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用于改善热稳定性的蛋白质制剂添加剂的制作方法

2021-01-08 13:01:50|390|起点商标网
用于改善热稳定性的蛋白质制剂添加剂的制作方法

本发明涉及包含赋形剂的蛋白质制剂,所述赋形剂适合于改善针对变性和失活的热稳定性。具体地,本发明涉及用于使疫苗制剂热稳定化的添加剂以及用于制备这些制剂的方法。

现有技术

蛋白质或肽以多种药物形式(例如,疫苗)在商业上使用。其中许多包含蛋白质和基于蛋白质的结构/复合物。所述蛋白质通常通过重组dna技术或其他手段产生。疫苗制剂中使用的蛋白质可以是细菌或病毒来源的。所述蛋白质可分为几类,包括但不限于毒素、类毒素或突变的蛋白质。此外,疫苗可以例如以表位疫苗、化学灭活的毒素(类毒素)、糖蛋白或缀合蛋白的形式从所述细菌或病毒蛋白/肽衍生,其中药学活性物质与载体蛋白共价结合。这些实体可以包括蛋白质-蛋白质缀合物(例如,破伤风类毒素)、融合蛋白、蛋白质-多糖缀合物、蛋白质-核酸缀合物、蛋白质-dna缀合物、蛋白质-rna缀合物、蛋白质-小分子缀合物、蛋白质-染料缀合物、蛋白质-矾吸附物、发光或生物发光蛋白质、生物素化蛋白质。另外,蛋白质形成病毒片段的构建模块之一。

从化学观点看,蛋白质是由氨基酸残基(这些氨基酸残基通过肽键共价连接在一起形成线性的无支链的多肽链)构成的大的有机分子或大分子,其相对分子量为几千至几百万da。蛋白质作为药物的有用特性取决于采用独特的三维折叠构象的多肽链,即蛋白质的三级结构。正是这种独特的折叠导致蛋白质对它将识别的分子具有高度选择性。然而,维持独特的三维结构的能力恰恰是使多肽在人和动物疾病中的使用充满困难的障碍之一。

因此,维持疫苗或蛋白质颗粒抗降解的能力是提供适当免疫服务的主要挑战,因为众所周知,生物材料(包括溶液中的生物材料)由于热、氧化剂、盐等而易于失活。

疫苗中使用的病毒颗粒、细菌和其他感染原处在环境温度下短时间后很容易失活,但低温储存的成本很高。即使短暂暴露于高温,也会导致疫苗活性丢失,即使在低温下也会限制疫苗的使用并增加成本,从而限制疫苗的分发,尤其是在不发达的第三世界国家中。

从文献中知道,高达80%的疫苗接种计划成本是由于冷链问题(用于使疫苗保持低温),这意味着必须使疫苗保持低温并保持其有效性。

通常,这要求从生产到施用始终保持冷藏疫苗-这是一项重大任务,尤其是在发展中国家的偏远地区。

被称为冷链问题,与保护疫苗免于退化相关的高成本和高风险已被世界卫生组织确定为扩展全球疫苗接种计划的最重要挑战之一。因此,存在多种稳定免疫制剂的方法,并且已经尝试通过添加低成本的生物相容性添加剂并减慢病毒颗粒的降解来解决该问题。例如,提出通过添加阴离子金纳米颗粒(10-8–10-6m)或聚乙二醇(peg,分子量~8,000da,10-7–10-4m)以将表达绿色荧光蛋白的腺病毒在37℃下的半衰期从~48h增加到21天(在室温下从7天增加到>30天)来改善5型腺病毒的储存时间。还已知蔗糖(其以低浓度添加)的稳定化作用。发现添加peg和蔗糖可以维持在37℃下储存10天的病毒的体内免疫原性。但是这些稳定化作用不足以在超过60℃的高温下实现储存稳定性。但是,后者是在热带地区安全使用疫苗制剂所必需的,并且就这一点而言,令人惊讶的是,液体蛋白质制剂(如疫苗制剂)目前在没有会导致对高于60℃的温度的热稳定性的任何特定的热稳定剂或赋形剂的情况下产生。其中一个原因是在现有疫苗中添加添加剂通常意味着要再次通过卫生部门的昂贵批准程序,这在商业上没有吸引力。因此,期望通过添加添加剂或赋形剂(优选通过已经被认为是药物组合物的相容组分的那些)来使疫苗制剂稳定以防止在高温下失活。如在pellicca,m.等人的综述中所提到的,一种方法是在疫苗制剂中添加蔗糖(pelliccia,m.等人additivesforvaccinestoragetoimprovethermalstabilityofadenovirusesfromhourstomonths.nat.commun.7,13520doi:10.1038/ncomms13520(2016))。还已建议将海藻糖、甘油、葡萄糖、麦芽糖和棉子糖用于这种用途,但所希望的效果只有在高浓度下而不是在高于40℃的温度下才能发现。如pellicca,m.等人所报道的,最有效的热稳定添加剂peg已被证明不适用于疫苗制剂,因为多达50%的人对其表现出过敏反应。

在wo2012/125658a1中,提供了用于产生免疫原特别是不稳定的免疫原的经稳定化的疫苗组合物的方法,其中口服颗粒在约25℃至约50℃,优选在约30℃的温度下用抗原性病毒培养物雾化,使得免疫原包衣干燥到颗粒上。疫苗产品含有具有约0.1%w/w至10%w/w的水分含量的颗粒,以得到经稳定化的疫苗组合物。

在us2013/209503a1中,通过首先提供多糖-蛋白质缀合物来稳定冷冻干燥和冻干的疫苗组合物,所述多糖-蛋白质缀合物通过选自蔗糖、乳糖、海藻糖、右旋糖、木糖、纤维二糖、棉子糖、异麦芽糖和环糊精的无定形赋形剂与选自柠檬酸盐、组氨酸、磷酸盐、tris、琥珀酸盐和乙酸盐缓冲液的盐的缓冲液的组合来稳定。

另外,有一系列的出版物和专利文献试图以类似的方式解决较高温度下相应蛋白质制剂的稳定性问题,但代价是在施加前需要重新建立可注射溶液。然而,后者在不发达国家和危机地区将是一个重大问题。在此,就升高的环境温度而言,即使蛋白质制剂稳定性改善几小时也将代表改善。

发明目的

热稳定性和冷链中断是确保向特别是贫困国家的偏远地区递送稳定疫苗剂量的主要障碍。目前,疫苗在运输过程中被冷藏,但是由于无法保证持续冷藏,因此运送到发展中国家的所有液体疫苗剂量的25%和所有冻干疫苗剂量的50%被丢失。

本发明的主要目的是提供经热稳定化的疫苗制剂,其可以优选以与可比产品相同的质量获得,并且当在高达60℃及以上的温度下储存时其是长期稳定的。

发明概述和主题

将来自下文所列分子类别之一的赋形剂以最佳浓度添加至在水性缓冲液中配制的蛋白质或肽中。蛋白质或肽的熔解温度tm由此显著升高,使得可以耐受高达60℃及以上的高温。

本发明的另一主题是如下文公开的赋形剂,其在合适的浓度下赋予疫苗制剂足够的热稳定性,使得它们可以在高于60℃的温度下储存同时保持其折叠的蛋白质结构持续足够长时间。

本发明提供经稳定化的蛋白质溶液,其有利地具有约2.0mg/ml的相对高的浓度,其包含至少一种稳定剂,该稳定剂使包含的蛋白质的降解和失活最小化,这直接对维持蛋白质的功效具有积极影响,并允许将本发明的这些制剂储存和甚至运输到热带地区的不发达市场。

更具体地,本发明涉及一种用于使液体蛋白质制剂热稳定化的方法,其如权利要求1所述和根据权利要求2至16的特定实施方案中所述。本发明还包括如权利要求17至24中所述并且根据权利要求1至16的所述方法制备的制剂。本发明进一步的实施方案在于用于稳定的蛋白质制剂的权利要求25至27所述的试剂盒。

发明详述和优选实施方案

本发明涉及一种获得液态蛋白质或肽制剂的方法,该制剂是经热稳定化的,并且如果需要,处于可以直接使用的制剂中,其包含可以通过重组dna技术或其他方式产生的蛋白质、蛋白质缀合物(即蛋白质-糖、蛋白质-核苷酸、蛋白质-rna/dna或蛋白质-肽)、交联的蛋白质(例如经甲醛处理的蛋白质,例如破伤风类毒素)以及最终较大的结构或疫苗制剂中使用的其他蛋白质,其可以是细菌或病毒来源的,病毒蛋白亚基,酶,激素或其他。因此,在下文中,当提及蛋白质制剂时,总是也指肽制剂,除非明确提及含有一种或另一种的特定制剂。

本发明还涉及经稳定化的制剂,其中即使温度升高至高达60℃的值时,蛋白质也保持其折叠的有效结构。本发明还涉及这样的制剂,其保持其稳定化持续多达三天或甚至四天。有利地,可以通过将有效量的所选择的赋形剂加入到溶液(其任选地进行缓冲,并且将它们的ph调节至所含蛋白质的最佳范围)中来容易地获得经稳定化的蛋白质制剂。该制剂还可以包含还原剂。

制备本发明的液体制剂,其包含浓度为0.05至1.8mg/ml的蛋白质。所添加的赋形剂的热稳定化作用通过所含蛋白质的熔解温度的升高来证明;并且同时蛋白质熔解温度的升高是制剂中蛋白质热稳定性增加的指标。通过特定的实验发现,一方面,取决于蛋白质的类型和添加的赋形剂,必须添加不同量的赋形剂以实现所含蛋白质的所希望的稳定化,而根据所含蛋白质调节稳定化溶液中的ph值也是有利的。取决于赋形剂,对于所希望的蛋白质稳定化在蛋白质溶液中使用0.25至4m的浓度以最大程度地减少储存期间以及暴露于高于室温的温度(尤其是高于40℃的温度)期间的降解和失活。如前所述,蛋白质的可靠稳定化还特别取决于溶液的ph。取决于蛋白质,最佳ph可以在ph6至8的范围内,并有利地用合适的缓冲液设定。

以这种方式,可以稳定蛋白质溶液以抵抗高温的失活影响。取决于所添加的蛋白质和赋形剂,可以通过以下实验确定高达20℃的稳定化。为了改善热稳定性,仅考虑其中可以确定通过添加特殊的赋形剂使蛋白质熔解温度增加至少5℃的那些实验。

为了进一步使用,可以将这样经稳定化的制剂填充到瓶中用于进一步给药、稀释或处理。但是,它们也可以配制成免疫溶液,其任选地可以制成用于在药物注射瓶中使用的溶液,除非需要进一步处理或稀释。此外,在另一种应用形式中,可以在免疫测定测试试剂盒或用于分析的制剂和装瓶中呈递这样的经稳定化的蛋白质溶液。此外,可以以该方式稳定储备制剂,其被全球运输以用于后续的最终填充。

