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您当前的位置： 用于治疗自身免疫性疾病的HMO混合物的制作方法
2021-01-08 13:01:13|
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本发明涉及用于在非婴儿的人中对有症状和无症状的非肠道自身免疫性疾病进行饮食管理的方法、化合物和组合物。
背景技术：
自身免疫性疾病是由对自身组织的异常免疫反应引起的病症。它们是慢性的，会降低生活质量。已知存在80多种自身免疫性疾病，包括克罗恩氏病和乳糜泻等肠道自身免疫性疾病，以及类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格雷夫氏病(grave'sdisease)、桥本氏甲状腺炎(hashimoto'sthyroiditis)、牛皮癣、爱迪生氏病(addison'sdisease)、干燥综合征(
针对自身组织和分子的不适当的免疫反应会导致组织特异性或系统性炎症，从而导致器官损伤和功能障碍。该疾病从最初的初始淋巴细胞活化发展为以被t细胞和抗体靶向的自身抗原的数量增加为特征的慢性状态。活化的自身反应性b细胞可以充当新型肽的抗原呈递细胞，并表达共刺激分子。抗原被处理并呈递给初始t细胞，导致其他自体反应性b细胞被激活，这些b细胞呈现出新的表位，直至发生对大量自体抗原的自体反应。自身抗体的产生通过免疫复合物的形成、细胞溶解或靶标自身细胞的吞噬作用诱导对组织的损害，并干扰正常的组织和细胞功能。尽管自身免疫性疾病的病因尚不清楚，但遗传易感性、环境因素和肠道菌群失调已被确定为可能的因素(opazo等，front.microbiol.9,432(2018))。
据估计，人体肠道有1013到1014个细菌细胞，细菌的数量比人体内的细胞总数多10倍。人体肠道微生物群是一个复杂而动态的微生物生态系统，被认为可以为人体宿主提供许多基本功能，包括防御病原体、诱导免疫调节功能、营养加工和代谢功能。肠道微生物群的组成受多种因素影响，包括饮食、抗生素、微生物与微生物的相互作用以及宿主遗传学。这些因素的变化可能会导致微生物群破坏(菌群失调)。人类微生物群中的菌群失调可能会对肠道屏障产生影响，导致细菌从管腔转移到肠道的免疫区室，从而诱发局部粘膜炎症并增加肠道通透性。如在sad中所见(campbellautoimmunedis.152428(2014))，促炎性淋巴细胞和细胞因子然后可能扩散到体循环并增加远端结构部位(例如，关节、组织、泪腺或唾液腺)发炎的风险。
多项研究已证明肠道微生物群与sad(例如系统性红斑狼疮(sle)、干燥综合征(ss)和1型糖尿病(t1d))相关。例如，与健康受试者相比，患有sle的患者的厚壁菌门对拟杆菌门的比率较低，并且肠杆菌科的物种组成不同(hevia等，mbio.5,e01548-14(2014))。此外，ss患者的有益共生细菌(例如双歧杆菌和普氏粪杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)(产生丁酸盐的细菌))的相对丰度较低。此外，ss患者的肠道菌群失调与系统性疾病活动的临床标志物相关(mandl等，arthritisres.ther.19,237(2017))。在患有t1d的儿童中，观察到相似的微生物群变化，其中有益的肠道细菌(如乳酸杆菌、双歧杆菌和blautiacoccoides/直肠真杆菌群组(产生丁酸盐的细菌群组))减少(murri等，bmcmedicine11,46(2013))。
肠道微生物群的某些成员可以产生诸如短链脂肪酸(scfa)的代谢物，其具有独特的生理作用。糖分解细菌通过发酵不消化的碳水化合物在结肠中产生scfa。它们的产生受食物摄取方式和饮食介导的肠道微生物群变化的影响。主要产品是乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐，它们被结肠吸收。它们有助于塑造肠道环境，影响结肠的生理，并调节肠道免疫反应。丁酸盐是上皮细胞的主要能源，据报道，丁酸盐通过改变粘蛋白基因以及紧密连接蛋白的表达和装配来调节结肠粘膜的物理和功能完整性。另外，据报道丁酸盐和丙酸盐可诱导t调节细胞分化，从而有助于控制肠道炎症。该作用是通过抑制组蛋白去乙酰化而介导的。乙酸盐可以增强由上皮细胞介导的肠防御，从而保护宿主免受攻击(canani等，worldj.gastroenterol.17,1519(2011))。
随着糖分解细菌和产丁酸盐细菌的丰度降低，肠道微生物群的菌群失调，会导致scfa的产生减少，进而可能影响肠道的免疫平衡，促进炎症。在sad中已观察到肠炎。例如，在ss患者中发现粪便钙卫蛋白(一种证明为gi炎症的标志物)水平升高。与调节肠通透性和紧密连接蛋白的解体有关的重要标志物是连蛋白。连蛋白信号传导途径的失调或破坏导致通透性增加。在t1d患者中，高肠通透性与血清中连蛋白水平升高有关。在ms患者中也已经看到了这一点(fasanoclinic.rev.allerg.immunol.42,71(2012))。
sad还无法治愈。目前的治疗方法集中在控制过度活跃的免疫反应和减轻炎症。然而，它们不能防止症状复发。治疗包括非甾体类抗炎药(nsaid)，例如布洛芬(motrin，advil)和萘普生(naprosyn)，以及免疫抑制药物，例如皮质类固醇、钙调神经磷酸酶抑制剂、mtor抑制剂和imdh抑制剂。
近来，针对免疫系统特定方面的生物制剂已成为治疗选择，例如抗tnfα抗体(英夫利昔单抗(infliximab))。所有这些治疗都有副作用，并且长期使用它们是有问题的。这导致寻找更适合于长期使用的治疗。益生菌就是这样一种方法(opazo等，front.microbiol.9,432(2018))。例如，益生菌混合物vsl3已显示出在动物模型中可降低发展为自身免疫性疾病的易感性。然而，其他益生菌在动物模型中未产生积极结果。而且，缺乏在人体中益生菌功效的证据。
