中，通过使化合物1a、卤化铝和二氧化碳反应，能够得到化合物1b。

作为卤化铝，不受特别限制，可以列举例如：卤化烷基铝、优选氯化二甲基铝等。

从收率、合成的难易度等观点出发，卤化铝的使用量通常相对于1摩尔的化合物1a优选为0.5～1.5摩尔，更优选为0.8～1.2摩尔。

从收率、合成的难易度等观点出发，二氧化碳的使用量通常相对于1摩尔的化合物1a优选为1～15摩尔。

本工序优选在溶剂中进行。作为溶剂，不受特别限制，可以列举例如甲苯等。溶剂可以单独使用一种，或者组合两种以上使用。

在本工序中，除上述成分以外，也能够在不损害本发明的效果的范围内适当使用添加剂。

反应气氛通常能够采用不活泼气体气氛(氩气气氛、氮气气氛等)。反应温度能够在加热下、常温下和冷却下的任意条件下进行，通常，优选在0～100℃(特别是15～40℃)下进行。反应时间不受特别限制，通常能够采用3小时～48小时，特别是8小时～24小时。

反应结束后，还能够根据需要按照常规方法进行精制处理。另外，也能够不实施精制处理而进行下一道工序。

<2-2.化合物1b→化合物1c>

在本工序中，通过使化合物1b、r^6a-oh和卤化氢反应，能够得到化合物1c。

从收率、合成的难易度等观点出发，r^6a-oh的使用量通常相对于1重量份的化合物1b优选为3～15重量份，更优选为5～10重量份。

作为卤化氢，不受特别限制，优选可以列举氯化氢。

作为卤化氢的使用量，在反应液中为1～6当量、优选1.5～5当量的程度。

在本工序中，通常r^6a-oh作为溶剂发挥作用，但也可以进一步追加适当的溶剂。溶剂可以单独使用一种，或者组合两种以上使用。

在本工序中，除上述成分以外，也能够在不损害本发明的效果的范围内适当使用添加剂。

反应气氛通常能够采用不活泼气体气氛(氩气气氛、氮气气氛等)。反应温度能够在加热下、常温下和冷却下的任意条件下进行，通常优选在0～100℃(特别是15～40℃)下进行。反应时间不受特别限制，通常能够采用3小时～48小时，特别是8小时～24小时。

反应结束后，也能够根据需要按照常规方法进行精制处理。另外，也能够不进行精制处理而进行下一道工序。

<2-3.化合物1c→化合物1d>

在本工序中，通过使化合物1c、卤化磺酸和氢氧化铵反应，能够得到化合物1d。该工序也能够分两步执行，即，使化合物1c与卤化磺酸反应之后，使得到的反应物与氢氧化铵进行反应，由此执行该工序。

作为卤化磺酸，不受特别限制，优选可以列举氯化磺酸等。

从收率、合成的难易度等观点出发，卤化磺酸的使用量通常相对于1摩尔的化合物1c优选为3～20摩尔，更优选为7～15摩尔。

从收率、合成的难易度等观点出发，氢氧化铵的使用量通常相对于1重量份的化合物1c优选为1～50重量份，更优选为3～20重量份。

本工序优选在溶剂中进行。作为溶剂，不受特别限制，例如可以列举乙腈等。溶剂可以单独使用一种，或者组合两种以上使用。

在本工序中，除上述成分以外，也能够在不损害本发明的效果的范围内适当地使用添加剂。

反应气氛通常能够采用不活泼气体气氛(氩气气氛、氮气气氛等)。反应温度能够在加热下、常温下和冷却下的任意条件下进行，通常优选在0～40℃(特别是0～5℃)下进行。反应时间不受特别限制，通常能够采用30分钟～10小时，特别是1小时～5小时。

反应结束后，也能够根据需要按照常规方法进行精制处理。另外，也能够不实施精制处理而进行下一道工序。

3.用途

本发明的化合物具有β-内酰胺酶抑制活性、β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌效果的增强活性等。因而，本发明的化合物能够用作药物、试剂等(在本说明书中，有时也表示为“本发明的药剂”。)的有效成分，更具体而言，能够用作β-内酰胺酶抑制剂、β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌效果的增强剂等的有效成分。另外，也能够提供利用本发明的化合物的β-内酰胺酶抑制活性、β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌效果的增强活性等而含有本发明的化合物和β-内酰胺类抗菌化合物的抗菌剂、以及含有β-内酰胺类抗菌化合物并以与本发明的化合物联合给药的方式使用的抗菌剂(在本说明书中，这些有时也表示为“本发明的药剂”。)等。

在本发明的药剂中，关于含有本发明的化合物的药剂，只要含有本发明的化合物，就不受特别限制，也能够根据需要包含其它成分。作为其它成分，只要其为药学上可接受的成分，就不受特别限定。作为其它成分，除具有药理作用的成分之外，也包含添加剂。作为添加剂，可以列举例如：基剂、载体、溶剂、分散剂、乳化剂、缓冲剂、渗透压调节剂、吸收促进剂、稳定剂、赋形剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、增粘剂、保湿剂、着色剂、香料、螯合剂等。

就作为本发明的化合物的抑制对象的β-内酰胺酶而言，只要为催化β-内酰胺环的开环的来自任意的供应源的酶，就不受特别限制。β-内酰胺酶(ec3.5.2.6)是最常见的由细菌所产生的酶。β-内酰胺酶催化β-内酰胺环的水解性开环，其是对青霉素类、青霉烷类、青霉烯类、头孢烯类、头孢菌素类、碳头孢烯类、头霉素类、单环菌素类和碳青霉烯类等β-内酰胺类抗菌化合物赋予细菌耐药性的原因。β-内酰胺酶分为a～d类，其中，作为本发明的化合物的抑制对象，优选b类β-内酰胺酶，更优选b1类β-内酰胺酶。具体而言，可以列举例如：imp-1、ndm-1、vim-2、dim-1、gim-1、khm-1、sim-1、spm-1、tmb-1、bcii、blab、ccra、ind-7等。另外，作为b2类和b3类，分别可以列举sfh-1和gob-1等。

就作为本发明的化合物的抗菌效果的增强对象的β-内酰胺类抗菌化合物而言，不受特别限制，可以列举例如：青霉素类抗菌化合物、头孢烯类抗菌化合物、碳青霉烯类抗菌化合物等。

作为青霉素类抗菌化合物的具体例，可以列举：苄基青霉素、非奈西林、氯唑西林、双氯青霉素、氨苄西林、环己西林、阿莫西林、酞氨西林、巴氨西林、仑氨西林、阿扑西林、哌拉西林、磺苄西林、匹美西林、舒它西林、苯氧基甲基青霉素、羧苄西林、叠氮西林、丙匹西林、依匹西林、替卡西林、吡苄西林、阿洛西林、美罗西林、以及其它公知的青霉素类抗菌化合物等。