包含经热稳定化的蛋白质制剂的试剂盒还可以包含其他容器工具,其包含用于执行使用所述蛋白质制剂的方法所必需或方便的溶液。容器工具可以由玻璃、塑料或箔制成,并且可以是小瓶、瓶子、袋、管、包等。试剂盒可以包含书面信息,例如用于执行使用的方法的程序或分析信息,例如用于执行使用蛋白质溶液的方法的程序或分析信息,例如第一个容器工具中所含试剂的量。容器工具可以是与书面信息一起的另一个容器工具,例如盒子或包。

由于其是液体,因此在本发明的另一个实施方案中,可以将本发明的药物组合物预先配制以在以后制成以用于注射到活体内。在一个替代的实施方案中,药物组合物可以预先制成以引入到小型可植入泵或引入到其他装置中以用于治疗应用。

适合用作在本发明中使用的热稳定剂的赋形剂可以选自不同类型的有机分子。根据本发明使用这些物质的先决条件是它们与蛋白质或肽相容,并且如果以适当的浓度使用时它们在动物和人类有机体中均生理耐受而不会导致副作用或过敏反应。

包含蛋白质的液体制剂除了根据本发明添加的赋形剂之外,还可以包含一种或多种其他化合物,例如,氨基酸、蛋白质、螯合剂、缓冲液、盐、防腐剂、稳定剂、抗氧化剂、乳化剂、增塑剂或润滑剂。

肽是在氨基酸之间包含肽键的有机化学化合物。根据其数目,寡肽与具有许多氨基酸的少数多肽区别开。长多肽链也被称为蛋白质,特别是通过蛋白质生物合成形成的那些。由于肽和蛋白质的这种化学关系,因此如果在下文提及蛋白质,则意味着这两种类型的物质。

在文献中,表述“热稳定性”经常被使用,但是常常以一种误导性的方式使用。在文献中,这通常仅意味着蛋白质溶液可以在低于40℃的略微升高的温度下储存。通过将储存温度增加至40℃,该温度仍远低于许多蛋白质的解折叠转变中点(tm)(例如,anthraxpatm=48℃),蛋白质的自发解折叠速率升高。就平衡热力学而言,存在蛋白质可能在任何时间点自发解折叠的一定概率,但是这种解折叠事件的可能性是温度依赖性的。通过升高储存温度,增加了潜在的解折叠事件的频率,并因此可以在减少的时间段内评估蛋白质制剂的长期储存。

在此,根据本发明,表述“热稳定性”在蛋白质或肽在高于40℃,优选高于50℃,尤其是高达60℃的温度下的储存期间主要保持其天然的而不是解折叠的形式的背景中使用。

当前的分析工作涉及通过确定热应激蛋白的热力学转变中点来确定热稳定性。为此,检查模型分子或所选择的赋形剂的作用以确定其在高温下(这意味着在高于40℃,优选高达60℃的温度下)对模型蛋白结构的稳定化作用。同时,实验分析了热稳定赋形剂在哪个浓度范围内有效。

根据定义,引起>5℃的dtm的赋形剂是良好的稳定剂。如果dtm<5℃且>0℃,则将赋形剂定义为不良稳定剂。负的dtm将分子鉴定为蛋白质去稳定剂。

转变中点tm通过荧光光谱法测定,这意味着使用包含浓度为0.05-1.8mg/ml的蛋白质的蛋白质溶液的纳米差示扫描荧光测定法(nanodsf)。

将制备的蛋白质溶液以1℃/分钟的加热速率加热,并记录在350/330nm处的荧光发射比率,并相对于温度作图。通常,所得曲线类似于玻耳兹曼(boltzmann)函数,并且该曲线的拐点代表平均解折叠温度tm。从该曲线中,通过从tm赋形剂制剂中减去tm天然来确定tm的变化,从而得出dtm。

表述“折叠分数”在下文中使用,并表示液体制剂中天然蛋白质的量。其次,表述“热变性中点”也与蛋白质的稳定性结合使用,并且其定义了在任一方向上10%的偏差是可接受的。重要的是要注意,转变中点(也包括较高温度)的任何变化都是蛋白质构象或数据质量变化的结果。后者可以例如受到蛋白质聚集或许多其他作用的影响。因此,要求转变温度与初始测量值的偏差小于10%。

如本文所使用的术语“糖”是指分子量相对较低的一组水溶性碳水化合物中的任何一种。术语糖包括还原糖(例如麦芽糖)、非还原糖(例如蔗糖)、糖醇(例如山梨糖醇)和糖酸(例如乳糖酸)。

本文示出的所有范围旨在包括该范围的下限和上限。术语“约”旨在稍微涵盖给定的范围。在整个本申请中,术语“约”用于表示值包括用于确定值的方法的误差的标准偏差。

当在权利要求书和/或说明书中与术语“包含”结合使用时,词语“一个”或“一种”的使用可能意指“一个/一种”,但也与“一个或多个/一种或多种”、“至少一个/至少一种”和“一个或多于一个/一种或多于一种”的含义一致。

如本说明书和权利要求书中所使用的,词语“包含”(以及任何形式的“包含”,例如“包括”和“含有”)、“具有”(以及任何形式的“具有”,例如“含有”和“拥有”)、“包括”(以及任何形式的“包括”,例如“包含”和“含有”)或“含有”(以及任何形式的“含有”,例如“包含”和“包括”)是包含性的或开放性的,并且不排除其他未引用的元素或方法步骤。

还应特别理解,本文列举的任何数值都包括从下限值到上限值的所有值,即在所列举的最小值和最大值之间的数值的所有可能的组合被认为是在本申请中明确指出的。例如,如果将范围陈述为1%至20%,则意图在本说明书中明确地列举诸如2%至5%、10%至15%或3%至4.5%等的值。

“接触”是指使至少两种不同的物种接触以使得它们可以相互作用或反应的过程。

“赋形剂”通常是指添加以确保或增加治疗剂的稳定性(即用于长期稳定性)的化合物或材料。

“稳定的”制剂或组合物是其中在其中的生物活性材料或蛋白质在储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂或组合物。可以在选择的温度下在选择的时间段内测量稳定性。趋势分析可用于估计预期保存期限(在材料已实际储存该时间段之前估计)。

“药学上可接受的”是指在合理的医学判断范围内适合用于与人和低等动物的组织接触而没有不适当的毒性、刺激性、过敏反应等、与合理的收益/风险比相称并且有效用于其预期用途的那些活性剂、盐和赋形剂。

如上所述,将本发明的蛋白质溶液调节至特定的ph。为了保持ph值稳定,将适当的缓冲液添加至蛋白质溶液中。

可以以适于溶解和/或分散待溶解的蛋白质的载液的形式添加缓冲液。缓冲液通常选自药学上可接受的缓冲液系统。优选的缓冲液是药学上可接受的缓冲液系统,其具有在加入酸、碱、无机化合物、有机化合物或溶剂或稀释剂后抵抗ph变化的能力。包括缓冲组分例如磷酸盐或柠檬酸盐以控制含疫苗的溶液的ph,以及调节溶液的渗透性。缓冲液浓度可以在5mm至2m的范围内,其中溶液的ph调节至约ph4至约ph10的范围,优选调节至约ph6至约ph8的范围。

药学上可接受的缓冲液可以选自磷酸钾、磷酸钠、乙酸钠、组氨酸、咪唑、柠檬酸钠、琥珀酸钠、hepes、tris、bis-tris、碳酸氢铵和其他碳酸盐。缓冲液可包含约ph4至约ph10,优选约ph6至ph8,以及约ph6至约ph7的ph。

如果将一种或多种类型的糖添加至蛋白质溶液中,则所述糖优选选自单体和/或二聚体分子,并且特别地可以选自葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、麦芽酮糖、蜜二糖、蔗糖、海藻糖、乳糖、乳果糖、果糖、乳糖、甘露醇、山梨糖醇、木糖醇、纤维二糖、palatinose、松二糖、槐糖、黑曲霉糖及其组合。最优选的糖选自麦芽糖、蜜二糖、乳糖、乳果糖、纤维二糖、麦芽酮糖、palatinose、松二糖、槐糖、黑曲霉糖。水性热稳定化的溶液中糖的量可以从非常低的浓度到非常高的浓度。因此,为了稳定化,可以以相当少的量添加所选择的糖,但是如果所含的糖的浓度相当高,即当以数摩尔的量添加至溶液中时,通常存在特别有效的蛋白质的热稳定化。因此,已通过实验发现,如果所选择的赋形剂以0.25至4m/l蛋白质溶液的量添加,则可以获得特别好的稳定化结果。

水性溶液可进一步包含药学上可接受的表面活性剂、聚合物、氨基酸和其他药学上可接受的赋形剂。可以包含用于稳定蛋白质的聚合物。这些聚合物可以以0.1%w/v和更多的量添加。可以添加表面活性剂以降低表面张力和从表面置换蛋白质分子。表面活性剂还可增加其他制剂组分的溶解度。可以以按所述含蛋白质的制剂的重量计0.005%和更多的量包含表面活性剂。

可以包含二价阳离子和氨基酸以稳定蛋白质和调节溶液的ph和渗透性。二价阳离子的浓度可以在0.1mm至约100mm的范围内,并且可以以在约0.1%至约1%(w/v)的范围内的浓度包含氨基酸。

总之,这意味着取决于待使用的根据本发明的蛋白质或肽溶液以及取决于溶液中所含的蛋白质或肽的性质,可以添加最终制剂的不同组分。

优选地,根据本发明,热稳定赋形剂或热稳定赋形剂的组合选自以下种类的分子:

1)渗透压剂(osmolytes):三甲胺-n-氧化物;甜菜碱,4-羟基脯氨酸;鸟氨酸;瓜氨酸;n-乙酰丝氨酸;hydroxylectoine;肌醇,异肌醇,l-手性-肌醇,d-手性-肌醇

2)离子液体:磷酸二氢胆碱;氯化胆碱与糖、糖醇或多元醇例如葡萄糖、蔗糖、甘油或山梨糖醇的水合深度低共熔混合物;l-(+)-乳酸2-羟乙基-三甲基铵

3)盐:磷酸二氢盐化合物,例如磷酸二氢钾,磷酸二氢钙或磷酸二氢钠,乙酸铵,

4)糖:麦芽糖,蜜二糖,乳糖,乳果糖,纤维二糖,麦芽酮糖,palatinose,松二糖,槐糖,黑曲霉糖

5)糖酸及其盐:乳糖酸,乳糖酸钙,葡萄糖酸镁或葡萄糖酸钙

6)氨基糖:葡甲胺

7)糖醇:甘露醇,麦芽糖醇,山梨糖醇,

将热稳定性赋形剂以各种浓度添加至蛋白质制剂中。蛋白质浓度为0.05至1.8mg/ml。从100mm赋形剂开始可以检测到增加的热稳定性,但是在0.4-4m的范围内获得最佳结果。对于氯化胆碱和第二种组分的水合深度低共熔混合物以及对于l-(+)-乳酸2-羟乙基-三甲基铵,浓度以体积%表示。从15%开始可以检测到升高的热稳定性,并且使用95%的溶液获得最佳结果。