完全和长期母乳喂养已被确定为抵抗人1型糖尿病发展的保护因素。这导致了这样的假说，即人乳寡糖(hmo)可能有助于保护婴儿在以后的生活中免受1型糖尿病的发展。hmo是人乳中发现的高浓度的可溶性聚糖的异质混合物。该假设已在年轻的nod小鼠体内得到证实，表明从人乳中提取的hmo混合物可预防小鼠中1型糖尿病的发展(xiao等，sci.rep.8,3829(2018))。如果结果可转化到人的话，则对婴儿和儿童施用hmo可能会提供一种降低以后生活中1型糖尿病风险的方法。
然而，仍然需要安全、耐受性良好的干预措施来治疗或二级预防人的sad。
技术实现要素：
本发明的第一方面涉及人乳寡糖(hmo)在非婴儿的人的有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理中的用途。
本发明的第二方面涉及合成组合物在非婴儿的人的有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理中的用途，该组合物包含至少一种人乳寡糖(hmo)。
优选地，合成组合物包含1g至15g、更优选2g至10g的hmo。例如，合成组合物可以包含3g至7g的hmo。
本发明的第三方面是封装物在非婴儿的人的有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理中的用途，该封装物包含至少14个单独日剂量的有效量的至少一种人乳寡糖(hmo)，有利地是中性hmo。优选地，每个剂量包含约1g至约15g、更优选地约2g至约10g的hmo。例如，合成组合物可以包含约3g至约7.5g的hmo。优选地，该封装物包含至少约21个日剂量，例如约28个日剂量。该封装物中可以包含使用说明。
合成组合物或封装物可以包含双歧杆菌，例如长双歧杆菌(bifidobacteriumlongum)和/或两歧双歧杆菌(bifidobacteriumbifidum)。合成组合物或封装物可包含维生素d的来源。此外，合成组合物或封装物可包含ω-3多不饱和脂肪酸的来源。
本发明的第四方面涉及用于非婴儿的人的有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理的方法，该方法包括向非婴儿的人施用有效量的至少一种人乳寡糖(hmo)。
优选地，向非婴儿的人施用hmo持续至少2周，更优选至少3周。例如，可以将hmo施用4周或更长时间。
优选地，向非婴儿的人施用每天约1g至约15g、更优选每天约2g至约10g的量的hmo。例如，可以每天向非婴儿的人施用约3g至约7.5g。可以在初始阶段向非婴儿的人施用较高剂量，而在第二维持阶段施用较低剂量。例如，可以向非婴儿的人施用每天约3g至约10g(例如每天约4g至约7.5g)的治疗剂量，然后施用每天约2g至约7.5g(例如每天约2g至约5g)的维持或二级预防剂量。
本发明的第五方面是
-一种或多种人乳寡糖(hmo)，
-包含一种或多种人乳寡糖(hmo)的合成组合物，或
-包含至少14个单独日剂量的有效量的一种或多种人乳寡糖的封装物，
在患有系统性自身免疫性疾病(sad)的非婴儿的人的饮食管理中的用途。
在以上公开的所有方面中，hmo可以是中性hmo或酸性hmo。中性hmo可以是一种或多种岩藻糖基化的中性hmo或一种或多种非岩藻糖基化的中性hmo。优选地，hmo选自2'-fl、3-fl、dfl、lnt、lnnt、3'-sl、6'-sl、lnfp-i或其混合物。优选地，hmo包含以下之一：2'-fl以及lnnt和lnt中的至少一种；2'-fl、dfl以及lnnt和lnt中的至少一种；2'-fl和6'-sl；2'-fl、dfl和6'-sl；2′-fl、6′-sl以及lnnt和lnt中的至少一种；和2'-fl、dfl、6'-sl以及lnnt和lnt中的至少一种。
非婴儿sad患者可能患有一种或多种疾病，例如类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格雷夫氏病、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣、银屑病关节炎、强直性脊柱炎、爱迪生氏病、干燥综合征、血管炎、重症肌无力和i型糖尿病。此外，非婴儿的人可能另外患有“意识模糊”/“意识障碍”、疲劳、胃肠道疼痛、便秘、腹泻、皮疹、焦虑和抑郁中的一种或多种。
在一个实施方式中，有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)是干燥综合征。优选地，根据本发明的hmo、以及包含在合成组合物和/或封装物中的hmo包含、基本上由或由以下中的一种或多种组成：2'-fl、dfl和6'-sl，如2'-fl和dfl，2'-fl和6'-sl，或2'-fl、dfl和6'-sl。例如，干燥综合征患者可能患有唾液腺和/或泪腺的炎症。
在另一个实施方式中，有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)是1型糖尿病。优选地，根据本发明的hmo、以及包含在合成组合物和/或封装物中的hmo包含、基本上由或由以下中的一种或多种组成：2'-fl、dfl和6'-sl，如2'-fl和dfl，2'-fl和6'-sl，或2'-fl、dfl和6'-sl。例如，1型糖尿病患者可能患有胰腺的胰岛炎。
此外，非婴儿sad患者还可能患有菌群失调、肠屏障功能受损和胃肠道炎症中的一种或多种。
附图说明
图1表示在结肠反应器近端(pc)和远端(dc)中与2'-fl处理相关的乙酸(aa)、丙酸(pa)、丁酸(ba)和总scfa(总计)的绝对值。在两个对照周、三个处理周和两个冲洗周中取样。在每周中，收集三个样品(a，b和c，分别对应于给定周中的第1天、第3天和第5天)进行代谢分析。
具体实施方式
现已令人惊讶地发现，向患有系统性自身免疫性疾病的人口服或肠内施用一种或多种人乳寡糖(hmo)可以减轻病症的症状或延缓复发。因此，人乳寡糖可以用作人的系统性自身免疫性疾病的治疗、饮食管理或二级预防。hmo还通过增加胃肠道中双歧杆菌(特别是青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌、长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌)的丰度，优先恢复菌群失调的肠道微生物群。这些细菌产生乳酸和乙酸盐，而乳酸和乙酸盐又可以被产丁酸盐的细菌转化为丁酸盐。另外，将人乳寡糖施用于非婴儿的人优选产生有益的肠道微生物群。结果，胃肠道通透性以及肠道和系统性炎症都减少。