作为头孢烯类抗菌化合物的具体例子，可以列举：头孢克洛、头孢唑啉、头孢曲嗪、头孢羟氨苄、头孢匹林、头孢孟多酯钠(cefamandolnafate)、头孢拉定、头孢氨苄、头孢噻吩、头孢吡肟、头孢西丁、头孢克肟、头孢他啶、头孢妥仑、头孢地尼、头孢磺啶、头孢噻利、头孢唑兰、头孢噻肟、头孢他啶、头孢洛林、头孢替安、头孢唑肟、头孢布烯、头孢替唑、头孢特仑、头孢曲松、头孢尼西、头孢匹胺、头孢匹罗、头孢拉宗、头孢罗齐、头孢哌酮、头孢泊肟、头孢米诺、头孢美唑、头孢甲肟、头孢拉定、头孢沙定、头孢呋辛、拉氧头孢、氟氧头孢、头孢洛扎(cxa101、(6r,7r)-3-[5-氨基-4-[3-(2-氨基乙基)脲基]-1-甲基-1h-吡唑-2-鎓-2-基甲基]-7-[2-(5-氨基-1,2,4-噻二唑-3-基)-2-[(z)-1-羧基-1-甲基乙氧基亚氨基]乙酰胺]-3-头孢烯-4-羧酸硫酸氢盐)以及其它公知的头孢烯类抗菌化合物等。

作为碳青霉烯类抗菌化合物的具体例，具有亚胺培南、帕尼培南、美罗培南、比阿培南、多利培南、艾他培南、替比培南等。

作为除青霉素类抗菌化合物、头孢烯类抗菌化合物和碳青霉烯类抗菌化合物以外的β-内酰胺类抗菌化合物的例子，可以列举：氨曲南、卡芦莫南、氯碳头孢、法罗培南、利替培南等。

作为本发明的药剂的对象菌，能够广泛采用革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌等。作为革兰氏阴性菌，可以列举例如：肠内细菌科细菌(例如、埃希氏菌属菌、克雷伯氏菌属菌、沙门氏菌属菌、志贺氏菌属等)、不动杆菌属菌、假单胞菌属菌(例如、绿脓杆菌)、莫拉氏菌属菌、螺杆菌属菌、弯曲杆菌属菌、气单胞菌属菌、弧菌属菌(例如、霍乱弧菌、肠炎弧菌)、嗜血杆菌属菌(例如、流感嗜血杆菌)、奈瑟氏球菌属菌(例如、淋球菌、脑膜炎球菌)、拟杆菌属菌等。作为革兰氏阳性菌，可以列举例如：葡萄球菌属菌(例如、金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌)、肠球菌(例如、肠球菌属菌)、链球菌属菌(例如、a族链球菌、b族链球菌、肺炎球菌、绿色链球菌)、芽孢杆菌属菌(例如、蜡样芽孢杆菌、炭疽芽孢杆菌)、梭状杆菌属菌(例如、破伤风杆菌、肉毒杆菌、艰难梭菌)、棒状杆菌属菌(例如、白喉棒状杆菌)、李斯特氏菌属菌、乳杆菌属菌、双歧杆菌属菌、丙酸杆菌属菌(例如、导致痤疮的痤疮丙酸杆菌)、放线菌等。其中，优选列举革兰氏阴性菌，更优选肠内细菌科细菌、不动杆菌属菌等。本发明的药剂能够对于产生β-内酰胺酶的对象菌发挥其效果。

本发明的药剂的使用方式不受特别限制，能够根据其种类采用适当的使用方式。本发明的药剂也能够根据其用途在例如invitro(体外)使用(例如，添加于培养细胞的培养基。)，还能够在invivo(体内)使用(例如，给药于动物。)。

在将本发明的药剂应用于动物或细胞的情况下，应用对象不受特别限定，作为哺乳动物，可以列举例如：人、猴子、小鼠、大鼠、狗、猫、兔子、猪、马、牛、绵羊、山羊、鹿等。另外，作为细胞，可以列举动物细胞等。细胞的种类也不受特别限制，可以列举例如：血液细胞、造血干细胞-前体细胞、配子(精子、卵子)、成纤维细胞、上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞、肝细胞、角质形成细胞、肌肉细胞、表皮细胞、内分泌细胞、es细胞、ips细胞、组织干细胞、癌细胞等。

本发明的药剂能够采用适合于药物、试剂等的任意的剂形，例如：片剂(包含口腔崩解片、咀嚼片、泡腾片、含片、果冻状滴剂等)、丸剂、颗粒剂、细粒剂、散剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、干糖浆剂、液剂(包含饮剂、悬浮剂、糖浆剂)、凝胶剂等口服制剂形式、注射制剂(例如、点滴注射剂(例如、点滴静脉注射制剂等)、静脉注射剂、肌肉注射剂、皮下注射剂、皮内注射剂)、外用剂(例如、软膏剂、乳膏剂、膏药、洗剂)、栓剂、吸入剂、眼剂、眼软膏剂、滴鼻剂、滴耳剂、脂质体剂等非口服制剂形式。

作为本发明的药剂的给药途径，只要能够得到所需的效果，就不受特别限制，可以列举：口服给药、管饲、灌肠给药等肠内给药；静脉内给药、动脉内给药、肌肉内给药、心内给药、皮下给药、皮内给药、腹腔内给药等非口服给药等。

本发明的药剂中的有效成分的含量由使用方式、应用对象、应用对象的状态等决定，不作限定，能够采用例如0.0001～100重量％，优选采用0.001～50重量％。

在将本发明的药剂给药于人或动物的情况下，给药量只要为表达药效的有效量，就不受特别限定，通常，作为有效成分的重量，通常在口服给药的情况下，给药量为每日0.1～1000mg/kg体重，优选每日为0.5～500mg/kg体重，在非口服给药的情况下，给药量为每日0.01～100mg/kg体重，优选为0.05～50mg/kg体重。上述给药量也可以根据患者的年龄、病情、症状等适当增减。

另外，也能够将本发明的β-内酰胺酶抑制剂用于产β-内酰胺酶菌的检测。例如，能够在β-内酰胺类抗菌化合物与本发明的β-内酰胺酶抑制剂共存下，通过培养检测对象的菌时有无增殖抑制来检测产β-内酰胺酶菌。即，能够在圆盘法或微量液体稀释法等中使用本抑制剂。