本发明的水性蛋白质溶液可以提供在初级容器中,例如在由玻璃或塑料/树脂制成的小瓶中,或者箔袋装置或任何其他合适且相容的装置。取决于所希望的后续用途,以这种方式提供的溶液可以以几微升的量至数升的量存在。

本发明提供了一种方法,通过该方法可以保护处于溶液中的药学和医学中使用的蛋白质或肽抵抗高温的去稳定化和失活影响,这意味着蛋白质可以是热稳定的。特别地,这种稳定化作用涉及保护抵抗蛋白质解折叠和聚集的发生,这通常导致蛋白质活性和/或药物功效的失活和丧失。本发明的方法适用于任何蛋白质或包含病毒蛋白质亚基的疫苗,其可以以微克的量使用。蛋白质可以是作为疫苗组分的蛋白质,但也可以是酶、激素或其他治疗性或分析性使用的蛋白质,例如,酶、抗体、纳米抗体或单抗体(monobody)。取决于蛋白质类型及其应用,溶液以不同的量、包装或装置提供,但也与所希望的应用组合物所需的其他物质组合提供。因此,它们可以是生物测定的一部分,或者可以作为溶液已经存在于应用或分析或诊断试剂盒中或含酶的分子生物学试剂盒中。这意味着,所述蛋白质可以包括在疫苗中以及诊断测定中以用于检测患有疾病的受试者的样品中的病原体。疾病的病原体可以来自感染、肿瘤或过敏原或其他。

如上所述,本发明涉及相应蛋白质制剂的热稳定化。通过计划的实验程序,使用上面列举的样品蛋白质研究了所选择的添加剂对热稳定性的影响。

为了通过添加如上文列出的合适的赋形剂测试尽可能不同的蛋白质的热稳定化,使用以下样品蛋白质进行实验:

酶,尤其是乳酸脱氢酶和溶菌酶作为模型酶,

疫苗蛋白尤其是anthraxpa(炭疽保护性抗原)、破伤风类毒素和白喉类毒素(crm197)作为模型疫苗。

为了通过添加一种或多种赋形剂来证明有效的热稳定化,制备了液体制剂,其包含浓度为0.05至1.8mg/ml的所述蛋白质。为此,制备蛋白质的储备溶液。另外,在适用的缓冲液中制备赋形剂储备溶液。将蛋白质、赋形剂和(如果需要)缓冲液合并以产生实施例中所述的制剂。如“实施例”一章所示,测试了在最有效和最适用的热稳定剂的存在下这些蛋白质的熔解温度(tm),因为蛋白质熔解温度的升高是液体制剂中蛋白质热稳定性增加的指标。

变性温度或熔解温度tm的测定可以对小体积使用差示扫描荧光测定法(nanodsf:prometheus.nt48,配备有标准毛细管,nanotempertechnologiesgmbh)以高通量方式进行。另外,对于某些制剂,使用圆二色光谱法测定tm以获得关于所述制剂中的蛋白质的额外结构信息(分光偏振计j-815,jascodeutschlandgmbh,使用来自hellma的0.1cm石英suprasil比色皿110-qs型)。

蛋白质和肽通常折叠成稳定的三维结构,其通过多肽链内残基的大量弱相互作用稳定化。通过升高制剂的温度,增加的热运动和其他因素导致蛋白质变性。为了定量蛋白质的热稳定性,使用被称为tm的温度。

tm代表本文针对模型蛋白的热诱导变性获得的平衡转变中点的温度。假设从天然状态到非天然状态(解折叠/部分解折叠)的两个状态转换,tm代表两个状态等同分布的温度。转变中点的测量受物质的动力学稳定性的影响,因此,只有在相同条件下获得的此类值才是可比较的。本文报告的所有tm值均以1℃/min的加热速率记录。添加赋形剂后升高的tm值指示蛋白质的稳定化。

蛋白质的变性可以通过各种光谱技术来测量,这些技术利用了蛋白质的特定光学性质。

差示扫描荧光测定法是一种基于荧光的方法,它利用了天然蛋白原性氨基酸色氨酸的特定发射特性。由于其两个独特的偶极轴,吲哚侧链的荧光发射是溶剂化显色的。当嵌入蛋白质内部(其是更亲脂性的环境)时,色氨酸通常显示约328-330nm的荧光发射最大值。当蛋白质变性时,色氨酸残基变得逐渐较少地与周围的水隔离。因此,色氨酸的发射最大值接近350nm。这种向更高波长的光谱迁移被称为红移。nanodsf通过记录蛋白质在330nm和350nm处的发射并将其比率相对温度进行作图来记录这种迁移。这通常导致具有正振幅的s形曲线。

荧光光谱学主要用于探测三级结构转变。应当注意,蛋白质的荧光光谱代表其中所含氨基酸的所有发射光谱的叠加,因此特定蛋白质的发射特性可能与上述值有所不同。

cd光谱利用手性物质或具有非对称结构的大分子(例如蛋白质)对圆偏振光的差异吸收。取决于所使用的波长范围,cd光谱可用于探测蛋白质的二级或三级结构。在此,我们仅使用cd光谱来获得有关蛋白质的二级结构的信息。天然折叠的蛋白质基于其结构组成表现出非常独特的cd光谱。在热诱导的解折叠后,圆偏振光的吸收差异减小,并且cd信号接近零。为了测定tm,将特定波长(通常为222nm、218nm、208nm或196nm)处的cd信号相对温度作图,然后用s形函数拟合。

无论使用哪种方法,存在蛋白质的特定特性,其报告蛋白质的结构特征。如果在添加赋形剂后转变中点升高,则添加的赋形剂使蛋白质稳定化。另外,可以通过添加赋形剂来修改s形曲线的陡度。曲线的陡度反映了蛋白质的动力学稳定性。尽管tm描述了蛋白质在哪个温度下解折叠,但解折叠曲线的陡度指示所述转变发生的速度。

在荧光光谱的情况下,附加特征可以改变s形曲线的行为。所述曲线可以显示负振幅,其指示荧光向较低波长的迁移,而不是先前描述的红移。这可以通过蛋白质聚集来解释。如果不是所有的色氨酸残基都被掩埋在蛋白质内,则天然折叠的蛋白质的发射可能在大于330nm的波长处。在解折叠后,色氨酸残基会更多地暴露于水,但是在聚集后,这些残基被掩埋在聚集体的亲脂性核内。尽管是负振幅,但仍可以使用s形拟合来测定反映蛋白质的热稳定性的温度。

现在,为了评估哪种添加剂或赋形剂最适合蛋白质的热稳定化,以及它们必须添加多少量的添加剂或赋形剂以产生所希望的效果,在第一步骤制备以anthraxpa为模型疫苗的测试制剂并在三天内进行检查。在“实施例”章节的表1中总结了详细的制剂组成。这些实验的目的是寻找最合适的赋形剂或赋形剂混合物,用于在几天内热稳定化不同来源的蛋白质组合物。

由于迄今为止必须以高浓度使用稳定剂,因此这种组合物不能用于制备预填充的注射器,因为患者可能不会耐受稳定剂。因此,在施用给患者之前需要稀释步骤。这些实验的另一个目的也是确定用于体外测定的稳定剂的最高可能耐受水平。基于实验结果,可以调节蛋白质浓度并生成疫苗储备溶液,其既可以为溶质蛋白质提供热保护,又可以在稀释后仍然有效地施用给患者。

例如,已经发现,患者最可能耐受高达250mm浓度的蜜二糖。然而,从先前的筛选中已知,至少需要2.25m的蜜二糖以在高温下稳定anthraxpa。因此,蛋白质浓度增加了2250mm(储备)/250mm(最终值)=9倍。但是对于患者使用,需要将这种经稳定化的疫苗储备制剂稀释至少9倍。

根据这些考虑,制备测试制剂以检查上文列举的模型蛋白,其赋形剂最适合作为生理上可接受的添加剂以用于在高于40℃,优选高于60℃的温度下的最可能的热稳定化。从在液体药物制剂中被认为患者可接受的可用潜在赋形剂中,首先选择乳果糖和麦芽糖作为有前景的温度稳定化添加剂,并且用这些添加剂制备相应的蛋白质制剂并进行检查。还在相同条件下测试了tmao、磷酸二氢胆碱和蜜二糖,并将结果与乳果糖和麦芽糖的结果进行了比较。

首先,样品是掺入了所选择的赋形剂的这些样品,其适当地经受荧光光谱以验证所有蛋白质样品均是天然折叠的,以及然后确定它们是否合适以在升高的温度下(包括在升高的蛋白质水平(高达1.8mg/ml)下)稳定蛋白质。在这些测试之后,在指定的温度下(尤其是在4℃和在50℃至60℃的范围内,以及如果合适,在更高的温度下)进行温育。测试已显示,特别地,当将蜜二糖作为稳定添加剂添加至蛋白质制剂中时,通常发生更好的热稳定化,并且制剂通常在较高的温度下是稳定的并且具有较高的熔点,如可以通过熔解曲线和转变中点的测定证明的。

为了验证各种赋形剂在更长的时间段内的热稳定化作用,在6小时、24小时、32小时、48小时和72小时的温育时间后,取少量样品,并通过荧光光谱评估包含的蛋白质的结构状态和稳定性。

为了确定所检查的含蛋白质的样品是否仍然是天然的或受损的状态,现在在实验过程中通过荧光光谱反复监测两个参数。第一个参数涉及液体制剂中受损或解折叠的蛋白质的量。第二个参数涉及热变性中点。(但是,对于所测定的数据的质量和可靠性至关重要的是所测定的转变温度的偏差小于10%。该偏差可能是由各种作用(例如聚集或其他影响)引起的。)

基于进行的实验,已发现通过添加根据本发明的所选择的赋形剂,对于蛋白质制剂可以实现温度稳定性的显著改善。例如,在其天然制剂中,anthraxpa具有48℃的解折叠转变温度,这不允许在50℃或50℃以上储存。在此温度下,anthraxpa立即变性。但实验已表明,如果制剂中包含适量的tmao或磷酸二氢胆碱,anthraxpa在高达50℃仍是稳定的。此外,蜜二糖、麦芽糖适用于将液体anthraxpa制剂在55℃稳定至少三天。如果在储存过程中将储存温度升高至60℃,则在与蜜二糖一起配制时,该制剂保持稳定至少6个小时。