有益代谢物如短链脂肪酸(scfa)的诱导可导致一种或多种指标或症状的可检测性改善，指标或症状例如为“意识模糊”/“意识障碍”、疲劳、胃肠道疼痛、关节痛、口腔和眼部干燥、焦虑、抑郁和/或皮疹。
人乳寡糖(hmo)是人乳中发现的可溶性聚糖的异质混合物。它们是人乳中仅次于乳糖和脂质的第三最丰富的固体成分，并且以5-25g/l的浓度存在(bodel等，2013；pp.515-32，瓦赫宁根学术出版社(wageningenacademicpublishers)(2013))。hmo耐受小肠中的酶水解，因此在很大程度上未被消化和吸收，并完好无损地到达结肠。到达结肠的大多数hmo作为底物，通过选择性刺激特定细菌的生长来塑造肠道生态系统。据信，hmo实质上可调节婴儿肠道微生物群，并在配方奶喂养和母乳喂养的婴儿的微生物群差异中起决定性作用。这些差异包括，与配方奶喂养婴儿中更加多样化的肠道微生物群相比，母乳喂养婴儿的肠道中双歧杆菌占优势。这被认为会对婴儿有益，因为据信双歧杆菌物种的菌株对肠道健康具有积极作用。
在本文中，以下术语具有以下含义：
“非婴儿的人”或“非婴儿”意指3岁及年龄更大的人。非婴儿的人可以是儿童、青少年、成人或老人(65岁以上)。
“人乳寡糖”或“hmo”意指在人母乳中发现的复杂碳水化合物(urashima等：《乳寡糖(milkoligosaccharides)》，nova科学出版社(novasciencepublisher(2011))；chenadv.carbohydr.chem.biochem.72，113(2015))。hmo具有在还原端包含乳糖单元的核心结构，该还原端可以被一个或更多个β-n-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或更多个β-乳-n-二糖基(β-lacto-n-biosyl)单元延长，并且该核心结构可以被αl-吡喃岩藻糖基和/或α-n-乙酰基-神经氨酸基(唾液酸基)部分取代。就这一点而言，非酸性(或中性)hmo没有唾液酸残基，而酸性hmo在其结构中具有至少一个唾液酸残基。非酸性(或中性)hmo可以是岩藻糖基化的或非岩藻糖基化的。这类中性非岩藻糖基化hmo的实例包括乳-n-四糖(lnt)、乳-n-新四糖(lnnt)、乳-n-新六糖(lnnh)、对乳-n-新六糖(plnnh)、对-乳-n-六糖(plnh)和乳-n-六糖(lnh)。中性岩藻糖基化hmo的实例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-fl)、乳-n-岩藻五糖i(lnfp-i)、乳-n-二岩藻六糖i(lndfh-i)、3-岩藻糖基乳糖(3-fl)、二岩藻糖基乳糖(dfl)、乳-n-岩藻五糖ii(lnfp-ii)、乳-n-岩藻五糖iii(lnfp-iii)、乳-n-二岩藻六糖iii(lndfh-iii)、岩藻糖基-乳-n-六糖ii(flnh-ii)、乳-n-岩藻五糖v(lnfp-v)、乳-n-二岩藻六糖ii(lndfh-ii)、岩藻糖基-乳-n-六糖i(flnh-i)、岩藻糖基-对-乳-n-六糖i(fplnh-i)、岩藻糖基-对-乳-n-新六糖ii(f-plnnhii)和岩藻糖基-乳-n-新六糖(flnnh)。酸性hmo的实例包括3’-唾液乳糖(3’-sl)、6’-唾液乳糖(6’-sl)、3-岩藻糖基-3’-唾液乳糖(fsl)、lsta、岩藻糖基-lsta(flsta)、lstb、岩藻糖基-lstb(flstb)、lstc、岩藻糖基-lstc(flstc)、唾液酸基-lnh(slnh)、唾液酸基-乳-n-六糖(slnh)、唾液酸基-乳-n-新六糖i(slnh-i)、唾液酸基-乳-n-新六糖ii(slnh-ii)和二唾液酸基-乳-n-四糖(dslnt)。
“合成组合物”意指人工制备的组合物，并且优选地意指含有至少一种以化学和/或生物学方式(例如通过化学反应、酶促反应或重组)离体产生的化合物的组合物。在一些实施方式中，合成组合物可以但不优选与天然存在的组合物相同。合成组合物通常包含一种或多种hmo，当持续施用约14天时，它们能够优先增加胃肠道微生物群中双歧杆菌(例如长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌)的丰度，并增加胃肠道中丁酸盐的产生。在一些实施方式中，合成组合物可包含除hmo外的可在体内对非婴儿的人受试者微生物群的双歧杆菌或炎性基调有影响的一种或多种化合物或组分(例如不可消化的寡糖或益生元，维生素d和/或ω-3多不饱和脂肪酸)。同样，在一些实施方式中，合成组合物可包含一种或多种营养或药学活性组分，其不会不利地影响上述化合物的功效。下面还描述了本发明的合成组合物的一些非限制性实施方式。
“微生物群”、“微生物区系”和“微生物组”是指通常栖息于身体器官或部分、特别是非婴儿的人的胃肠器官的活微生物群体。胃肠微生物群的最主要成员包括厚壁菌门(firmicutes)、拟杆菌门(bacteroidetes)、放线菌门(actinobacteria)、变形菌门(proteobacteria)、互养菌门(synergistetes)、疣微菌门(verrucomicrobia)、梭杆菌门(fusobacteria)和广古菌门(euryarchaeota)这些门的微生物。在属水平的微生物包括拟杆菌属(bacteroides)、栖粪杆菌属(faecalibacterium)、双歧杆菌属(bifidobacterium)、罗斯氏菌属(roseburia)、alistipes、柯林斯氏菌(collinsella)、布劳特氏菌属(blautia)、粪球菌属(coprococcus)、瘤胃球菌属(ruminococcus)、真杆菌属(eubacterium)和多尔氏菌属(dorea)；在物种水平的微生物包括单形拟杆菌(bacteroidesuniformis)、alistipesputredinis、parabacteroidesmerdae、布氏瘤胃球菌(ruminococcusbromii)、dorealongicatena、粪拟杆菌(bacteroidescaccae)、多形拟杆菌(bacteroidesthetaiotaomicron)、霍氏真杆菌(eubacteriumhallii)、扭链瘤胃球菌(ruminococcustorques)、粪普拉梭杆菌(faecalibacteriumprausnitzii)、酸奶瘤胃球菌(ruminococcuslactaris)、产气柯林斯菌(collinsellaaerofaciens)、doreaformicigenerans、普通拟杆菌(bacteroidesvulgatus)和罗斯拜瑞氏菌(roseburiaintestinalis)。胃肠微生物群包括位于或附着于覆盖胃肠道上皮的粘液层的粘膜相关微生物群，以及胃肠道腔中发现的腔相关微生物群。