实施例

下面，基于实施例对本发明进行详细说明，但本发明不受这些实施例限定。

1.化合物的准备1

准备下面所示的化合物a～i。

化合物a～c从enamine公司购入。化合物d～i按照以下的合成例1～6合成。

合成例1.化合物d的合成

按照上述反应式合成化合物d。具体而言，如下进行合成。

将干燥甲苯(200ml)中的2,5-二甲基-1-苯基-1h-吡咯(d1，5.10g，29.8mmol)、氯化二甲基铝(2.74g，29.8mmol)和co2(10.0g，227mmol)搅拌一晚。用水(200ml)急冷混合物，用二氯甲烷(200ml×3)提取。将有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色的油状物的2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸乙酯(d2)(2.73g，42.6％)。

将hcl/etoh(20.0ml，4.00n)中的2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸(d2，2.73g，12.7mmol)的溶液搅拌一晚。将溶液在真空下浓缩。用10.0％nahco3水溶液(100ml)急冷混合物，用二氯甲烷(100ml×3)提取。有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色的油状物的2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸乙酯(d3)(1.70g，55.2％)。

在0℃下向乙腈(30.0ml)中的2,5-二甲基-1-苯基吡咯-3-羧酸乙酯(d3，1.70g，6.99mmol)的溶液中缓慢添加氯磺酸(sulfonylacidchloride)(8.10g，69.8mmol)。将溶液搅拌2小时，接着，添加氢氧化铵(10.0ml)。将溶液搅拌1小时，用乙酸乙酯(100ml×2)提取。有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到粗生成物，将其用制备型hplc精制，得到作为黄色油状物的2,5-二甲基-1-苯基-4-氨基磺酰基吡咯-3-羧酸乙酯(d4)(300mg，13.3％)。

将meoh(5.00ml)中的2,5-二甲基-1-苯基-4-氨基磺酰基吡咯-3-羧酸乙酯(d4，300mg，0.932mmol)、naoh(44.7mg，1.18mmol)和水(3.00ml)搅拌16小时。真空下除去meoh。将残渣加入乙酸乙酯(10.0ml)和水(10.0ml)中。将混合物用hoac调节至ph＝3～4。将溶液用乙酸乙酯(10.0ml×3)提取。有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色固体的化合物d(20.5mg，7.48％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso_d6):δ1.98-2.00(m,1h),2.14(s,6h),7.08(s,1h),7.33-7.36(m,2h),7.58-7.61(m,3h).mscalcd.:294；msfound:295.1([m+1]⁺)。

合成例2.化合物e的合成

按照上述反应式，与合成例1同样地合成化合物e。得到作为黄色固体的化合物e(收量20.0mg，收率18.7％)。

¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ2.35(d,j＝1.6hz,2h),2.48(d,j＝8.0hz,6h),3.46(s,3h).mscalcd.:232；msfound:233.1([m+1]⁺)。

合成例3.化合物f的合成

按照上述反应式合成化合物f。具体而言，如下进行合成。

在0℃下冷却呋喃(f1，16.0g，0.235mol)和tmeda(60.0g，0.517mol)的溶液，滴加n-丁基锂(己烷中2.50m，207ml，0.517mol)。使溶液恢复到室温，并搅拌1小时。滴加四氢呋喃(150ml)中的溴乙烷(76.8g，0.705mol)。将反应物在室温下搅拌一晚，用饱和氯化铵(300ml)急冷，用甲基叔丁醚(500ml×2)提取。将有机层用1nhcl水溶液(100ml×3)清洗，用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色的油状物的2,5-二乙基呋喃(f2)(18.9g，64.9％)。

将干燥甲苯(200ml)中的2,5-二乙基呋喃(f2，17.0g，0.137mol)、氯化二甲基铝(152ml，0.9m，0.137mol)和co2(20.0g，0.454mol)的溶液搅拌一晚。用水(250ml)急冷混合物，用二氯甲烷(300ml×3)提取。有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为红褐色的固体的2,5-二乙基呋喃-3-羧酸(f3)(3.6g，15.7％)。

将hcl/etoh(36.0ml，2.00n)中的2,5-二乙基呋喃-3-羧酸(f3，3.6g，0.021mol)的溶液搅拌一晚。将溶液在真空下浓缩。用10.0％nahco3水溶液(100ml)急冷混合物，用二氯甲烷(100ml×2)提取。将有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到2,5-二乙基呋喃-3-羧酸乙酯(f4)(2.67g，63.6％)。

在0℃下向乙腈(30.0ml)中的2,5-二乙基呋喃-3-羧酸乙酯(f4，2.50g，0.013mol)的溶液中缓慢加入氯磺酸(chlorosulfuricacid)(15.0g，0.130mol)。搅拌溶液2小时，接着，添加氢氧化铵(50.0ml)。将溶液搅拌1小时。用乙酸乙酯(100ml×2)提取溶液。将有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到粗生成物，用柱子精制该粗生成物，得到作为黄色固体的2,5-二乙基-4-氨基磺酰基呋喃-3-羧酸乙酯(f5)(880mg，25.1％)。

将meoh(10.0ml)中的2,5-二乙基-4-氨基磺酰基呋喃-3-羧酸乙酯(f5，880mg，3.20mmol)、naoh(640mg，16.0mmol)和水(4.00ml)的溶液搅拌16小时。真空下除去meoh。向残渣中添加乙酸乙酯(50.0ml)和水(20.0ml)。将混合物用水性hcl(1n)调节至ph＝3～4。用乙酸乙酯(40.0ml×3)提取溶液。将有机层用无水na2so4干燥，并在减压下浓缩，得到作为黄色固体的化合物f(120mg，15.2％)。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ5.66(s,2h),3.00-3.04(m,4h),1.24-1.30(m,6h).mscalcd.:247；msfound:248.1([m+1]⁺)。

合成例4.化合物g的合成

按照上述反应式，与合成例3同样地合成化合物g。得到作为黄色固体的化合物g(收量0.130g，收率13.0％)。

¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ2.92-2.99(m,4h),1.66-1.76(m,4h),0.94-0.99(m,6h).mscalcd.:275；msfound:276.0([m+1]⁺)。

合成例5.化合物h的合成

按照上述反应式，与合成例3同样地合成化合物h。得到作为黄色固体的化合物h(收量0.135mg，收率18.3％)。

¹h-nmr(400mhz,cdcl3):δ1.45-2.12(m,16h),3.83-3.95(m,2h).mscalcd:327；msfound:326.0([m-1]^-)。

合成例6.化合物i的合成

按照上述反应式，与合成例1同样地合成化合物i。得到作为黄色固体的化合物i(收量110mg，收率11.1％)。

¹h-nmr(400mhz,cd3od):δ3.45(s,3h),2.88-2.94(m,4h),1.04-1.11(m,6h).mscalcd.:260；msfound:261.1([m+1]⁺)。