但是,并非总是在所有情况下都能得到可比较的结果。例如,在液体制剂中crm197的热稳定性的评估与anthraxpa制剂的评估略有不同。用荧光光谱测定时,crm197的天然制剂显示出双相解折叠转变。最初的转变与结构的局部损失有关,而在整体范围内,蛋白质保持结构完整。这就是对于研究crm197的稳定性必须采用不同的标准的原因。在这种情况下,需要两次修改的条件。首先,解折叠温度中值不能用作读出,因为由于结构局部损失发生构象扰乱,这不能通过简单地添加所选择的赋形剂来稳定化。另外,其初始转变的变化可能影响第二解折叠温度的测定,导致基于其的整体结构状态的错误评估。其次,对crm的温度依赖性区域造成的损害的程度影响350nm至330nm的荧光发射率。为了评估本文测试的赋形剂的作用,将所有结果与在约50℃温育并变性的在其天然制剂中包含该蛋白的制剂中测量的结果进行比较。在相同条件下,crm197在53℃的温度下在其天然制剂中显示解折叠。通过向相应的crm197制剂中添加蜜二糖或麦芽糖,当该制剂在50℃下温育时,解折叠被显著抑制至少72小时。在此温度下,而且在55℃下,蜜二糖的添加具有稳定化作用持续甚至96小时,而麦芽糖仅使crm197稳定化72小时。在60℃下温育逆转该比例。测量的结果表明,在60℃下麦芽糖使crm197稳定化48小时,而在60℃下蜜二糖仅使crm稳定化24小时的温育时间。此外,tmao、磷酸二氢胆碱、乳果糖已被证明是crm197的合适稳定剂。如前所述,当在50℃下温育时,这些赋形剂也稳定化至少72小时的时间,而在55℃和60℃下蜜二糖和麦芽糖仍然稳定化。

通过在蛋白质制剂中添加tmao、磷酸二氢胆碱、乳果糖、蜜二糖和麦芽糖,可以使制剂热稳定化三天,其中以高达1.8mg/ml的浓度包含蛋白质。蛋白质可以是疫苗蛋白。它可以是蛋白质,诸如anthraxpa(炭疽保护性抗原)或例如crm197或类似的蛋白质。蛋白质可以是异源表达的蛋白质或过表达的蛋白质。

实验鉴定了含有anthraxpa或crm作为蛋白质的液体蛋白质制剂的最佳稳定化。anthraxpa制剂包含5mmhepes作为缓冲液和50mmnacl。作为稳定性赋形剂,以2.25m的浓度包含蜜二糖,并且制剂的ph值为7.5。所述crm制剂包含20mmhepes作为缓冲液和150mmnacl。作为稳定性赋形剂,以2.4m的浓度包含蜜二糖,并且该制剂的ph值为8.0。

如对于使用anthraxpa和crm197的先前实验和研究所提到的,还测试了具有乳酸脱氢酶和溶菌酶为模型蛋白的制剂的热稳定化。以合适的浓度添加表1的赋形剂,并测试其可能的热稳定化作用。在此背景下,还从离子液体的组中测试并选择了其他潜在的热稳定剂,它们是四种可生物降解的化合物并且它们是基于可在人体中常见的化合物进行选择和制备的:氯化胆碱发现于胆汁中,而葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和甘油是在各自的糖或脂肪途径中的天然代谢产物。

在此背景下,通过在本文进行的对所述疫苗和酶蛋白的热稳定化的研究已经发现,取决于溶液中所含的蛋白质,必需调节添加的赋形剂的浓度以显示出作用。还已经发现,相同的赋形剂可以取决于其浓度和蛋白质类型而表现出不同的作用。

出乎意料的是,基于发现的结果,不能容易地从所选择的赋形剂属于某一物质类别这一事实假定它也是溶液中特定蛋白质的良好热稳定性添加剂,因为相关的物质对另一种蛋白质提供良好的结果。

研究的总结结果表明,添加的使测试的蛋白质的熔解温度发生最大变化并显示出最广泛的适用性和适合作为所测试的所有三种疫苗蛋白的稳定剂的赋形剂属于非常不同的物质组。

这些赋形剂是tmao、磷酸二氢胆碱、蜜二糖、麦芽糖和乳果糖。

a)tmao从250mm的浓度开始显示出热稳定化作用。在溶液中浓度在1m至4m范围内时获得最佳的稳定化结果。

b)磷酸二氢胆碱从1摩尔溶液开始显示出热稳定化作用。当浓度在2m至4m范围内时,对组合物发现最佳结果。

c)蜜二糖从250mm开始显示出热稳定化作用。在本文中,当浓度在1m至2.5m范围内时,对组合物发现最佳结果。

d)麦芽糖从500mm开始显示出热稳定化作用。当浓度在1m至1.8m范围内时,对组合物发现最佳结果,

e)乳果糖从250mm开始显示出热稳定化作用。当浓度在0.5m至1.7m范围内时,对组合物发现最佳结果。

在下一章“实施例”中显示并评论了相应的结果。

此外,本文还研究了以乳酸脱氢酶和溶菌酶作为模型蛋白的制剂。以适当的浓度添加上述赋形剂,并测试其可能的热稳定化作用。对于稳定乳酸脱氢酶相应地进行的实验表明,4-羟基脯氨酸、l-鸟氨酸、乳糖酸和磷酸二氢钾是良好的热稳定剂,这意味着所述赋形剂使ldh的热转变中点升高了5℃或更多。

除此之外,还基于在人体中常见的化合物选择并制备了来自离子液体、四种可生物降解的离子液体的组的其他潜在的热稳定剂:氯化胆碱发现于胆汁中,而葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和甘油是在各自的糖或脂肪途径中的天然代谢产物。在三个步骤中将相应的离子液体制备为水合深度低共熔混合物。首先,将0.5摩尔的氯化胆碱与相应量的两种糖(山梨糖醇和葡萄糖)组分混合,并以0.2摩尔的量使用(比例5:2)。甘油以0.5摩尔的量使用(比例1:1)。蔗糖以0.125摩尔的量使用(比例4:1),并添加20%w/wh2o。

此处的测试已表明,乳酸胆碱和氯化胆碱与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物是乳酸脱氢酶的良好热稳定剂。

4-羟基脯氨酸、l-鸟氨酸、磷酸二氢钾、乳糖酸和葡甲胺显示出对乳酸脱氢酶(ldh)所需的热稳定化作用。被鉴定为适合热稳定化ldh的赋形剂也用于热稳定化疫苗蛋白的实验中。这些筛选实验已表明,在含有疫苗蛋白的制剂中,乳果糖和麦芽糖是良好的热稳定剂。

在使用酶溶菌酶的实验中,乳酸胆碱和氯化胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物被鉴定为良好的热稳定剂。

然而,由于添加的赋形剂的热稳定化作用在每种情况下都不令人满意,因此另外测试了组合使用的两种赋形剂的协同作用是否将改善该两种分子的热稳定化作用。接下来,将盐和离子液体彼此组合以及与渗透压剂和糖酸组合。所有实验均使用在相应的天然制剂(50mm磷酸钠,1mmdtt(1,4-二硫苏糖醇),ph7.6)中的乳酸脱氢酶进行。将蛋白质浓度调节至0.05mg/ml的浓度。

在此发现,磷酸二氢钾和乳糖酸的组合引起与可从个体组分所预期的相似的对ldh的热稳定性水平。该结果表明,如果相应的盐和糖酸在这种蛋白质溶液中彼此相容,则它们的使用将导致加性作用。该结果通过使用磷酸二氢钾和4-羟基脯氨酸(其引起对ldh的相似水平的热稳定化作用)的组合得到证实。

使用磷酸二氢钾与氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物的组合的结果不太清楚并可以总结如下:

盐和离子液体的热稳定化作用

-与离子液体相比盐过量存在时是相容的和加性的

-与盐相比离子液体过量存在时是不相容的,但仍是热稳定化的。

但是,在模型蛋白乳酸脱氢酶的组合物中氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物与乳糖酸的不同组合的作用是不同的。在此背景中,可以得出的结论是,在该模型组合物中离子液体和糖酸的相互作用为:

-离子液体和糖酸的相互作用是浓度依赖性的。

-离子液体和糖酸的相互作用还依赖于离子液体与糖酸的比例。

-当使用足够过量的离子液体时,观察到两种赋形剂对蛋白质的热稳定性的协同作用。

-这种协同作用所需的离子液体与糖酸的比例随着离子液体分数的增加而增加。

-糖酸的浓度必须为最少0.25m以观察到两种赋形剂的协同作用。

在包含乳酸脱氢酶的模型蛋白组合物中,氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物与4-羟基脯氨酸(一种氨基酸)的不同组合的作用在整个浓度范围内和所测试的比率范围内具有对ldh的协同热稳定化作用,引起比对于两种单一组分所预期的作用高5%至36%的热稳定性。

这些组合对疫苗蛋白的作用是相似的。

在此第三组所选择的赋形剂中,发现根据定义,在某些条件下,磷酸二氢钾、磷酸二氢胆碱、乳酸胆碱和氯化胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物可以被分类为良好的热稳定剂。

进行所有测试的评估后发现

1.存在可以稳定蛋白质制剂以抵抗升高的温度的有害影响的许多赋形剂。

a.稳定性化合物/分子或赋形剂属于选自以下的组:4-oh-脯氨酸;l-鸟氨酸;乳糖酸;磷酸二氢钾;l-(+)-乳酸2-羟乙基-三甲基铵;氯化胆碱和第二种组分(山梨糖醇或葡萄糖或蔗糖或甘油)的水合深度低共熔混合物;乳糖;乳果糖;麦芽糖;蜜二糖;葡甲胺;磷酸二氢胆碱;tmao;甜菜碱;hydroxylectoine;ectoine);肌醇;瓜氨酸;乙酸铵;葡萄糖酸镁;甘露醇;三(2-羟乙基)甲基硫酸甲基铵。

b.特别有效的热稳定剂为:4-oh-脯氨酸;l-鸟氨酸;乳糖酸;磷酸二氢钾;l-(+)-乳酸2-羟乙基-三甲基铵;氯化胆碱和第二种组分(山梨糖醇或葡萄糖或蔗糖)的水合深度低共熔混合物;乳糖;乳果糖;麦芽糖;蜜二糖;葡甲胺;磷酸二氢胆碱;tmao;甜菜碱;hydroxylectoine。

c.最有效和最广泛适用的赋形剂是tmao,磷酸二氢胆碱,乳果糖,麦芽糖,蜜二糖。

2.每种赋形剂所需的浓度范围不同,和其中每种个体赋形剂a)稳定特定蛋白质和b)在高于蛋白质仍然有效的温度多于5℃的温度下稳定特定蛋白质的范围也不同。

3.实验表明,表4中列出的每种赋形剂都能在高于60℃的温度下稳定蛋白质。

4.所述赋形剂与生物学/生物化学中使用的各种各样的缓冲液(hepes、磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液、柠檬酸盐缓冲液)相容。

5.所述赋形剂可以在6至8的ph范围内使用。

6.所述赋形剂与还原剂(即dtt)相容。

7.所述赋形剂与氯化物盐相容。

8.实验表明,蜜二糖和麦芽糖适合抑制蛋白质聚集。

9.所测试的赋形剂通过使蛋白质的三级结构稳定化、通过使蛋白质的熔球态稳定化或通过抑制溶解的单体的聚集来提供热稳定化。

[熔球态是蛋白质的紧密的部分折叠的构象,其具有接近天然的紧密性、显著的二级结构、很少可检测的三级结构以及相对于天然状态而言增加的溶剂暴露的疏水表面积。(anthonylfink,universityofcalifornia,santacruz,california,usa,2001年在线出版)]