“肠内施用”意指用于将组合物递送至非婴儿的任何常规形式，其引起组合物在胃肠道(包括胃)中的沉积。肠内施用的方法包括通过鼻胃管或空肠管、经口、舌下和直肠进给。
“口服施用”意指用于通过口将组合物递送至非婴儿的任何常规形式。因此，口服施用是肠内施用的一种形式。
“有效量”是指提供足够量的hmo以在非婴儿的人中产生期望治疗结果的组合物的量。可以一剂或多剂施用有效量以达到期望的治疗结果。
“长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的相对丰度”是指在非婴儿的人的胃肠道微生物群中长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的丰度。
“长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的相对生长”是指在非婴儿的人的胃肠道中微生物群中的长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的生长。
“青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌”是指选自以下的细菌：青春双歧杆菌(bifidobacteriumadolescentis)、角形双歧杆菌(bifidobacteriumangulatum)、链状双歧杆菌(bifidobacteriumcatenulatum)、假链状双歧杆菌(bifidobacteriumpseudocatenulatum)、bifidobacteriumkashiwanohense、齿双歧杆菌(bifidobacteriumdentum)、bifidobacteriumstercoris(duranti等appl.environ.microbiol.79,336(2013)，bottacini等microbialcellfact.13:s4(2014))。优选地，青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌是青春双歧杆菌和/或假链状双歧杆菌。
“青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌的相对丰度”是指非婴儿的胃肠道微生物群中青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的丰度。
“青春双歧杆菌和/或假链状双歧杆菌的相对丰度”是指非婴儿的胃肠道微生物群中青春双歧杆菌和/或假链状双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的丰度。
“青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌的相对生长”是指非婴儿的胃肠道微生物群中的青春双歧杆菌系统发育组的双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的生长。
“青春双歧杆菌和/或假链状双歧杆菌的相对生长”是指非婴儿的胃肠道中微生物群中的青春双歧杆菌和/或假链状双歧杆菌相对于其他双歧杆菌的生长。
“治疗”意指解决医学病况或疾病，目的是改善或稳定被治疗的人的结果。治疗包括通过解决被治疗者的营养需求而进行的医疗状况或疾病的饮食或营养管理。“治疗(treating)”和“治疗(treatment)”具有语法上对应的含义。
“二级预防”是指防止无症状疾病发展为有症状的疾病或防止有症状的疾病恶化或复发。与试图预防疾病或病况发生的一级预防相反，二级预防旨在防止疾病或病况恶化或再次发生。如果个人/患者是疾病的携带者但没有症状，则认为该疾病是无症状的。如果病况未显示通常与之相关的明显症状，则可能是无症状的。
优选地，本发明涉及非婴儿的人中有症状或无症状的sad的饮食管理和/或饮食二级预防。
术语“饮食管理”意指由于疾病、病症或医疗状况而患有以下项的患者的全部或部分进餐：
——摄取、消化、吸收、代谢或排泄普通食物或其中所含的某些营养素或代谢物的能力受限、受损或受干扰，或者
——具有其他医学确定的营养素要求(参阅：欧盟委员会关于特殊医疗用途食品分类的委员会公告，欧盟官方公报c401,25.11.2017，第10-11页)。
根据本发明，已经发现当将hmo施用于患有系统性自身免疫性疾病的非婴儿的人时，使疾病/病症的症状减轻和/或使复发的再发生延迟。因此，人乳寡糖可以用作人系统性自身免疫性疾病的治疗、饮食管理或二级预防。因此，hmo可用于非婴儿的人中sad的治疗或二级预防。因此，hmo可用于诸如类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、格雷夫氏病、桥本氏甲状腺炎、牛皮癣、爱迪生氏病、干燥综合征、血管炎、重症肌无力和i型糖尿病的病症的治疗和/或二级预防。
因此，本发明的第一方面涉及hmo在非婴儿的人的有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理中的用途。