2.化合物的分析1

针对各化合物，分析活性、复合体结构、毒性等(试验例1～7)。

试验例1.药敏试验1

使用96孔或者384孔u形底板、穆勒-欣顿液体培养基、抗菌药(头孢他啶[caz]、亚胺培南[ipm]、美罗培南[mpm]、多利培南[dpm]、替比培南[bpm]，制作药敏试验测定用板。进行调节，以使96孔等u形底板a系列左端的孔1中包含最大浓度的抗菌药，并以右旁的孔2中的抗菌药浓度为1/2，而且其右旁的孔3的抗菌药浓度为1/4的方式，制作1/2抗菌药稀释系列，直至孔11。孔12作为不包含抗菌药的空白孔。b和c系列也与a系列同样地制作抗菌药的稀释系列。再向b和c系列中分别添加测试物质(化合物a)10μg/ml、50μg/ml(图1)。

作为测试菌，使用导入有编码b类β-内酰胺酶(mbl(金属-β-内酰胺酶)：imp-1、ndm-1或vim-2)的质粒的细菌(pbcsk(+)/e.colidh5α)。使用穆勒-欣顿培养基，将测试菌调节为10⁸cfu/ml。再使用穆勒-欣顿培养基将测试菌稀释至10倍(10⁷cfu/ml)。采集5μl，接种于药敏试验测定用板。在35℃培养1晚，通过目测确认测试菌的发育。将未确认到测试菌的发育的孔中包含最低抗菌药浓度的孔作为最小抑菌浓度(minimalinhibitoryconcentration)值(图1)。

将结果示于表1。表1中，mbls列表示测试菌所产生的b类β-内酰胺酶，emptyvector表示未产生b类β-内酰胺酶。

表1

如表1所示可知，通过添加化合物a，对于产β-内酰胺酶菌的抗菌药的mic降低。

试验例2.β-内酰胺酶抑制活性测定试验

将各种b类β-内酰胺酶(imp-1、ndm-1或vim-2：最终浓度10nm)、亚胺培南(最终浓度100μm)、测试物质(化合物a、化合物z＝如下所述：最终浓度0、1、10、100μm)在hepes缓冲液中混合。测试吸光度298nm、30℃条件下的亚胺培南分解活性(δabs/min)。将未添加测试物质时的亚胺培南分解活性作为100％，分别绘制添加测试物质时的亚胺培南残留分解活性。

将结果示于图2。如图2所示可知，化合物a抑制β-内酰胺酶。

试验例3.药敏试验2

使用产生b类β-内酰胺酶的肠内细菌科细菌的各种株作为测试菌，除此之外，与试验例1同样地进行。

将结果示于图3。如图3所示可知，通过添加化合物a，对于产β-内酰胺酶肠内细菌科细菌的抗菌药的mic降低。

试验例4.药敏试验3

使用产生b类β-内酰胺酶的不动杆菌的各种株作为测试菌，除此之外，与试验例1同样地进行。

将结果示于图4。如图4所示可知，通过添加化合物a，对于产β-内酰胺酶不动杆菌的抗菌药的mic降低。

试验例5.x射线晶体结构分析

<imp-1与测试物质的复合体结构分析>

液体培养产生imp-1的大肠杆菌[pet9a-δimp-1/e.colibl21(de3)]，通过离心操作回收菌体。用超声波破碎菌体之后，通过超离心操作分离可溶性组分和不溶性组分。使可溶性组分依次通过阳离子交换柱、疏水相互作用柱、凝胶过滤柱，精制imp-1。使用超滤柱，将精制后的imp-1置换为hepes缓冲液之后进行浓缩。将精制后的imp-1(15mg/ml)和储备溶液(reservoirsolution)[100mmhepes(ph7.5)，200mm乙酸钠，25％peg3350]混合，并在20℃下孵育，从而得到imp-1晶体。将imp-1晶体浸润在溶解有测试物质(化合物a)的上述储备溶液中，从而制作imp-1与测试物质的复合体晶体。将复合体晶体放入同步加速器，照射x射线放射光，从而回收衍射数据。使用公开的imp-1的结构信息，通过分子置换法确定相位。精密化时使用refmac5，模型构筑时使用coot。

<vim-2与测试物质的复合体结构分析>

液体培养产生vim-2的大肠杆菌[pet29a-vim-2/e.colibl21(de3)]，通过离心操作回收菌体。用超声波破碎菌体之后，通过超离心操作分离可溶性组分和不溶性组分。使可溶性组分依次通过阴离子交换柱、疏水相互作用柱、凝胶过滤柱，从而精制vim-2。使用超滤柱，将精制后的vim-2置换为tris-hcl缓冲液之后进行浓缩。将精制后的vim-2(15mg/ml)与储备溶液[200mm甲酸镁(magnesiumformate)，25％peg3350]混合，并在20℃下孵育，由此得到vim-2的晶体。将vim-2晶体浸润在溶解有测试物质(化合物a)的上述储备溶液中，由此制作vim-2与测试物质的复合体晶体。将复合体晶体放入同步加速器，回收x射线衍射数据。使用公开的vim-2的结构信息，通过分子置换法确定相位。精密化时使用refmac5，模型构筑时使用coot。

<ndm-1与测试物质的复合体结构分析>

液体培养产生ndm-1的大肠杆菌[pet28a-ndm-1/e.colibl21(de3)]，通过离心操作回收菌体。用超声波破碎菌体之后，通过超离心操作分离可溶性组分和不溶性组分。使可溶性组分依次通过镍柱、阴离子交换柱、凝胶过滤柱，从而精制ndm-1。使用超滤柱，将精制后的ndm-1置换为tris-hcl缓冲液之后进行浓缩。将精制后的ndm-1(40mg/ml)与储备溶液[100mmbis-tris(ph6.1)，200mm硫酸铵，25％peg3350]混合，并在20℃下孵育，由此得到ndm-1的晶体。将ndm-1晶体浸润在溶解有测试物质(化合物a或化合物i)的上述储备溶液中，由此制作ndm-1与测试物质的复合体晶体。将复合体晶体放入同步加速器，回收x射线衍射数据。使用公开的ndm-1的结构信息，通过分子置换法确定相位。精密化时使用refmac5，模型构筑时使用coot。

<结果>

将结果示于图5～8。如图5～8所示可知，测试物质经由其的氨基磺酰基和羧基与ipm-1、vim-2、ndm-1相互作用。另一方面，在这些基团所连接的一侧的相反侧(通式(1)的r¹、r²和r³侧)与ipm-1、vim-2和ndm-1之间具有一定的空间，认为该相反侧的结构的自由度高。

试验例6.药敏试验4和抑制常数(ki)测定试验1

药敏试验使用化合物a～c和e～i作为测试物质，除此之外，与试验例1同样地进行。

抑制常数(ki)测定试验如下进行。使用各种金属-β-内酰胺酶(最终浓度10nm)测定抑制常数(ki)。使作为基质的亚胺培南的浓度、作为抑制剂的测试物质(化合物a～e)的浓度分别变化，测定各点处在吸光度298nm、30℃条件下的亚胺培南分解活性(δabs/min)。将测定值拟合于lineweaver–burkplot的式子，从而算出ki。