10.两种赋形剂的组合使用可具有非常不同的作用:

a.与糖酸组合的盐表现出加性行为:产生的tm的变化类似于个体组分引起的解折叠温度的变化的总和。

b.与渗透压剂组合的盐表现出加性行为:产生的tm的变化类似于个体组分引起的解折叠温度的变化的总和。

c.与渗透压剂组合的盐表现出加性行为:产生的tm的变化类似于个体组分引起的解折叠温度的变化的总和。

d.与氯化胆碱和山梨糖醇的水合深度低共熔混合物组合的盐表现出复杂的行为:

i.当盐的使用超过离子液体时,表现出加性行为

ii.当离子液体的使用超过盐时,仍然是热稳定的,但效率低于两个个体组分的总和

e.与乳糖酸组合的氯化胆碱和山梨糖醇的水合深度低共熔混合物:

i.离子液体和糖酸的相互作用是浓度依赖性的

ii.离子液体与糖酸的相互作用还依赖于离子液体与糖酸的比例

iii.当使用足够过量的离子液体时,观察到两种赋形剂对蛋白质的热稳定性的协同作用。

iv.这种协同作用所需的离子液体与糖酸的比例随着离子液体分数的增加而增加

v.糖酸的浓度必须为最少0.25m以观察到两种赋形剂的协同作用f.与渗透压剂/氨基酸组合的氯化胆碱和山梨糖醇的水合深度低共熔混合物对ldh具有协同的热稳定化作用,引起比两个个体组分的作用所预期的热稳定性高5%-36%的热稳定性

通过在测试溶液中配制一组不同的蛋白质以研究先前检查的赋形剂的影响来获得上述结果以及通过添加蜜二糖和麦芽糖的聚集抑制。所选择的蛋白质来自细菌和动物来源。这些蛋白质中有酶、造孔剂和两种灭活的毒素。一种毒素通过突变失活,而第二种毒素通过甲醛交联失活。

由于已经用这些不同的蛋白质获得了这些结果,因此可以从这些结果推断这些所选择的赋形剂的添加在其中包含可溶性蛋白质作为主要组分的制剂中产生相似的作用。

从这些结果得出的另一个结论也是可接受的,即当其他组分与相应蛋白质共价结合时,例如,如果所述蛋白质是蛋白质-蛋白质缀合物(例如,破伤风类毒素)、融合蛋白、蛋白质-多糖缀合物、蛋白质-核酸缀合物、蛋白质-dna缀合物、蛋白质-rna缀合物、蛋白质-染料缀合物、蛋白质-生物素缀合物或蛋白质-矾吸附物,也发生这些作用。

如本文公开的特定蛋白质制剂的制备可以通过如上所述的方法和以下实施例中所示的方法进行。

结合给定示例的本说明书使得本领域普通技术人员能够全面地实践本发明。

下面给出的用于举例说明本发明的实施例将结合以下各节中的结果进行详细评论。这些评论还用于在各种蛋白质制剂的背景中广泛地描述本发明。

因此,即使没有进一步的评论,也假定本领域普通技术人员将能够在最广泛的范围内利用以上描述。

如果有任何不清楚的地方,应理解应参考技术人员引用和已知的出版物和专利文献。因此,所引用的文献被认为是本说明书的公开内容的一部分,并且通过引用并入本文。

为了更好的理解并举例说明本发明,下面给出实施例,它们在本发明的保护范围之内。这些实施例还用于举例说明可能的变型。

此外,对于本领域的普通技术人员而言不言而喻的是,在给出的实施例以及说明书的其余部分中,组合物中存在的组分的量始终仅合计为100重量%或mol%(基于整个组合物),并且即使从所示的百分比范围可产生更高的值,也不能超过该百分比。因此,除非另有说明,否则百分比数据是重量百分比或摩尔百分比,但在体积数据中显示的比例除外。

实施例

在本文使用模型蛋白,例如乳酸脱氢酶(兔肌肉)和溶菌酶(鸡卵,白色),以及疫苗蛋白,例如炭疽保护性抗原(anthraxpa)、破伤风类毒素和白喉类毒素(crm197),通过上文列出的一种或多种赋形剂的添加来证明有效的热稳定化。制备液体制剂,其包含浓度为0.05至1.8mg/ml的蛋白质。下面描述的是这些蛋白质在经测试的最有效和最适用的热稳定剂存在下的熔解温度。蛋白质熔解温度的增加是制剂中蛋白质热稳定性增加的指标。

材料和方法

表1:

1)渗透压剂:

实例tmao

a)制备由缓冲剂(磷酸二氢钠、hepes、组氨酸)组成的缓冲液,并将ph值调节为7或7.5或8。

b)tmao以4.2m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph重新调节至ph7或7.5或8。

c)将疫苗蛋白炭疽保护性抗原或crm197或破伤风类毒素添加至赋形剂。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为4m。

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较

e)结果:tmao使炭疽保护性抗原的熔解温度增加20℃,使破伤风类毒素的熔解温度增加3℃,使白喉类毒素的熔解温度增加7℃

2)离子液体:

实例磷酸二氢胆碱

a)将磷酸二氢胆碱以4m的浓度溶解在水中,将ph调节至ph7或7.5或8

b)将疫苗蛋白炭疽保护性抗原或crm197或破伤风类毒素添加至赋形剂。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为3m。

c)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较

d)结果:磷酸二氢胆碱使炭疽保护性抗原的熔解温度增加19℃,使破伤风类毒素的熔解温度增加5℃,使白喉类毒素的熔解温度增加13℃

3)盐:

实例磷酸二氢钾

a)制备包含缓冲剂(磷酸二氢钠、hepes、组氨酸)的缓冲溶液,并将ph值调节至7、7.5或8。

b)将磷酸二氢钾以1.2m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph重新调节至ph7或7.5或8。

c)将疫苗蛋白炭疽保护性抗原或crm197或破伤风类毒素添加至赋形剂。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为1m。

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较。

e)结果:磷酸二氢钾使炭疽保护性抗原的熔解温度增加10℃,使破伤风类毒素的熔解温度增加2℃,使白喉类毒素的熔解温度增加5℃

4)糖:

实例乳果糖

a)制备由缓冲剂(磷酸二氢钠、hepes、组氨酸)组成的缓冲液,并将ph值调节为7或7.5或8

b)将乳果糖以2m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph重新调节至ph7或7.5或8

c)将疫苗蛋白炭疽保护性抗原或crm197或破伤风类毒素添加至赋形剂。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为1.7m

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较

e)结果:乳果糖使炭疽保护性抗原的熔解温度增加18℃,使破伤风类毒素的熔解温度增加超过20℃(设备不允许在如此高的温度下精确测量tm),使白喉类毒素的熔解温度增加24℃

其他结果:通过蜜二糖防止聚集

(图28和29)

将蜜二糖以2.75m的浓度溶解在缓冲溶液中,并将ph调节为7或7.5或8。

将炭疽保护性抗原或crm197或破伤风类毒素的疫苗蛋白悬浮液添加至赋形剂溶液。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为2m或2.4m或2.5m.

结果:

当使用2m或2.4m赋形剂时,白喉类毒素的聚集被抑制至高达80℃的温度。当使用2.5m赋形剂时,没有观察到聚集。

当使用2.4m或2.5m赋形剂时,破伤风类毒素的聚集受到抑制。

5)糖酸及其盐:

实例乳糖酸

a)制备由缓冲剂(hepes、组氨酸)组成的缓冲液,并将ph调节为7或7.5

b)乳糖酸以0.6m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph重新调节至ph7或7.5

c)将疫苗蛋白炭疽保护性抗原或破伤风类毒素添加至赋形剂。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为0.5m

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较

e)结果:乳糖酸使炭疽保护性抗原的熔解温度增加7℃,使破伤风类毒素的熔解温度增加4℃

6)氨基糖:

实例葡甲胺

a)制备由缓冲剂(磷酸钠或柠檬酸钠)组成的缓冲溶液,并将ph调节为6或7.6

b)将葡甲胺以3m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph重新调节至ph6或7.6[如果ph为7.6,则添加1mmdtt(1,4-二硫苏糖醇)]

c)将蛋白质乳酸脱氢酶或溶菌酶添加至赋形剂溶液。蛋白质浓度为0.1mg/ml。赋形剂浓度为1.5m。

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较。

e)结果:葡甲胺使乳酸脱氢酶的熔解温度增加3℃,使溶菌酶的熔解温度增加6℃

7)氨基醇:实例甘露醇

a)制备由缓冲剂(磷酸钠)组成的缓冲溶液,并调节ph值为6或7.6。

b)将甘露醇以0.5m的浓度溶解在缓冲溶液中,将ph值重新调节至ph7.6,添加1mmdtt。

c)将蛋白质乳酸脱氢酶以导致0.1mg/ml的蛋白质浓度的量添加至赋形剂溶液中。赋形剂浓度为0.45m。

d)蛋白质-赋形剂混合物的熔解温度通过差示扫描荧光测定法测量,并与不含赋形剂的蛋白质溶液进行比较。

e)结果:甘露醇使乳酸脱氢酶的熔解温度增加2℃。

图1总结了添加的显示出最佳性能的赋形剂的结果。这意味着,总结了添加的赋形剂的结果,这些赋形剂使所测试的蛋白质的熔解温度变化最大,并且显示出最广泛的适用性。这些赋形剂适合作为所测试的所有三种疫苗蛋白的稳定剂。出乎意料的是,发现这些是以下赋形剂,其本身属于非常不同的物质组:

f)tmao从250mm的浓度下开始显示出热稳定化作用。在溶液中浓度在1m至4m范围内时获得最佳的稳定化结果。

g)磷酸二氢胆碱从1摩尔溶液开始显示出热稳定化作用。当浓度在2m至4m范围内时,对组合物发现最佳结果。

h)蜜二糖从250mm开始显示出热稳定化作用。在本文中,当浓度在1m至2.5m范围内时,对组合物发现最佳结果。

i)麦芽糖从500mm开始显示出热稳定化作用。当浓度在1m至1.8m范围内时,对组合物发现最佳结果,

j)乳果糖从250mm开始显示出热稳定化作用。当浓度在0.5m至1.7m范围内时,对组合物发现最佳结果。

图2总结了关于各种赋形剂在最佳条件下引起的熔解温度变化的结果:

实验设置和考虑因素

为了评估最适合用于热稳定化的添加剂或赋形剂以及需要添加以产生所需效果的量,制备以anthraxpa为疫苗的测试制剂并在三天内进行检查。本章末尾的表2总结了详细的制剂组成。这些实验的目的是寻找最合适的赋形剂或赋形剂混合物以用于在数天内蛋白质组合物的热稳定化。