hmo可以是一种或多种岩藻糖基化的中性hmo，一种或多种非岩藻糖基化的中性hmo，和/或一种或多种唾液酸化hmo。在一个实施方式中，hmo是中性hmo的混合物，优选是包含岩藻糖基化和非岩藻糖基化的中性hmo、基本上由其组成、或由其组成的混合物。具体地，一种或多种岩藻糖基化的中性hmo选自：2’-fl、3-fl、dfl、lnfp-i、lnfp-ii、lnfp-iii、lnfp-v、lndfh-i、lndfh-ii、lndfh-iii、flnh-i、flnh-ii、flnnh、fplnh-i和f-plnnhii，优选2’-fl、3-fl和dfl。优选地，一种或多种非岩藻糖基化的中性hmo选自lnt、lnnt、lnh、lnnh、plnh和plnnh，优选lnnt和lnt。一种或多种唾液酸化hmo优选选自3'-sl、6'-sl、lsta、lstb、lstc、ds-lnt、s-lnh和s-lnnhi，更优选3’-sl和6’-sl。也可以使用含有岩藻糖基化和唾液酸化部分的hmo，例如fsl。在一些优选的实施方式中，混合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：i)2'-fl和/或dfl和ii)lnnt和/或lnt(意思是该混合物包含2'-fl和dfl中的至少一种以及lnnt和lnt中的至少一种、基本上由其组成或由其组成，例如，混合物包含2'-fl和lnnt、基本上由其组成或由其组成)。该混合物也可以包含2'-fl和dfl、基本上由其组成或由其组成。在某些实施方式中，混合物中的i)2'-fl和/或dfl与ii)lnnt和/或lnt之间的质量比在5:1至1:1的范围内，例如在包含2'-fl和lnnt、基本上由其组成或由其组成的混合物中2'-fl和lnnt的比率为2:1或4:1。在其他优选的实施方式中，混合物包含以下、基本上由以下组成或由以下组成：i)2'-fl和/或dfl和ii)3'-sl和/或6'-sl。这些实施方式还可包含iii)lnnt和/或lnt。
可以通过熟知的方法从哺乳动物(包括但不限于人、牛、绵羊、猪或山羊物种)分泌的一种或多种乳中分离或富集hmo。还可以通过使用微生物发酵、酶促方法、化学合成或这些技术的组合的熟知方法来生产hmo。作为实例，使用化学法，可以如wo2011/100980和wo2013/044928中所述那样制造lnnt，可以如wo2012/155916和wo2013/044928中所述那样合成lnt，可以如wo2013/091660所述那样制造lnt和lnnt的混合物，可以如wo2010/115934和wo2010/115935中所述那样制造2’-fl，可以如wo2013/139344中所述那样制造3-fl，可以如wo2010/100979中所述那样制造6’-sl及其盐，可以如wo2012/113404中所述那样制备唾液酸化寡糖，并且可以如wo2012/113405中所述那样制备人乳寡糖的混合物。作为酶促生产的实例，可以如wo2012/007588中所述那样制造唾液酸化寡糖，如wo2012/127410中所述那样制造岩藻糖基化寡糖，并且可以如wo2012/156897和wo2012/156898中所述那样有利地制备人乳寡糖的多种混合物。此外，wo01/04341和wo2007/101862描述了如何使用基因修饰的大肠杆菌制备核心人乳寡糖(可选地由岩藻糖或唾液酸取代)。
本发明的第二方面是包含hmo、有利地是中性hmo的合成组合物在非婴儿的人的有症状和无症状sad的二级预防、治疗或饮食管理中的用途。合成组合物中包含的hmo如第一方面所公开。
合成组合物可以是药物组合物。药物组合物可以含有药学上可接受的载体，例如，磷酸盐缓冲盐溶液、乙醇在水中的混合物、水和乳液(如油/水或水/油乳液)、以及各种润湿剂或赋形剂。药物组合物还可以含有其他物质，当向非婴儿施用时，该物质不会产生不利、过敏或其他不想要的反应。载体和其他物质可包括溶剂、分散剂、包衣剂、吸收促进剂、控释剂和一种或多种惰性赋形剂，如淀粉、多元醇、制粒剂、微晶纤维素、稀释剂、润滑剂、粘合剂和崩解剂。如果需要，可以通过标准的水性或非水性技术将片剂剂量的组合物包衣。
药物组合物可以经口施用，例如作为含有预定量的片剂、胶囊剂或丸剂，或作为含有预定浓度的粉剂或颗粒剂，或含有预定浓度的在水性或非水性溶液中的凝胶剂、糊剂、溶液剂、悬浮剂、乳液剂、糖浆、大丸剂、药糖剂或浆剂。经口施用的组合物可以包含粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、调味剂和湿润剂。经口施用的组合物如片剂可以任选地被包衣并且可以被配制为提供其中混合物的持续、延迟或受控释放。
药物组合物也可以通过直肠栓剂、气雾剂管、鼻胃管或直接输注到胃肠道中来施用。
药物组合物还可包含治疗剂，如抗病毒剂、抗生素、益生菌、止痛药和抗炎剂。用于非婴儿的人的这些组合物的合适剂量可以基于诸如免疫状态、体重和年龄的因素以常规方式确定。在某些情况下，剂量的浓度应与人母乳中发现的hmo的浓度相似。所需量通常范围为每天约1g至约20g，在某些实施方式中为每天约2g至约15g，例如每天约3g至约7.5g。适当的剂量方案可以通过常规方法确定。
合成组合物也可以是营养组合物。其可以含有蛋白质、脂质和/或可消化的碳水化合物的来源，并且可以呈粉末或液体形式。可以将组合物设计为唯一营养来源或作为营养补充剂。
合适的蛋白质来源包括乳蛋白、大豆蛋白、大米蛋白、豌豆蛋白和燕麦蛋白、或其混合物。乳蛋白可以成乳蛋白浓缩物、乳蛋白分离物、乳清蛋白或酪蛋白或两者的混合物的形式。蛋白质可以是完整蛋白质或水解蛋白质、部分水解或全部水解。水解蛋白提供易于消化的优势，这对患有发炎的gi肠道的非婴儿至关重要。蛋白质也可以游离氨基酸的形式提供。蛋白质可占营养组合物能量的约5％至约30％，通常约10％至20％。
蛋白质来源可以是以下的来源：谷氨酰胺、苏氨酸、半胱氨酸、丝氨酸、脯氨酸或这些氨基酸的组合。谷氨酰胺来源可以是谷氨酰胺二肽和/或富含谷氨酰胺的蛋白质。由于肠细胞将谷氨酰胺用作能量源，因此可以包含谷氨酰胺。苏氨酸、丝氨酸和脯氨酸是生产粘蛋白的重要氨基酸。粘蛋白覆盖胃肠道且可以改善肠屏障功能和粘膜愈合。半胱氨酸是谷胱甘肽的主要前体，它是机体抗氧化防御的关键。
合适的可消化碳水化合物包括麦芽糖糊精、水解或改性的淀粉或玉米淀粉、葡萄糖聚合物、玉米糖浆、玉米糖浆固体、高果糖玉米糖浆、大米衍生的碳水化合物、豌豆衍生的碳水化合物、马铃薯衍生的碳水化合物、木薯淀粉、蔗糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、蜂蜜、糖醇(例如麦芽糖醇、赤藓糖醇、山梨糖醇)或其混合物。优选地，组合物不含乳糖。通常，可消化的碳水化合物提供营养组合物能量的约35％至约55％。优选地该营养组合物不含乳糖。特别合适的可消化碳水化合物是低葡萄糖当量(de)麦芽糖糊精。