将结果示于表2。表2中，最左列表示测试物质，none表示未添加测试物质的情况。

[表2]

如表2所示可知，通过添加化合物a～c和e～i，对于产β-内酰胺酶菌的抗菌药的mic降低，并且抑制β-内酰胺酶活性。

试验例7.毒性评价试验

向hela细胞中添加各种浓度的测试物质(化合物a)或星形孢菌素，使用mtt检测试剂盒(promegacatno.g4000)计数活细胞。

将结果示于图9。如图9所示可知，化合物a的毒性极低。

试验例8.回复突变试验(ames试验)

将测试物质(化合物a)作为测试物质，并委托ube科学分析中心公司进行ames试验。其结果可知，化合物a为ames试验阴性。

3.化合物的准备2

按照以下的合成例7～8合成化合物x2a、x2b、x2c、x2d、x3a和x4。化合物x3b能够按照以下的合成例9来合成。化合物no.9-7、no.9-8和no.9-9从namikishojico.,ltd.购入。

合成例7.化合物x2a、x2b、x2c、x2d和x4的合成

通过下述的合成路线合成目标物8(化合物x2a、x2b、x2c、x2d和x4)。

将目标物8和原料(二酮酸酯3等)的具体结构示于以下。编号与上述合成路线相对应。另外，编号后所示的两个字符的字母相同的化合物表示相同的合成路线上的化合物。即，化合物x2a(吡咯8ad)的合成路线上的化合物为编号后所示的两个字符的字母为“ad”的化合物。

合成例7-1.化合物x2a(吡咯8ad)的合成

进行3-氧代戊酸乙酯1a与溴丙酮2d的偶联，合成二酮酸酯3ad。即，在氮气氛下向具备搅拌器的50ml三口烧瓶中加入氢化钠(60％in液体石蜡，960mg，24.00mmol，1.20eq.)和thf(35ml)，并进行冰冷。接着，使用注射器以neat向得到的灰色悬浮中滴加3-氧代戊酸乙酯1a(2.85ml，20.00mmol)。此时，确认到发泡。在冰浴中进一步搅拌30分钟后，快速加入溴丙酮2d(3.00g，22.00mmol，1.10eq.)的thf溶液(15ml)。进而，1小时后利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到原料1a消失和一个新的点的生成(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝9/1，rf值：0.3)。此时向反应混合物中加入饱和氯化铵水溶液和乙酸乙酯，停止反应。分离两层之后，用乙酸乙酯提取水层，将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液清洗，加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂后，将滤液在减压下浓缩，得到橙色油状物质4.33g，将得到的粗生成物用硅胶柱色谱进行精制(共计2次，使用硅胶(1)(2)(各150g)。溶出中使用(1)己烷/乙酸乙酯＝9/1(2l)→1/1(700ml)，(2)己烷/乙酸乙酯＝4/1(2l)。浓缩目标物的流出组分(fraction)，结果得到作为淡黄色液体的目标二酮酸酯3ad2.50g(收率62％)。

通过paal-knorr吡咯合成，由二酮酸酯3ad合成吡咯4ad。即，向具备搅拌器的100ml单口烧瓶中加入二酮酸酯3ad(2.50g，12.49mmol)、乙酸铵(9.63g，124.9mmol，10.00eq.)和乙酸(40ml)，在80℃下搅拌混合物。3小时后用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到原料3ad(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝4/1，rf值：0.3)的消失和原料上一个新的点(rf值：0.4)的生成。此时将反应混合物放置冷却至室温，在减压下浓缩。接着，将得到的褐色油状物质用乙酸乙酯和蒸馏水稀释，分离两层之后，将水层用乙酸乙酯提取。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液清洗，加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂，将滤液在减压下浓缩，得到作为褐色液体的目标吡咯4ad2.11g(收率93％)。

用碘甲烷将吡咯4ad烷基化，合成n-甲基吡咯5ad。即，向具备搅拌器的100ml单口烧瓶中加入吡咯4ad(2.11g，11.63mmol)、碘甲烷(3.6ml，57.83mmol，4.97eq.)和thf(45ml)并进行冰冷。接着，向得到的褐色溶液中加入氢化钠(60％in液体石蜡，698mg，17.44mmol，1.50eq.)，确认到发泡。30分钟后用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，结果残留原料4ad。再继续搅拌，62小时后通过tlc分析确认到消失。向反应混合物中加入蒸馏水，停止反应，用二乙醚提取。将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液清洗，加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂，将滤液在减压下浓缩，得到红褐色油状物质2.80g，将得到的粗生成物利用硅胶柱色谱(使用50g，直径30mm，高度190mm)进行精制。使用己烷/乙酸乙酯＝9/1(650ml)作为溶出液。浓缩目标物的流出组分(fraction)，结果得到作为褐色液体的n-甲基吡咯5ad1.72g(收率76％)。

进行n-甲基吡咯5ad的氯磺化，合成磺酸氯化物6ad。即，向具备搅拌器并进行充分氮置换后的100ml单口烧瓶中加入氯硫酸(5.9ml，88.76mmol，10.05eq.)，并在冰浴下搅拌(注意发烟)。向其中一点点加入n-甲基吡咯5ad(1.72g，8.83mmol)之后，密闭并升温至室温(褐色透明溶液)。1小时30分钟后，用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到原料5ad(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝9/1，rf值：0.7)的消失和新的点(rf值：0.35)的生成。向冰冷后的蒸馏水中缓慢滴加冰冷后的反应混合物，结果析出淡褐色固体。将所生成的固体用二氯甲烷溶解，分离两层之后，用二氯甲烷提取水层，向合并后的有机层中加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂，将滤液在减压下浓缩，得到作为褐色固体的磺酸氯化物6ad1.75g(收率68％)。

使磺酸氯化物6ad与氨/二噁烷溶液反应，合成磺酰胺7ad。即，向具备搅拌器的100l单口烧瓶中加入磺酸氯化物6ad(1.75g，5.97mmol)和0.5m氨/二噁烷溶液(36.00ml，18.00mmol，3.01eq.)，在室温下搅拌。26小时30分钟后，用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到原料6ad(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝1/1，rf值：0.6)的消失和新的点(rf值：0.3)的生成。在减压下浓缩，用冷己烷/乙酸乙酯＝1/1对得到的粗生成物的滤饼进行清洗，回收固体并干燥，得到作为褐色固体的目标磺酰胺7ad1.50g(收率92％)。