由于迄今为止必须以高浓度使用稳定剂,因此这种组合物不能用于制备预填充的注射器,因为患者可能不会耐受稳定剂。因此,在施用给患者之前需要稀释步骤。这些实验的另一个目的也是确定用于体外测定的稳定剂的最高可能耐受水平。基于实验结果,可以调节蛋白质浓度并生成疫苗储备溶液,其既可以为溶质蛋白质提供热保护,又可以在稀释后仍然有效地施用给患者。

例如,发现患者最可能耐受高达250mm浓度的蜜二糖。从先前的筛选中已知,至少需要2.25m的蜜二糖以在高温下稳定anthraxpa。因此,蛋白质浓度增加了2250mm(储备)/250mm(最终值)=9倍。因此,至少需要九倍量的疫苗储备制剂。

根据这些考虑,制备了用于研究作为温度稳定添加剂的tmao、磷酸二氢胆碱、乳果糖、麦芽糖和蜜二糖的测试制剂。荧光光谱用于验证是否所有蛋白质样品均是天然折叠的,并且所选择的赋形剂是否还可以热稳定升高的蛋白质浓度(高达1.6mg/ml)。然后在以下温度下进行温育:

4℃:天然(无赋形剂):这些是不变化的对照样品。

50℃:天然(无赋形剂),tmao,磷酸二氢胆碱,乳果糖,麦芽糖

55℃:tmao,磷酸二氢胆碱,乳果糖,蜜二糖,麦芽糖

60℃:tmao,磷酸二氢胆碱,乳果糖,蜜二糖,麦芽糖

65℃:蜜二糖

与所有其他赋形剂相比,蜜二糖在更高的温度下进行测试,因为基于转变中点它引发更高的热稳定性。

在6小时、24小时、32小时、48小时和72小时的每个温育时间后,取少量样品,并通过荧光光谱评估包含的蛋白质的结构状态和稳定性。

表2:本文使用的测试制剂的总结。

分析参数

以下各节中给出的结果基于通过荧光光谱测定的两个参数。随时间监测这两个参数的变化,以确定anthraxpa是否仍然是天然的或是否已被破坏。需要下文描述的两个读出来找出包含的蛋白质在整个实验过程中是否保持稳定。

anthraxpa在高于50℃的温度下被稳定化

在其天然制剂中,anthraxpa具有48℃的解折叠转变温度,这不允许蛋白质在50℃或更高的温度下储存。图3显示了通过荧光光谱测定的anthraxpa在50℃下的储存稳定性。

图3:anthraxpa在50℃下的稳定性。

图3a)(左)折叠的分数。天然配制的anthraxpa显示天然折叠的蛋白质的立即下降。所有经测试的热稳定剂都防止这样的衰减。

图3b)(右)标准化的转变温度。红线之间的数据指示蛋白质是稳定的。

没有热稳定性赋形剂的anthraxpa立即变性。所有所选择的赋形剂均稳定化并允许在50℃下储存72小时。

图4显示了anthraxpa在55℃下的储存稳定性。

图4:anthraxpa在55℃下的稳定性。

图4a)(左)折叠的分数。

图4b)(右)标准化的转变温度。红线之间的数据指示蛋白质是稳定的。

当将测试制剂在55℃下温育时,发现蜜二糖和麦芽糖两者均能够引起足够的热稳定化,以允许在55℃下储存三天。

另外,将anthraxpa在60℃下温育三天。参考结果如图5所示。

图5:anthraxpa在60℃下的稳定性。

图5a)(左)折叠的分数。红线以下的数据指示稳定的蛋白质。

图5b)(右)标准化的转变温度。红线之间的数据指示蛋白质是稳定的。

在60℃下,本文使用的赋形剂的热稳定化能力结束。只有蜜二糖能够允许短暂暴露于60℃超过6小时,但少于24小时。

crm197在高于50℃的温度下被稳定化

当用荧光光谱测定时,在其天然制剂中的crm197显示出双相解折叠转变。最初的转变与结构的局部损失有关,而在整体范围内,蛋白质保持结构完整。尽管本文使用的赋形剂对crm的整体结构稳定性有作用,但无法防止结构的更多局部损失。因此,在研究crm的稳定性时,不能使用与anthraxpa相同的标准。

为了进行数据解释,需要进行以下两个修改:首先,解折叠温度中值不能用作读出。已经确定构象扰乱是由于不能被本文所用的赋形剂稳定的结构局部损失而发生。此外,该初始转变的变化可能影响第二解折叠温度的测定,并导致基于此的整体结构状态的错误评估。其次,对crm的温度依赖性区域造成的损害的程度影响350nm至330nm的荧光发射率。因此,结构损坏的扩展可能是一个上限,而不是实际的结构损失程度。为了评估本文测试的赋形剂的作用,将所有结果与其在50℃下温育并变性的天然制剂中的蛋白质进行比较。

在其天然制剂中,crm197具有53℃的整体解折叠温度,这不允许在50℃下长时间储存。因此,阴性对照将是在50℃温育的天然配制的crm。在图6中,显示了蜜二糖和麦芽糖对crm的热稳定性的作用。

图6:crm197在50℃下的稳定性。蜜二糖和麦芽糖明显抑制热诱导的解折叠,持续3-4天。

结果表明,麦芽糖在50℃下使crm197稳定72小时。蜜二糖在50℃下使crm稳定96小时。

图7显示了crm197在55℃下的储存稳定性。

图7:crm197在55℃的稳定性。蜜二糖和麦芽糖明显抑制热诱导的解折叠,持续3-4天。

结果表明,麦芽糖在55℃下使crm197稳定72小时。蜜二糖在55℃下使crm稳定化96小时。

图8依次显示了crm197在60℃下的储存稳定性。

图8:crm197在60℃的稳定性。蜜二糖和麦芽糖明显抑制热诱导的解折叠,持续3-4天。

值得注意的是,与55℃或50℃相比,在60℃下6小时折叠的分数更大,但与天然制剂的和完全变性的crm仍存在明显差异。这些测试的结果表明,麦芽糖在60℃下使crm197稳定48小时。蜜二糖在60℃下使crm稳定24小时。

热稳定酶作为蛋白质的进一步实验

如先前对使用anthraxpa和crm197的实验和研究所述,本文还研究了以乳酸脱氢酶和溶菌酶作为模型蛋白的制剂。以适当的浓度添加上文所述的赋形剂,并测试其可能的热稳定化作用。

a.基于氯化胆碱的离子液体的制备

基于在人体中常见的化合物选择并制备了来自离子液体、四种可生物降解的离子液体的组的其他潜在的热稳定剂:氯化胆碱发现于胆汁中,而葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇和甘油是在各自的糖或脂肪途径中的天然代谢产物。

在三个步骤中将离子液体制备为水合深度低共熔混合物。首先,将0.5摩尔的氯化胆碱与两种糖(山梨糖醇和葡萄糖)组分的各自量混合,并以0.2摩尔的量使用(比例5:2)。甘油以0.5摩尔的量使用(比例1:1)。蔗糖以0.125摩尔的量使用(比例4:1)。然后在搅拌下将制备的混合物加热至100℃持续两小时。尽管除甘油和山梨糖醇外,其他物质均不会在此温度下变成液态,但这些特定的混合物开始熔解。随后,将20%w/w添加至混合物中,并且当固体物质完全熔解时,将产生的离子液体冷却至室温,在室温下它们保持其液体形式。

为了将用于使用以这种方式制备的离子液体进行热稳定化的物质的量与仅溶于水/缓冲液的其他赋形剂进行比较,测定所得液体的体积,并计算其中氯化胆碱(就好像它被溶解了)的浓度。通常,制备约100-150ml的离子液体,其呈现3.3-4m摩尔浓度的氯化胆碱。

b.实验方法

如之前所述,通过荧光光谱测定包含的蛋白质的解折叠转变中点,这意味着通过纳米差示扫描荧光测定法(nanodsf)允许高通量筛选。

在这里,蛋白质以0.05-0.1mg/ml的浓度使用,而赋形剂被滴定至接近其在所施加缓冲液中的溶解度的浓度。然后将适量的蛋白质溶液与适量的赋形剂溶液混合,并将混合物在室温下平衡15分钟。

将制得的蛋白质溶液以1℃/分钟的加热速率加热,并记录在350/330nm处的荧光发射比率,并相对于温度作图。通常,所得曲线类似于玻耳兹曼函数,并且该曲线的拐点代表平均解折叠温度tm。

从该曲线中,通过从tm赋形剂制剂中减去tm天然来确定tm的变化,从而得出dtm。

根据定义,引起>5℃的dtm的赋形剂是良好的稳定剂。如果dtm<5℃和>0℃,则将赋形剂定义为不良稳定剂。负的dtm将分子鉴定为蛋白质去稳定剂。

c.使用乳酸脱氢酶作为模型酶的结果

将乳酸脱氢酶(ldh)配制成ph7.6的50mm磷酸钠、1mmdtt。为了探测分子对ldh的作用,将所述分子以各种浓度添加至正是在该缓冲液中配制的蛋白质中。蛋白质以0.05mg/ml的浓度使用。

图9:显示了赋形剂候选物对ldh的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使ldh稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

图9显示了在此阶段来自多种化合物的组的第一组赋形剂及它们对ldh的熔解温度的作用。根据定义,4-羟基脯氨酸、鸟氨酸、乳糖酸和磷酸二氢钾是良好的热稳定剂,而其他物质例如ectoine、肌醇和瓜氨酸由于对ldh的tm的相对较小的作用而不适合用于测试的目的。

图10显示了ldh的熔解温度dtm的变化,其是通过添加na-ser、oh-lys、胆碱乳酸、胆碱cl/山梨糖醇、胆碱cl/甘油、胆碱cl/葡萄糖、胆碱cl/蔗糖来测定的。

图10:赋形剂候选物对ldh的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将适合于使ldh稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。为了对水合深度低共熔液体使用与其他赋形剂相同的图,基于所用材料的重量和所制备液体的体积来估算氯化胆碱的摩尔浓度。

在这组赋形剂中,乳酸胆碱和磷酸二氢胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物被鉴定为良好的热稳定剂,并进入第二预筛选步骤。

在接下来的测试中,测试了乳果糖、葡萄糖酸镁、聚蔗糖400、甘露醇、麦芽糖和乙酸铵对ldh的热稳定性的影响。这些赋形剂在本文中被鉴定为适合用于热稳定化ldh。图11:显示乳果糖、葡萄糖酸镁、聚蔗糖400、甘露醇、麦芽糖和乙酸铵对ldh的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使ldh稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

特别地,乳果糖和麦芽糖被鉴定为良好的热稳定剂。乙酸铵、葡萄糖酸镁和甘露醇也被鉴定为蛋白质稳定剂。

d.使用溶菌酶作为模型酶的结果

将溶菌酶配制为ph6.0的20mm柠檬酸钠、55mmnacl和1mmdtt。为了探测分子对溶菌酶的作用,将所述分子以各种浓度添加至正是在该缓冲液中配制的蛋白质中。蛋白质以0.1mg/ml的浓度使用。