合适的脂质包括中链甘油三酸酯(mct)和长链甘油三酸酯(lct)。优选地，脂质是mct和lct的混合物。例如，mct可以占脂质重量的约30％至约70％，更具体地占重量的约50％至约60％。mct具有易于消化的优势，这对胃肠道发炎或受损的非婴儿至关重要。通常，脂质提供营养组合物能量的约35％至约50％。脂质可以含有必需脂肪酸(ω-3和ω-6脂肪酸)。优选地，这些多不饱和脂肪酸提供的脂质源总能量的不到约30％。特别优选的是该组合物包含ω-3多不饱和脂肪酸的来源；例如鱼油、二十二碳六烯酸、α-亚麻酸和/或二十碳五烯酸。该多不饱和脂肪酸也可以是饮食性二高γ-亚麻酸(dgla)。
长链甘油三酸酯的合适来源是菜籽油、葵花籽油、棕榈油、大豆油、乳脂、玉米油、高油性油和大豆卵磷脂。分馏椰子油是中链甘油三酸酯的合适来源。营养组合物的脂质分布优选设计为多不饱和脂肪酸ω-6(n-6)与ω-3(n-3)之比在约4:1至约10:1的范围内。例如，n-6与n-3脂肪酸比例可以为约6:1至约9:1。
营养组合物还优选包含维生素和矿物质。如果营养组合物旨在作为唯一的营养来源，则其优选包含完整的维生素和矿物质分布。维生素的实例包括维生素a、b-复合物(如b1、b2、b6和b12)、c、d、e和k、烟酸和酸性维生素，如泛酸、叶酸和生物素。矿物质的实例包括钙、铁、锌、镁、碘、铜、磷、锰、钾、铬、钼、硒、镍、锡、硅、钒和硼。维生素d的来源是特别优选的。
营养组合物还可包含类胡萝卜素，例如叶黄素、番茄红素、玉米黄质和β-胡萝卜素。所包含的类胡萝卜素的总量可在约0.001μg/ml至约10μg/ml的范围内变化。叶黄素可以以约0.001μg/ml至约10μg/ml的量被包含在内，优选地约0.044μg/ml至约5g/ml的叶黄素。番茄红素可以以约0.001μg/ml至约10μg/ml的量被包含在内，优选约0.0185mg/ml至约5g/ml的番茄红素。β-胡萝卜素可包含约0.001μg/ml至约10mg/ml，例如约0.034μg/ml至约5μg/ml的β-胡萝卜素。
营养组合物优选还含有低浓度的钠；例如，约300mg/l至约400mg/l。剩余电解质的浓度可以在不给肾脏功能带来不必要肾溶质负担情况下满足需要。例如，钾优选以约1180mg/l至约1300mg/l的范围存在；并且氯化物优选以约680mg/l至约800mg/l的范围存在。
营养组合物还可含有各种其他常规成分，如防腐剂、乳化剂、增稠剂、缓冲剂、纤维和益生元(例如低聚果糖、低聚半乳糖)、益生菌(例如动物双歧杆菌乳亚种bb-12、乳双歧杆菌hn019、乳双歧杆菌bi07、婴儿双歧杆菌atcc15697、鼠李糖乳杆菌gg、鼠李糖乳杆菌hnooi、嗜酸乳杆菌la-5、嗜酸乳杆菌ncfm、发酵乳杆菌cect5716、长双歧杆菌bb536、长双歧杆菌ah1205、长双歧杆菌ah1206、短双歧杆菌m-16v、罗伊氏乳杆菌atcc55730，罗伊氏乳杆菌atccpta-6485、罗伊氏乳杆菌dsm17938)、抗氧化剂/抗炎化合物(包括生育酚、类胡萝卜素、抗坏血酸/维生素c、抗坏血酸棕榈酸酯、多酚、谷胱甘肽和超氧化物歧化酶(甜瓜))、其他生物活性因子(例如，生长激素、细胞因子、tfg-β)、着色剂、调味剂和稳定剂、润滑剂等。
营养组合物可以是可溶粉末、液体浓缩物或即用型制剂的形式。组合物可以通过鼻胃管或经口喂给非婴儿。也可以存在各种调味剂、纤维和其他添加剂。
营养组合物可以通过用于制备固体或液体形式的营养组合物的任何常用制造技术来制备。例如，可以通过合并各种进料溶液来制备组合物。可以通过加热和混合脂质源，然后在加热和搅拌时添加乳化剂(例如卵磷脂)、脂溶性维生素和至少一部分蛋白质源来制备脂肪蛋白进料溶液。然后通过在加热和搅拌时向水中添加矿物质、痕量和超痕量矿物质、增稠剂或悬浮剂来制备碳水化合物进料溶液。在添加碳水化合物(例如，hmo和可消化的碳水化合物源)之前，将所得溶液在持续加热和搅拌下保持10分钟。然后将所得进料溶液在加热和搅拌时共混在一起，并将ph调节至6.6-7.0，然后将组合物经受高温短时处理，在此期间将组合物进行热处理、乳化和均质化，然后使其冷却。添加水溶性维生素和抗坏血酸，如果需要，将ph调节至所需范围，添加调味剂，并添加水以达到所需的总固体含量。
对于液体产品，然后可以将所得溶液无菌包装以形成无菌包装的营养组合物。以这种形式，营养组合物可以是即食或浓缩液体形式。另选地，可将组合物喷雾干燥并加工并包装为可重构粉末。
当营养产品是即食营养液体时，以液体的重量计，液体中hmo的总浓度优选为约0.0001％至约2.0％，包括约0.001％至约1.5％，包括约0.01％至约1.0％。当营养产品是浓缩营养液时，以液体的重量计，液体中hmo的总浓度优选为约0.0002％至约4.0％，包括约0.002％至约3.0％，包括约0.02％至约2.0％。
合成组合物，优选营养组合物还可以为单位剂型，例如胶囊剂、片剂、或小袋/条状封装物。例如，合成组合物，优选营养组合物可以是片剂形式或粉末形式，其包含hmo和一种或多种辅助配制和施用的另外的组分，例如稀释剂、赋形剂、抗氧化剂、润滑剂、着色剂、粘合剂、崩解剂，等等。
合适的稀释剂、赋形剂、润滑剂、着色剂、粘合剂和崩解剂包括聚乙烯、聚氯乙烯、乙基纤维素、丙烯酸聚合物及其共聚物、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素(hpmc)、羧甲基纤维素钠、聚甲基丙烯酸羟乙酯(phema)、聚乙烯醇(pva)、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)、聚环氧乙烷(peo)或聚丙烯酰胺(pa)、角叉菜胶、藻酸钠、聚卡波非、聚丙烯酸、黄芪胶、甲基纤维素、果胶、天然胶、黄原胶、瓜尔胶、卡拉亚胶、羟丙甲纤维素、硬脂酸镁、微晶纤维素和胶体二氧化硅。合适的抗氧化剂是维生素a、类胡萝卜素、维生素c、维生素e、硒、类黄酮、多酚、番茄红素、叶黄素、木脂素、辅酶q10(“coq10”)和谷胱甘肽。
单位剂型，特别是小袋或条状封装物形式的单位剂型，还可以包含各种营养素，包括常量营养素。如上所述，特别优选的营养素是维生素d、ω-3多不饱和脂肪酸和益生菌的来源。