将磺酰胺7ad的酯在碱性条件下水解，合成作为目标的吡咯化合物8ad(x2a)。即，向具备搅拌器的100ml单口烧瓶中加入磺酰胺7ad(lot.4188163，1.41g，5.13mmol)和2m氢氧化钾/乙醇溶液(50.0ml，100.0mmol，19.48eq.)，在80℃下搅拌。3小时30分种后，用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到原料7ad(展开溶剂：仅为乙酸乙酯，rf值：0.75)的消失和新的点(rf值：0.5)的生成。将反应混合物放冷至室温，加入乙酸(6ml)并静置在冰箱中。将第二天析出的晶体用桐山漏斗过滤，用蒸馏水(10ml)进行滤饼清洗，固体溶解，因此再次在减压下浓缩，将所析出的固体用蒸馏水(10ml)进行滤饼清洗。将剩余的固体在50℃、减压下干燥，得到褐色固体687mg。将得到的褐色固体用硅胶柱色谱(使用硅胶157g)进行精制。使用作为溶出液。在研究2.6.1中，目标物的极性高，收量低，因此，在此升高极性至仅剩甲醇。将各个流出组分(fraction)浓缩，得到低极性褐色固体112mg、高极性褐色固体504mg。将得到的固体的一部分用氘代dmso稀释，测定¹h和¹³cnmr，确认高极性褐色固体为目标吡咯8ad(x2a)(收率40％，hplc纯度98.5％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso_d6):δ1.06(t,j＝6.0hz,3h),2.42(s,3h),2.94(q,j＝6.0hz,2h),3.42(s,3h),3.5-9.0(bs,3h)；¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6):11.0,14.3,30.5,48.0,108.9,121.4,130.5,140.4,168.0；mscalcd.:245.06；msfound:245.03([m-1]^-)。

合成例7-2.化合物x2b的合成

与合成例7-1同样地合成化合物x2b。得到作为淡褐色固体的化合物x2b(收率33％，hplc纯度95.9％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso_d6):δ1.06(t,j＝6.0hz,3h),2.41(s,3h),2.92(q,j＝6.0hz,2h),3.44(s,3h),6.91(bs,2h,-sonh2)；¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6):11.4,14.8,17.3,30.2,109.8,120.8,135.1,136.5,165.4；mscalcd.:245.06；msfound:245.05([m-1]^-)。

合成例7-3.化合物x2c的合成

与合成例7-1同样地合成化合物x2c。得到作为淡褐色固体的化合物x2c(收率13％，hplc纯度96.0％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ1.16(t,j＝6.0hz,3h),2.95(q,j＝6.0hz,2h),3.24(s,3h),6.84(bs,2h,-sonh2),12.8(bs,1h,-cooh)；¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6):14.0,18.1,31.9,108.6,123.1,128.1,128.8,131.3,131,6,135.1,142.2,166.6.；mscalcd.:307.08；msfound:307.09([m-1]^-)。

合成例7-4.化合物x2d的合成

与合成例7-1同样地合成化合物x2d。得到作为淡黄色固体的化合物x2d(收率24％，hplc纯度99.3％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso_d6):δ1.14(t,j＝6.0hz,3h),2.98(q,j＝5.6hz,2h),3.27(s,3h),7.10(bs,2h,-sonh2),7.32(m,2h),7.41(m,3h),12.3(bs,1h,-cooh)；¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6):14.5,31.8,39.5,121.3,128.3,128.4,128.5,131.1,132.2,136.7,136.8,160.0；mscalcd.:307.08；msfound:307.03([m-1]^-)。

合成例7-5.化合物x4的合成

与合成例7-1同样地合成化合物x4。得到作为淡黄色固体的化合物x4(收率24％，hplc纯度87.5％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso_d6):δ1.06(t,j＝6.0hz,3h),1.27(d,j＝6.0hz,6h),2,83(q,j＝6.0hz,2h),2.90(m,1h),3.60(s,3h),4.27(bs,1h,-cooh),6.95(bs,2h,-sonh2)；mscalcd.:273.09；msfound:273.06([m-1]^-)。

合成例8.化合物x3a的合成

按照上述反应式合成化合物x3a。具体而言，如下进行合成。

进行3-氧代戊酸乙酯1和1-溴-2-丁酮2的偶联，合成二酮酸酯3。即，在氮气氛下向具备温度计和搅拌器的30ml双口茄型烧瓶中加入氢化钠(60％in液体石蜡，139mg，3.48mmol，1.20eq.)和thf(5.5ml)并进行冰冷。接着，向得到的灰色悬浮液中滴加3-氧代戊酸乙酯1(418mg，2.90mmol)。此时，确认发泡和发热(0.7℃→12.5℃)。在冰浴中搅拌30分钟，由此向形成透明溶液的反应液中滴加1-溴-2-丁酮2(482mg，3.48mmol，1.10eq.)的thf溶液(2.0ml)，在冰浴中继续搅拌。反应液从透明溶液变为白浊液。滴加2小时后利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到3-氧代戊酸乙酯1的残留和新的点(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝9/1，rf值：0.3)。将反应液升温至室温，再搅拌2.5小时。同样使用tlc进行分析，但3-氧代戊酸乙酯1与室温升温前相比，由点的浓度考虑反应得以进行，但未确认到消失。将反应液冰冷后，加入饱和氯化铵水溶液(20ml)和乙酸乙酯(20ml)，停止反应(具有发热：0.8℃→15.7℃)。分离两层之后，用乙酸乙酯(30ml)提取水层两次，将合并后的有机层用饱和氯化钠水溶液(40ml)清洗，加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂后，将滤液在减压下浓缩，得到黄色油状物质894mg，将得到的粗生成物利用山善制造的中压制备型液相色谱仪(硅胶)进行精制。使用作为溶出液。浓缩目标物的流出组分，在40℃下真空干燥1小时，得到作为无色透明液体的原料1混合存在22.3mg(3.6wt％)的二酮酸酯3624mg(混合物中的二酮酸酯3的重量602mg，收率97％)。