图12:羟基脯氨酸、l-瓜氨酸、l-鸟氨酸、磷酸二氢钾、乳糖酸、葡甲胺、ectoine、肌醇和甲基磺酸对溶菌酶的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。

从这组分子中,羟基脯氨酸、l-鸟氨酸、磷酸二氢钾、乳糖酸和葡甲胺显示出所需的热稳定化作用。ectoine、三(2-羟乙基)甲基硫酸甲基铵(meoso3)和瓜氨酸无法足够地使溶菌酶稳定化。

图13显示了在溶菌酶:离子液体中测试的第二组物质的结果。

图13:赋形剂候选物对lyz的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。根据前述定义,能够将使lyz稳定化多于5℃的分子被鉴定为良好的热稳定剂。为了对水合深度低共熔液体使用与其他赋形剂相同类型的图,基于所用材料的重量和所制备液体的体积来估算氯化胆碱的摩尔浓度。

在这里测试的赋形剂候选物中,乳酸胆碱和磷酸二氢胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物被鉴定为良好的热稳定剂。

在表3中示出了对于使至少一种模型蛋白稳定5℃或更高的每种赋形剂使用的浓度范围的总结。通常,给出赋形剂摩尔浓度。对于离子液体,给出了所用赋形剂的体积百分比,因为仅一种组分的摩尔浓度会产生误导。

表3:

dnq:不合格;无:没有测试的浓度引起所需的热稳定性

结果显示使用乳酸脱氢酶的赋形剂组合的效率

为了进行初步的可行性评估,测试了彼此组合的各种赋形剂的相容性。目的是阐明组合使用的两种赋形剂的协同作用是否会改善两种分子的热稳定化作用。将盐和离子液体彼此组合以及与渗透压剂和糖酸组合。所有实验均在相应的天然制剂(50mm磷酸钠,1mmdtt,ph7.6)中使用乳酸脱氢酶进行。将蛋白质浓度调节至0.05mg/ml的浓度。将ldh添加至包含不同比例和浓度的两种赋形剂的溶液中。制备的组合物在室温下温育15分钟。然后,如上文所述,使用纳米差示扫描荧光测定法以1℃/min的加热速率测量ldh的平均解折叠温度。

图14总结了磷酸二氢钾和乳糖酸的组合的结果

图14:磷酸二氢钾和乳糖酸的不同组合对模型蛋白乳酸脱氢酶的作用-蓝色表示组合的制剂的tm的测量的变化。以黑色和红色堆叠的分别是针对个体赋形剂测定的tm的变化。如果蓝色条超过黑色和红色的堆叠条,则将检测到协同作用。

发现磷酸二氢钾和乳糖酸的组合引起与可从个体组分所预期的相似的对ldh的热稳定性水平。相对而言,当使用这种组合时,可以观察到90%至104%的热稳定效果。

这得出结论,相应的盐和糖酸在这种蛋白质溶液中是相容的,并导致加性作用。

图15总结了磷酸二氢钾和4-oh-脯氨酸的组合结果。

图15:磷酸二氢钾和乳糖酸的不同组合对模型蛋白乳酸脱氢酶的作用。蓝色表示组合的制剂的tm的测量的变化。以黑色和红色堆叠的分别是针对个体赋形剂测定的tm的变化。如果蓝色条超过黑色和红色的堆叠条,则将得出协同作用的结论。

发现磷酸二氢钾和4-oh-脯氨酸的组合引起与如果添加个体组分可预期的相似的对ldh的热稳定性水平。相对而言,当组合使用这些组分时,可以观察到95%至100%的热稳定效果。

因此,得出结论,盐和渗透压剂的热稳定化作用是相容的,并且以加性方式起作用。

图16总结了磷酸二氢钾和氯化胆碱/山梨糖醇组合的结果

图16:磷酸二氢钾和氯化胆碱与山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物的不同组合在模型蛋白乳酸脱氢酶中的作用。蓝色表示组合的制剂的tm的测量的变化。以黑色和红色堆叠的分别是针对个体赋形剂测定的tm的变化。如果蓝色条超过黑色和红色的堆叠条,则将得出协同作用的结论。

在此观察到,当与磷酸二氢钾相比,氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物过量使用时,磷酸二氢钾与氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物的组合是不相容的。与盐相比,离子液体过量的情况下,发现58%至81%的有效性。但是,当盐以过量于离子液体进行添加时,两者的热稳定化作用在99-102%的范围内是加性的。

因此,盐和离子液体的热稳定化作用表现如下:

-与离子液体相比盐过量存在时是相容的和加性的

-与盐相比离子液体过量存在时是不相容的,但仍是热稳定的。

图17总结了添加胆碱cl/山梨糖醇和乳糖酸的组合的结果。这些结果比之前测试的组合的数据更复杂。

图17:氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物与乳糖酸的不同组合在模型蛋白乳酸脱氢酶组合物中的作用。蓝色表示组合的制剂的tm的测量的变化。以黑色和红色堆叠的分别是针对个体赋形剂测定的tm的变化。如果蓝色条超过黑色和红色的堆叠条,则将得出协同作用的结论。

取决于所含离子液体的浓度,观察到不同的相互作用:如果仅使用低浓度的离子液体(0.5m)并且以2:1的比例添加乳糖酸,则获得协同作用,并且模型蛋白比个体组分所引起的更稳定。

使用1.5摩尔离子液体,观察到类似的作用,但是在这些条件下,需要更多过量的离子液体以产生协同作用。当过量的离子液体增加到6倍时,发现协同稳定化。在很高浓度的离子液体(2.5m)的情况下,只能探测到小浓度的乳糖酸的作用。使用超过乳糖酸10倍过量的离子液体导致两者的协同作用。但是,当仅使用0.15m的乳糖酸(16:1)时,更可能观察到加性作用。

对于模型组合物中离子液体和糖酸的相互作用,得出以下结论:

-离子液体和糖酸的相互作用是浓度依赖性的

-离子液体和糖酸的相互作用也取决于离子液体与糖酸的比例

-当使用足够多过量的离子液体时,观察到两种赋形剂对蛋白质的热稳定性的协同作用

-这种协同作用所需的离子液体与糖酸的比例随着离子液体分数的增加而增加

-糖酸的浓度必须为最少0.25m以观察到两种赋形剂的协同作用图18总结了氯化胆碱/山梨糖醇和4-oh-脯氨酸的组合的结果

图18:氯化胆碱和山梨糖醇(摩尔比5:2)的水合深度低共熔混合物与4-羟基脯氨酸的不同组合在包含乳酸脱氢酶的模型蛋白组合物中的作用。蓝色表示组合的制剂的tm的测量的变化。以黑色和红色堆叠的分别是针对个体赋形剂测定的tm的变化。如果蓝色条超过黑色和红色的堆叠条,则将得出协同作用的结论。

测量的结果表明,在测试的整个浓度范围和比例下,离子液体与氨基酸的组合对ldh具有协同的热稳定化作用,导致比两个单一组分所预期的作用高5%至36%的热稳定性。

下表4列出了所使用的赋形剂组合、其浓度范围及其对ldh的作用的总结。

表4:

*摩尔浓度基于所产生的体积中氯化胆碱的量。

使用疫苗蛋白筛选热稳定性赋形剂

在下一章中,讨论了使用三种相当不同的疫苗蛋白对赋形剂分子的筛选结果。并非所有潜在的赋形剂分子都在所有疫苗蛋白上进行了测试。目的是鉴定能够将三种非常不同的蛋白质的平均解折叠温度增加至60℃以上的温度的赋形剂分子。

实验方法

我们采用荧光光谱来测定我们的蛋白质的解折叠转变中点。具体来说,我们使用允许高通量筛选的纳米差示扫描荧光测定法。

蛋白质以0.1mg/ml的浓度使用,其良好对应于市售疫苗剂量的蛋白质浓度。将赋形剂滴定至接近其溶解度极限的浓度。所有赋形剂均在疫苗蛋白的天然制剂缓冲液中制备,磷酸二氢胆碱除外。将后者溶解于水中,并调节ph以匹配天然疫苗蛋白制剂的ph(详细信息见下文)。在这种情况下,磷酸二氢根离子将充当缓冲剂。将蛋白质与赋形剂混合,并使其在室温下平衡15分钟。

使用炭疽保护性抗原筛选热稳定性赋形剂

炭疽保护性抗原(anthraxpa)是炭疽疫苗的主要蛋白质组分。它的天然制剂是ph为7.5的5mmhepes和50mmnacl。天然平均解折叠温度为48℃。在测试中使用三个类别的赋形剂来稳定anthraxpa:糖、离子液体/盐和渗透压剂。将获得的结果与使用海藻糖的结果进行比较,海藻糖是用于各种目的的广泛使用的赋形剂。

图19显示了使用糖热稳定化anthraxpa的结果。

图19:作为赋形剂候选物的糖对anthraxpa的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使anthraxpa稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

在第一组中,乳果糖、蜜二糖和麦芽糖被鉴定为良好的热稳定剂,并将用于进一步的评估。已在相对低的浓度(250mm)下观察到所需的5℃额外热稳定性。在接近30℃时,蜜二糖显然最有效地将anthraxpa的tm迁移至更高的温度。与海藻糖相比,该组中测试的所有糖都是更有效的热稳定剂。

图20显示了使用渗透压剂热稳定化anthraxpa的结果

图20:作为赋形剂候选物的渗透压剂对anthraxpa的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使anthraxpa稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

在此第二组中,有几种已知的蛋白质稳定剂,例如,诸如牛磺酸,其不能稳定本文所用的疫苗蛋白。在渗透压剂中,发现tmao、甜菜碱、4-羟基脯氨酸、hydroxylectoine和乳糖酸是根据本发明定义的良好的热稳定剂,并因此被选择用于进一步测试。但是,作为热稳定剂只有tmao优于海藻糖。

图21显示了使用盐和离子液体热稳定化anthraxpa的结果。

图21:赋形剂候选物对anthraxpa的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使anthraxpa稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。为了对水合深度低共熔液体使用与其他赋形剂相同类型的图,基于所用材料的重量和所制备液体的体积来估算氯化胆碱的摩尔浓度。

在此第三组分子中,发现根据上文的定义,磷酸二氢钾、磷酸二氢胆碱、乳酸胆碱和氯化胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物在某些条件下可以被分类为良好的热稳定剂。

使用破伤风类毒素筛选热稳定性赋形剂

破伤风类毒素(td)是破伤风梭状芽胞杆菌(clostridiumtetanii)毒素的失活形式,并通过毒素单体的甲醛交联制备。甲醛交联的使用产生的是大蛋白复合物,它不再是毒性的,但仍呈现出被免疫系统识别的抗原结构。它的天然制剂是ph为7.0的100mm组氨酸和100mmnacl。天然平均解折叠温度为67℃。为了使td稳定化,使用了三个类别的赋形剂:糖、离子液体/盐和渗透压剂与获得的海藻糖的结果进行比较,海藻糖是用于各种目的的广泛使用的赋形剂。