hmo或合成组合物的适当剂量可以基于诸如免疫状态、体重和年龄的因素以常规方式确定。在某些情况下，该剂量的浓度应与人母乳中hmo的浓度相似。所需量通常为每天约1g至约20g，在某些实施方式中为每天约1g至约15g，例如为每天约2g至约10g，在某些实施方式中为每天约3g至约7.5g。适当的剂量方案可以通过常规方法确定。理想地，每天约2g至约10g的剂量以确切的量施用，所述量取决于是否正在治疗症状(通常是较高剂量)或旨在进行二级预防(较低剂量)。
hmo或合成组合物可以以封装物的形式存在，该封装物包含至少14个单独日剂量的有效量的人乳寡糖。日剂量优选为小袋/条状封装物形式，但可以为任何合适的形式。每个剂量优选包含约1g至约20g、更优选约2g至约15g、例如约2g至约10g的人乳寡糖。优选地，封装物包含至少21个日剂量、更优选至少28个日剂量。最合适的封装物可容纳足够4周或整一个月。封装物中可以包含使用说明。
可以基于几个因素来确定适当的剂量，这些因素包括例如体重和/或病症、症状的严重程度、副作用的发生率和/或严重程度以及给药方式。可以通过本领域技术人员已知的方法确定适当的剂量范围。在初始治疗阶段，剂量可以较高(例如每天3g至15g，优选每天4g至10g，更优选每天4g至7.5g)。在维持阶段，剂量可以较少(例如每天1g至10g，优选每天2mg至5g，更优选每天2g至5g)。
治疗的持续时间可以基于几个因素来确定，包括例如体重和/或病症、症状的严重程度、副作用的发生率和/或严重程度。优选地，持续时间为至少14天，更优选地至少3周。甚至更优选超过4周。合成的组合物或hmo也可以长期服用。
hmo、合成组合物和封装物可用于非婴儿的人中有症状和无症状的系统性自身免疫性疾病(sad)的二级预防、治疗或饮食管理的方法中。hmo、合成组合物和封装物在上文公开。
本发明的某个方面是
-一种或多种人乳寡糖(hmo)，
-包含一种或多种人乳寡糖(hmo)的合成组合物，或
-包含至少14个单独日剂量的有效量的一种或多种人乳寡糖的封装物，
在患有系统性自身免疫性疾病(sad)的非婴儿的人的饮食管理中的用途。hmo、合成组合物和封装物在上文公开。
实施例
本文描述的工作实施例仅用于说明目的，不应视为限制性的。
实施例1
总共招募100位男性和女性健康成年人参与研究。在筛查访视和1-2周磨合期后，选择参与者并随机分为十组，每组十名受试者。1组施用含2克葡萄糖的安慰剂产品。其余9组施用含以下项的治疗产品：a)20g2'-fl，b)10g2'-fl，c)5g2'-fl，d)20glnnt，e)10glnnt，f)5glnnt，g)20g按重量计2:1的2'-fl和lnnt的混合物，h)10g按重量计2:1的2'-fl和lnnt的混合物，和i)5g按重量计2:1的2'-fl和lnnt的混合物，持续4周。安慰剂和治疗产品在单位剂量容器中为粉末形式。
健康的成年人如果年龄在18至60岁之间，则有资格参与。所有招募的参与者都能够并且愿意理解并遵守研究程序。如果出现以下情况，则排除参与者：在筛查访视之前一个月参加了临床研究；他们在筛查测试中发现异常结果，这些结果与研究参与是临床相关的；他们患有严重疾病，例如恶性肿瘤、糖尿病、严重冠状动脉疾病、肾脏疾病、神经系统疾病或严重精神病或任何可能混淆研究结果的疾病；在研究前三个月使用高剂量益生菌补充剂(允许酸奶)；他们在研究前六个月服用了抗生素药物；他们在研究前2周定期食用可能干扰症状评估的任何药物；以及正在怀孕或哺乳。
在筛查访视中，记录病史和伴随用药，并收集用于安全性分析的血液样品。分发粪便样品工具包。指示参与者将其样品保存在冰箱中，直到下次访视为止。
在第二次访视时，检查资格标准并将合格的受试者随机分配到试验的10个组中(治疗组和安慰剂组)。收集粪便样品并分发用于新样品的工具。参与者熟悉每天记录数据的交互式互联网支持系统，并被提供治疗或对照产品。提醒受试者在研究期间不要改变其日常饮食。收集血液样品用于生物标志物研究。粪便样品在-80℃下保存直至分析。
该研究进行4周，参与者每天都服用安慰剂或治疗产品。指示参与者在早上食用早餐时食用产品。通过交互式互联网支持系统监视依从性。
参与者还使用该系统记录：
·bristol粪便性状量表(bristolstoolformscale，bsfs)信息。
·症状信息，例如腹痛、腹部不适、腹部绞痛、腹胀和腹部饱胀感。
·其他胃肠道症状评定量表(gsrs)信息。
该问卷包括15个项目，涵盖五个方面(腹痛、消化不良、反流、腹泻、便秘)，并使用七级李克特量表(likertscale)。
2周后，每个参与者都由医疗团队访视。收集粪便样品和血液样品。粪便样品在-80℃下保存直至分析。分发用于新样品的工具。提醒受试者在研究期间不要改变其日常饮食。
4周后，每个参与者都由医疗团队访视。收集粪便样品和血液样品。粪便样品在-80℃下保存直至分析。
在电化学发光平台上以多重格式同时分析血液样品。面板中包括以下分析物：bun、ldl胆固醇、hdl胆固醇、铁、甘油三酯、apoa1、apob、胰岛素、ffa、胰高血糖素、il-10、il-6和tnf-α。
为了评估微生物群谱，使用96孔powersoildna分离试剂盒(mo-bio)从粪便样品中提取dna。每个板中最少要保留一个空的样品孔，以在pcr期间用作阴性对照。使用正向引物s-d-bact-0341-b-s-17和反向引物s-d-bact-0785-a-a-21并连接有illumina接头进行pcr(klindworth等，nucleicacidsres.41,el(2013))。这些是针对v3-v4区的通用细菌16srdna引物。使用以下pcr程序：98℃30秒，25×(98℃10s，55℃20s，72℃20s)，72℃5min。通过将产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证扩增。使用nexteraindexkitv2(illumina)通过以下pcr程序在巢式pcr中添加条形码：98℃30sec，8×(98℃10s，55℃20s，72℃20s)，72℃5min。通过将产物在1％琼脂糖凝胶上电泳来验证引物的附着。使用sequalprep标准化板试剂盒对来自巢式pcr的产物进行标准化并合并。通过蒸发浓缩所合并的文库，并使用qubit高灵敏度测定试剂盒(thermofisherscientific)在qubit荧光计上测量合并的文库的dna浓度。使用用于2×300bp配对末端测序的miseq试剂盒v3(illumina)在miseq桌面测序仪上进行测序。使用usearch(edgar，naturemethods10,996(2013))的64位版本用于序列数据的生物信息学分析。