使用n-氨基邻苯二甲酰亚胺4进行paal-knorr吡咯合成，合成邻苯二甲酰亚胺吡咯5。即，在氮气氛下向具备搅拌器和dimroth冷却器的10ml茄型烧瓶中加入二酮酸酯3(lot.5187301，602mg，2.81mmol)和n-氨基邻苯二甲酰亚胺4(455mg，2.81mmol，1.00eq.)，再加入乙酸(3.6ml)并在室温下搅拌(n-氨基邻苯二甲酰亚胺4不溶)。将油浴温度设置为130℃左右，使反应液回流(在浴温80℃左右溶解完n-氨基邻苯二甲酰亚胺4)。1小时后，利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认二酮酸酯3的残留和新的点(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝4/1，rf值：0.3)。再进行回流3小时之后，同样地进行tlc分析，但残留二酮酸酯3。追加n-氨基邻苯二甲酰亚胺4(91.1mg，0.56mmol，0.2eq.)，回流30分钟之后，进行tlc分析，结果二酮酸酯3的点变薄，因此，再进行18小时回流。利用tlc分析反应液(uv，磷钼酸)，确认到极薄的二酮酸酯3的残留，但停止加热，停止反应。将乙酸在减压下馏去，加入乙酸乙酯(40ml)和蒸馏水(30ml)，搅拌5分钟。分离两层之后，将水层用乙酸乙酯(30ml)提取，将合并后的有机层用饱和碳酸氢钠水溶液(40ml)清洗，用ph试纸调节为ph＝9左右。用饱和氯化钠水溶液(30ml)清洗之后，加入硫酸钠干燥。将干燥剂滤除后，将滤液在减压下浓缩，得到黄色固体1.01g，将得到的粗生成物用山善制造的中压制备型液相色谱仪(硅胶)进行精制。使用作为溶出液。浓缩目标物的流出组分，在40℃下真空干燥1小时，由此得到作为白色晶体的邻苯二甲酰亚胺吡咯5596mg(收率62％)。

使用氯硫酸进行氯磺化，合成磺酸氯化物6。即，向具备搅拌器并充分氮置换后的10ml螺帽试管中加入氯硫酸(1.1ml，16.55mmol，10.09eq.)，在冰浴中搅拌(注意发烟)。向其中一点点加入邻苯二甲酰亚胺吡咯5(lot.5188011，596mg，1.75mmol)之后，密闭并升温至室温(橙色透明溶液)。17小时后，利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到邻苯二甲酰亚胺吡咯5的消失和新的点(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝4/1，rf值：0.2)。另外，取少量反应液，用氘代氯仿测定1hnmr，确认到吡咯环的质子消失(褐色溶液)。向冰冷后的蒸馏水(40ml)中缓慢滴加反应液，由此停止反应。将水层用二氯甲烷(40ml)提取两次之后，向合并后的有机层中加入硫酸钠，进行干燥。滤除干燥剂后，将滤液在减压下浓缩，得到淡褐色油状物质，在40℃下真空干燥1小时，得到淡褐色无定形晶体(amorphouscrystals)的磺酸氯化物6410mg(收率72％)。

将得到的磺酸氯化物6与氨/二噁烷溶液反应，合成磺酸酰胺7。即，向具备搅拌器的30ml茄型烧瓶装入磺酸氯化物6(lot.5187201，369.3mg，0.84mmol)，在冰浴下加入0.5m氨/二噁烷溶液(7.3ml,3.64mmol,4.32eq.)之后，在室温下进行搅拌。4小时后利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，新确认到两种点(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝1/1，rf值：0.4和0.02)。减压馏去氨/二噁烷溶液，将得到的粗生成物利用山善制造的中压制备型液相色谱仪(硅胶)进行精制。使用作为溶出液。未得到认为是目标物的流出组分，将作为替代而主要得到的流出组分浓缩，并在40℃下真空干燥1小时，由此得到作为白色无定形晶体的磺酸酰胺768.0mg(收率19％)、和磺酸酰胺7’170mg(收率46％)。

使磺酸酰胺7和7’与肼反应，合成n-氨基吡咯8。即，向具备搅拌器和冷却管的30ml茄型烧瓶中装入磺酸酰胺7和7’(lot.5188232，合计295mg，0.68mmol(均以7’计))，加入乙醇(2.4ml)并搅拌。在室温下加入肼一水合物(d＝1.03)(328μl，6.75mmol，10.0eq.)，然后加热至100℃并搅拌。1小时后利用tlc进行分析(uv，磷钼酸)，确认到磺酸酰胺7和7’以及反应中间体消失，并确认到两种点(展开溶剂：己烷/乙酸乙酯＝1/1，rf值：0.5和0.03)。减压馏去反应液，将得到的粗生成物利用山善制造的中压制备型液相色谱仪(硅胶)进行精制。加料时，使用dmso溶解粗生成物。使用作为溶出液。将得到的流出组分浓缩，并在40℃下真空干燥1小时，得到n-氨基吡咯8的dmso溶液。再将dmso溶液通入安装有进样柱的山善制造的中压制备型液相色谱仪(作为溶出液使用)，除去dmso，由此得到作为白色晶体的n-氨基吡咯8128mg(收率65％)。

使n-氨基吡咯8与2mlioh/h2o反应，合成化合物9(x3a)。即，向具备搅拌器的10ml螺帽试管中装入n-氨基吡咯8(lot.5189181，96mg，0.33mmol)。加入2mlioh/h2o(717μl，1.433mmol，4.32eq.)和乙醇(143μl)，并在100℃下搅拌。1小时后，通过hplc分析确认到n-氨基吡咯8的消失。将反应液冷却至室温之后，通过1m盐酸调节至ph＝4～4.5左右，析出白色沉淀。将反应液转移至50ml茄型烧瓶中，在减压下浓缩(淡黄色固体)。向体系内加入甲醇(1ml)，通过超声波处理使固体完全溶解。加入氯仿(19ml)后，将溶液在冰箱(约-10℃)中静置一晚。通过抽滤回收所析出的固体(10.1mg)。将母液在减压下浓缩。将合并后的粗生成物用于山善制造的中压制备液相色谱仪(使用)，进行精制。合并溶出有化合物9的流出组分，并进行减压浓缩，在50℃下减压干燥2小时，由此得到作为淡黄色固体的化合物9(收率51％)。

¹h-nmr(400mhz,dmso-d6):δ1.09(t,j＝6.0hz,3h),1.09(t,j＝7.2hz,3h),2.91-2.98(m,4h),5.64(bs,2h,-n-nh2),7.24(bs,2h,-sonh2).¹³c-nmr(100mhz,dmso-d6):δ1.09。

合成例9.化合物x3b的合成

能够如下所述那样合成化合物x3b。

向具备搅拌器的500ml三口茄型烧瓶中加入2-溴吡咯1(3.9g,15.85mmol)和dmf(95ml)，在室温下搅拌。向其中加入氰化铜(i)(7.1g，79.24mmol，5.0eq.)和碘化钾(184mg，1.11mmol，0.07eq.)，在120℃下搅拌。搅拌17小时。反应结束后，用乙酸乙酯(95ml)稀释后，加入蒸馏水(95ml)，通过硅藻土过滤滤除固体。将滤液分液后，用乙酸乙酯(100ml)提取水层。合并有机层，用5％氯化钠水溶液(300ml)清洗三次。向有机层中加入硫酸钠进行干燥。滤除干燥剂后，将滤液在减压下浓缩，得到褐色油状的粗生成物3.12g。将得到的粗生成物利用山善制造的中压制备型液相色谱仪(硅胶)进行精制。使用作为溶出液。浓缩流出组分，得到作为淡黄色固体的2-氰基吡咯2(2.49g，82％)。