图22显示了使用糖热稳定化td的结果。

图22:作为赋形剂候选物的糖对td的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使td稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

在第一组中,乳果糖、蜜二糖和麦芽糖被认为是良好的热稳定剂。最高温度线指示,对于受影响的赋形剂浓度,无法观察到完全解折叠转变,因为设备无法进一步加热样品并且解折叠转变是不完全的。像先前讨论的对anthraxpa的实验一样,与海藻糖相比,乳果糖、蜜二糖和麦芽糖是更有效的热稳定剂。

图23显示了使用渗透压剂热稳定化td的结果。

图23:作为赋形剂候选物的渗透压剂对td的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使td稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。

在此第二组赋形剂中,我们观察到只有hydroxylectoine可以被鉴定为良好的热稳定剂。它也是该组中测试的性能优于海藻糖的唯一物质。

图24显示了使用离子液体热稳定化td的结果。

图24:赋形剂候选物对td的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使td稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。为了对水合深度低共熔液体使用与其他赋形剂相同类型的图,基于所用材料的重量和所制备液体的体积来估算氯化胆碱的摩尔浓度。

在此第三组赋形剂中,观察到磷酸二氢胆碱是该组中最有效的热稳定剂,并且比海藻糖更有效。氯化胆碱分别与山梨糖醇、葡萄糖和蔗糖的水合深度低共熔混合物可被分类为良好的热稳定剂。

使用白喉类毒素crm197筛选热稳定性赋形剂

白喉类毒素(crm197)是白喉杆菌(corynebacteriumdiphteria)毒素的灭活形式。点突变的引入使毒素无害,但仍呈现出被免疫系统识别的抗原结构。它的天然制剂是ph为8.0的20mmhepes和150mmnacl。crm197的三级结构解折叠(其是使用荧光光谱监测的解折叠类型)非常复杂:它以双相转变解折叠,第一个转变代表局部结构变化,而第二个转变代表蛋白质的整体解折叠。由于两种温度均不能特定地与crm197引发免疫的能力相关,因此这两种转变均根据我们的赋形剂的有效性来进行分析。同样,在这里使用了三个类别的赋形剂:糖、离子液体/盐和渗透压剂,并与使用海藻糖的结果进行比较,海藻糖是用于各种目的的广泛使用的赋形剂。

图25显示了使用糖热稳定化crm的结果。

图25:作为赋形剂候选物的糖对crm的平均解折叠温度的作用。红线指示dtm=5℃。将能够局部地(封闭的符号)和整体地(开放的符号)将crm稳定化多于5℃的分子视为赋形剂候选物,并在需要时用不同的疫苗蛋白进行筛选。

在此第一组中,乳果糖、蜜二糖和麦芽糖被鉴定为比海藻糖表现更好的良好热稳定剂。

图26显示了使用渗透压剂热稳定化crm的结果。

图26:作为赋形剂候选物的渗透压剂对crm的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够局部地(封闭的符号)和整体地(开放的符号)使crm稳定化多于5℃的分子视为赋形剂候选物。

在此第二组赋形剂中,观察到只有tmao可被鉴定为良好的热稳定剂。

图27显示了使用离子液体热稳定化crm的结果。

图27:赋形剂候选物对crm的平均解折叠温度的作用。黑线指示dtm=0℃。红线指示dtm=5℃。将能够使crm稳定化多于5℃的分子经受使用不同模型蛋白的第二次筛选。为了对水合深度低共熔液体使用与其他赋形剂相同类型的图,基于所用材料的重量和所制备液体的体积来估算氯化胆碱的摩尔浓度。

在此第三组赋形剂中,观察到磷酸二氢胆碱可以归类为良好的热稳定剂,尽管局部解折叠转变(tm1)没有被非常多地稳定化。除了磷酸二氢胆碱之外,所有其他基于胆碱的离子液体比海藻糖更有效地热稳定化crm。然而,基于氯化胆碱的离子液体对crm的第一次解折叠转变具有显著的去稳定化作用。这可能是由于这些离子液体中存在的大量电荷引起的。

赋形剂对疫苗蛋白的胶体稳定性的作用的评估

在五种分子已被鉴定为在高温下引发蛋白质的稳定性的潜在赋形剂后,对这些分子进行更详细的评估。其中的关键方面是确定所选择的赋形剂是否对蛋白质的胶体稳定性有任何作用。换句话说:需要确定在赋形剂的存在下蛋白质是否显示出改变的聚集趋势。如果阻止聚集,相应的赋形剂将显示出额外的益处。

为了评估蛋白质的聚集行为,使用了动态光散射。测量蛋白质的流体动力学半径,并可将该值用于评估蛋白质是单体形式还是具有聚集状态。将五种所选择的赋形剂添加至包含0.1mg/ml浓度的疫苗蛋白的溶液中。如上一节所述,每种疫苗蛋白均在其天然制剂中配制,并且每种赋形剂均在疫苗蛋白的相应天然制剂中制备。同样,在这组实验中,制备了没有任何缓冲剂组分的磷酸二氢胆碱,但是将赋形剂储备溶液的ph调节为与疫苗蛋白制剂的ph相匹配。

将疫苗蛋白和赋形剂混合在一起,生成具有0.1mg/ml疫苗蛋白含量和所需浓度的赋形剂(详细信息如下)的测试制剂。

为了评估疫苗蛋白在升高的温度下的胶体稳定性,将样品上样到316孔板中,将其置于dynapro读板器iii(wyatttechnology)中。在室温下测定疫苗蛋白的流体动力学半径rh。然后将板加热5分钟至40℃,然后冷却回至室温,此时再次测定rh。以这种方式,以10℃的增量测定40-80℃范围内的不同温度。

图28显示了作为实例的anthraxpa的结果。

图28:在升高的温度下温育5分钟后,anthraxpa的流体力学半径。

对于天然配制的anthraxpa,在室温下观察到较低的流体动力学半径。这种低的rh似乎不受40℃温育5分钟的影响。但是,在随后的在50℃下5分钟后,观察到rh的显著增加,表明在50℃下anthraxpa聚集。该温度称为tagg。由此得出结论,对于天然配制的anthraxpa,聚集温度tagg为50℃。各种赋形剂的添加将tagg升高到高达80℃的温度。

为了分析观察到的tagg的变化是否实际上是聚集的抑制,或者其仅是蛋白质的更高构象稳定性的结果,将tagg相对于tm进行作图,如图29所示。

图29:tagg相对tm。由于使用10℃的增量来探测tagg,因此在tm附近定义了10℃的间隔,其中聚集被认为严格伴随着解折叠(绿色区域)。

如果将tagg升高超出该范围,则认为该赋形剂抑制聚集(黄色区域)。如果将tagg降低至该范围以下,则认为赋形剂促进聚集(红色区域)。

观察到蜜二糖抑制crm(2m及以上)和破伤风类毒素(2.4m)的聚集。由于后者不聚集,因此图29中没有相应的数据点。此外,麦芽糖抑制crm(1.5m及以上)的聚集,这也导致图21中数据点的完全缺乏。

赋形剂对疫苗蛋白的二级结构稳定性的作用的评估

除了探测疫苗蛋白的三级结构外,还对五种赋形剂进行了分析方法以报告它们对疫苗蛋白的二级结构含量的作用。

用所有三种疫苗蛋白分析每种赋形剂的一个浓度。我们使用的蛋白质浓度为0.5mg/ml。此外,有必要使用与先前实验不同的缓冲系统,以不干扰此设置中的光检测。但是,可以证明缓冲液的这种变化不会影响本研究中所用蛋白质的稳定性。

将疫苗蛋白配制在缓冲液中,该缓冲液包含5mm磷酸二氢钠和氯化钠(50-150mm),其维持与各自天然制剂中相同的ph水平。记录280-200nm(在某些情况下为210nm)的光谱,其中数据间距为1nm,狭缝宽度为100μm,响应时间为2s,速度为100nm/s,光程长度为1mm。对每个温度取三个光谱的平均值。

图30显示了测定的转变温度。

图30含有新鉴定的热稳定剂的制剂中anthraxpa、破伤风和白喉类毒素的转变温度

在总结结果之前,需要注意两个观察结果,其对于将数据置于适当的背景中很重要:

首先,对于anthraxpa,观察到两个热诱导的转变。在没有关于每个转变如何影响anthraxpa的能力和影响蛋白质的免疫原性的先前信息的情况下,将较低的转变温度用于分析。在具有乳果糖的制剂中,两个解折叠转变在相当窄的温度范围内发生,并且都不能以所需的精度测定。因此,报告了最高温度,其中没有发生结构变化。总体而言,炭疽的解折叠温度应被视为下限,而不是转变中点。

其次,存在其中即使在非常高的温度下也观察不到二级结构的变化的条件。但是,需要来自dls和荧光测量的信息来正确评估赋形剂的整体稳定性和作用模式。

表5总结了实验结果:

所选择的五种赋形剂对疫苗蛋白稳定性的作用

测定了选自三种不同物质组的赋形剂对疫苗蛋白的构象和胶体稳定性的作用。对于构象稳定性,可以区分对二级和三级结构的作用。

图31总结了每种蛋白质和赋形剂组合的所有结果。

图31:对于anthraxpa、crm197和破伤风类毒素获得的荧光、cd和dls数据的总结。在60℃的黑线代表所需的稳定性目标。利用现有信息,可以解释每种赋形剂对每种蛋白质的作用。

i)tmao:在使用的赋形剂组中,tmao似乎是非常好的热稳定剂中最弱的一种。

ii)磷酸二氢胆碱:这种离子液体是比tmao更强的热稳定剂,并且比tmao更好地使crm稳定化。

i)蜜二糖:本文测试的糖通常显示出最佳的热稳定性。对于测试的所有三种疫苗蛋白,蜜二糖是比海藻糖更有效的热稳定剂。蜜二糖抑制破伤风和crm的聚集。

ii)麦芽糖:其热稳定化作用类似于蜜二糖。麦芽糖使所有疫苗蛋白显著稳定化至60℃以上,但蜜二糖似乎具有更强的稳定化作用。对于测试的所有三种疫苗蛋白,麦芽糖是比海藻糖更有效的热稳定剂。另一方面,麦芽糖的使用浓度要低得多,这使得该赋形剂更易于使用。麦芽糖抑制crm的聚集,并抑制crm和td的二级结构解折叠。

iii)乳果糖:与前面提到的糖类似,乳果糖使所有疫苗蛋白稳定化至60℃以上的温度。然而,与其他糖相反,观察到crm的二级结构解折叠,并且没有阻止聚集。但是乳果糖显示出与麦芽糖相似的热稳定剂功效,并且对于所有三种疫苗蛋白均比海藻糖更有效。两种糖以相似的浓度(1.7m乳果糖和1.8m麦芽糖)使用,而如果使用更高浓度的溶液(2.4m),则蜜二糖是有效的。

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