为了评估双歧杆菌群落，对dna样品进行its分析。
来自双歧杆菌群落分析的结果表明，在最初的2周中，当摄入单一hmo时，青春双歧杆菌的丰度增加，而当同时摄入两种hmo时，假链状双歧杆菌的丰度增加。青春双歧杆菌和假链状双歧杆菌都属于青春双歧杆菌系统发育组的成员。在第4周，青春双歧杆菌系统发育组成员的丰度降低，而长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的丰度增加。可以看出，口服摄入hmo超过14天明显增加了健康成人的微生物群中的长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的丰度，以及它们与其他双歧杆菌物种总数相比的相对丰度。scfa分析表明，食用hmo的成人中乙酸盐和丙酸盐最初有所增加，接着约14天后丁酸盐增加。
实施例2
在糖尿病和干燥综合征的非肥胖糖尿病(nod)小鼠模型中研究hmo的抗炎作用。
将小鼠分为四组(n＝8)，对照组接受标准自来水，三个治疗组接受饮用水中补充2'-fl、2'-fl和dfl(重量比为4:1)的混合物或6'-sl，相当于人每天约10克的剂量(通过nod小鼠品系的新陈代谢率和每日耗水量计算)。
小鼠接受治疗，持续12周，每两周换水一次。从12周龄起，每周检查小鼠的血糖水平。对血糖水平高于7mmol/l的小鼠进行严密监控，如果连续两次测量血糖水升高至>12mmol/l，则将其安乐死(并从研究中排除)。
治疗12周后，对小鼠实施安乐死，并进行以下取样：血清、胰腺、唾液腺、哈德氏泪腺、眶外泪腺以及盲肠和结肠内含物。
通过测量每只小鼠的8个(唾液腺)和2个(泪腺)苏木精和曙红染色的石蜡包埋切片上相对于总腺体大小的炎症灶的总面积来分析唾液和泪腺。使用组织学切片对胰脏进行相似的分析，对胰岛炎的程度至少评定25个(优选50个)胰岛，评分范围为0-3(0＝无胰岛炎，1＝周围性肠炎，2＝浸润性胰岛炎侵袭≤胰岛的50％，3＝浸润性胰岛炎侵袭≥胰岛的50％)。
盲肠内含物和血清用于测量短链脂肪酸(即乙酸盐、丙酸盐和丁酸盐)的浓度。在基线时获得的粪便样品以及安乐死后采样的结肠内含物用于微生物群的16srrna基因组测序。
血清样品还用于通过使用来自mesoscale的v-plex小鼠细胞因子19-plex试剂盒测量细胞因子浓度来测量系统性炎症。
结果显示，用2'-fl、6'-sl以及2'-fl和dfl的混合物治疗的小鼠唾液腺和泪腺炎症减少，并且与对照组小鼠相比胰腺炎症减少。
短链脂肪酸测量结果显示，与对照动物相比，补充2'-fl和2'-fl+dfl可以增加血清中的乙酸盐浓度。用6'-sl治疗会导致盲肠和血清中乙酸盐浓度的增加，以及盲肠丁酸盐浓度的增加。
数据表明，每天补充2'-fl、6'-sl或2'-fl和dfl的混合物(相当于人每天约10g的剂量)在nod小鼠中可减少外分泌腺的炎症。
实施例3
在
接种粪便微生物群后，这些反应器模拟升结肠、横结肠和降结肠。在对结肠不同区域的微生物群落进行两周的适应后，在三个结肠室中建立代表性的微生物群落，其在不同结肠区域的组成和功能均不同。
此外，考虑到粘液层定殖，在模拟结肠的反应器中包括猪粘蛋白。因此，
1.稳定：用取自健康成人的新鲜粪便样品接种反应器后，两周的稳定期使微生物群落根据所处环境条件在不同的反应器中分化。
在此期间，提供基本的营养基质，以支持最初存在于粪便接种物中的肠道微生物群的最大多样性。
2.对照：在这两个星期期间(c1和c2)，将标准营养基质计量加入模型中，持续14天。通过分析样品确定不同反应器中的基线微生物群落组成和活性，并将其用作参考。
3.处理：shime系统在正常条件下运行3周(t1，t2和t3)，但标准营养基质中添加了hmo。测试的hmo是2'-fl、lnnt以及2'-fl和lnnt的4:1混合物。
4.冲洗：在这两个星期的期间(w1和w2)，仅使用标准营养基质运行shime系统。
定期收集每个反应器中的液体样品(一周中的第一天，第三天和第五天，分别对应于图1中的a，b，c)，并分析定居的微生物群落的微生物代谢物和组成。特别地，使用its谱分析双歧杆菌组成。
图1显示了在近端(pc)和远端(dc)结肠反应器中与2'-fl处理相关的乙酸(aa)、丙酸(pa)、丁酸(ba)和总scfa(总计)的绝对值。
发酵系统的结果表明，hmo影响碱酸的消耗，这意味着hmo在近端结肠和远端结肠(较小程度)中都进行了发酵。细菌代谢物分析表明，hmo处理导致两个结肠区域的总scfa产量立即增加，这主要是由于乙酸盐和丙酸盐产量的增加。在hmo处理的第三周，丁酸盐有所增加。这与乙酸盐的减少有关。
对双歧杆菌群落的分析表明，在开始的两周(t1和t2)中，消耗hmo时青春双歧杆菌的丰度增加。但是，到第3周(t3)，青春双歧杆菌系统发育组成员的相对丰度降低，而长双歧杆菌和/或两歧双歧杆菌的丰度和相对丰度增加。
可以看出，向m-shime喂入hmo会影响scfa的产生，处理14天以上会增加两个结肠区域中丁酸盐的浓度。
实施例4
招募总共180名患有系统性自身免疫性状况的男性和女性参与者参与研究。纳入研究后，每个参与者都要完成电子调查，在开始治疗之前，他们会报告各种胃肠道和非胃肠道疾病。使用5点李克特量表，其中1等于没有症状，5等于严重症状。然后，患者食用约4g2'-fl或2'-fl和lnnt的4:1(按重量计)混合物。
此后每3周，患者再次完成进一步的调查，报告各种胃肠道和非胃肠道疾病。完成调查的患者将获得另外3周的hmo供应。未完成调查的患者被排除在研究之外。
3周后，有最初症状的患者报告胃肠道疼痛、便秘、腹泻、能量水平、注意力集中能力、抑郁、焦虑和偏头痛/头痛得到改善。12周后，患者的平均症状评分降至背景健康人群的水平。此外，没有初始症状的患者的平均症状评分没有增加。
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