在冰浴下，向具备搅拌器的300ml茄型烧瓶中加入1,2-二氯乙烷(42ml)、氯硫酸(7.23ml，12.73mmol，10.0eq.)，在冰浴下搅拌。向其中滴加2-氰基吡咯2(2.1g，10.93mmol)的1,2-二氯乙烷(13ml)溶液，在室温下搅拌40分钟。反应结束后，在冰冷下向反应液中加入五氯化磷(11.38g，54.63mmol，5.0eq.)，在60℃下加热搅拌1小时。将反应液冷却至室温后，滴加至冰冷后的蒸馏水(200ml)中，停止反应。分液后，用二氯甲烷200ml提取水层，合并有机层，用硫酸钠干燥。滤除干燥剂后，将滤液在减压下浓缩，得到作为橙色油状物质的磺酸氯化物3的粗生成物(3.41g，粗收率107％)。

在具备搅拌器的300ml茄型烧瓶中，在冰冷下，向磺酸氯化物3的粗生成物(3.41g，11.73mmol)中加入0.5m氨/二噁烷溶液(101ml，50.67mmol，4.32eq.)，室温下搅拌15小时。反应结束后，通过过滤除去不需要的物质，得到作为灰白色固体的磺酰胺4(1.32g，42％)。

向具备搅拌器的1000ml茄型烧瓶中加入磺酰胺4(933mg，3.442mmol)、氯化镍(ii)(446.0mg，0.369mmol，1.0eq.)、甲醇(177ml)和thf(177ml)，在室温下搅拌。向其中加入硼氢化钠(390.6mg，10.32mmol，3.0eq.)，在室温下搅拌30分钟。30分钟后，再追加硼氢化钠(390.6mg，10.32mmol，3.0eq.)，在室温下搅拌。1小时后，再加入氯化镍(ii)(446.0mg，0.369mmol，1.0eq.)、硼氢化钠(390.6mg，10.32mmol，3.0eq.)，在室温下搅拌5小时。加入蒸馏水(100ml)，停止反应。通过抽滤滤除不溶物。将滤液在减压下浓缩，得到白色固体的粗生成物。将得到的粗生成物利用中压制备型液相色谱仪(溶出液：)进行精制，得到作为淡黄色固体的胺5(355.6mg，收率38％)。

可知在从胺5向x3b转换中，若使用通常的碱性条件，则遊离的氨基和磺酰胺的环化反应优先进行。因此，如下的krapcho反应是有用的，即，在dmso中与氯化锂一起加热，并在中性条件下将甲基酯向羧酸引导(途径1)。另外，向遊离的胺5中导入boc基团(叔丁氧基羰基)之后，水解甲基酯，并在酸性条件下将boc基团脱保护(途径2)。最终均制成盐酸盐，由此能够良好地合成x3b。

4.化合物的分析2

试验例9.酶活性测定试验

使用金属-β-内酰胺酶(imp-1)(最终浓度10nm)，并且使用亚胺培南(最终浓度100μm)作为基质，使作为抑制剂的测试物质(化合物no.9-7、no.9-8、no.9-9)的浓度分别变化(0μm、10μm、100μm)，测定各点处的吸光度298nm、30℃条件下的亚胺培南分解活性(δabs/min)。将测试物质为0的情况下的活性设为100％，计算添加测试物质时的活性相对值。

将结果示于表3。表3中，最左列表示作为抑制剂的测试物质。

[表3]

如表3所示可知，通过添加化合物no.9-7、no.9-8和no.9-9，能够抑制β-内酰胺酶活性。

试验例10.药敏试验5

使用x2a、x2b、x2c、x2d、x3a和x4作为用作抑制剂的测试物质，除此之外，与试验例1同样进行。抑制剂浓度设为10μg/ml。

将结果示于表4。表4中，最左列表示作为抑制剂的测试物质。

[表4]

如表4所示可知，通过添加化合物x2a、x2b、x2c、x2d、x3a和x4，对于产β-内酰胺酶菌的抗菌药的mic降低。

试验例11.抑制常数(ki)测定试验2

使用x2a、x2b、x2c、x2d、x3a和x4作为用作抑制剂的测试物质，除此之外，与试验例6同样进行。

将结果示于表5。表5中，最左列表示作为抑制剂的测试物质。

表5

如表5所示可知，通过添加化合物x2a、x2b、x2c、x2d、x3a和x4，抑制β-内酰胺酶活性。

试验例12.动物试验(小鼠腹腔感染模型)1

将导入有编码实验用菌株(b类β-内酰胺酶(imp-1)的质粒的大肠杆菌株)感染给小鼠之后，给药测试物质(化合物a)，观察生死。具体而言，如下进行。

用灭菌棉签刮取在穆勒-欣顿琼脂培养基上发育1晚后的实验用菌株，并将其悬浮于生理盐水，调节至2-5x10⁸cfu/ml之后，与10％粘蛋白溶液等量混合(1-2.5x10⁸cfu/ml)，制作菌液。测定购入后驯化4天后的小鼠(crl:cd1(icr)(雄性、4周龄(日本charlesriver))的体重之后，每只小鼠腹腔给药所制作的菌液250μl以使其感染。另一方面，将抗菌药(美罗培南3水合物(wako137-15674))和测试物质利用生理盐水溶解。感染1小时后，进行第一次的抗菌药(0.2mg/kg)和/或测试物质(100mg/kg)的腹腔给药。感染3小时后，也与第一次同样，进行第二次的给药(至此为day0)。由第二天(day1)起每天定时观察生死，并记录存活率。

将结果示于图10。可知通过给药化合物a，存活率显著提高。

试验例13.动物试验(小鼠腹腔感染模型)2

作为实验用菌株，除导入有编码b类β-内酰胺酶(imp-1)的质粒的大肠杆菌株之外，使用导入有编码ndm和vim的质粒的细菌(k.pnuemoniae)，给药化合物i作为测试物质。抗菌药给药量采用0.8mg/kg或4mg/kg，测试物质给药量采用10mg/kg。除此之外，与试验例12同样进行。

将结果示于图11和12。可知通过给药化合物i，存活率显著提高。

试验例14.动物试验(小鼠腹腔感染模型)3

使用导入有编码ndm和vim的质粒的细菌(k.pnuemoniae)作为实验用菌株，给药化合物x2d作为测试物质。抗菌药给药量采用2mg/kg或8mg/kg，测试物质给药量采用10mg/kg。除此之外，与试验例12同样进行。

将结果示于图13。可知通过给药化合物x2d，存活率显著提高。

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