基因修饰的间充质干细胞提取物、提取方法及在皮肤紧致和抗衰老方面的应用与流程

2021-01-08 12:01:26|

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本发明涉及基因工程
技术领域：
，尤其涉及基因修饰的间充质干细胞提取物、提取方法及在皮肤紧致和抗衰老方面的应用。
背景技术：
：在人类生活中，改善外貌比所有其他日常生活相关问题加起来占据了更大的焦点。美化人体的消费品远远多于治疗人类疾病的消费品。改善身体的色调和外观是一个不断增长的数十亿美元的产业，包括化妆品、营养品、制药和物理治疗。消费者的注意力集中在用于抗老化、抗皱、身体塑形、静脉曲张减少、痤疮消除和减肥组合的最新成分。在所有这些化妆美容的关注中，面部外观的改善是人类，尤其是女性最关注和关心的问题。因此，面部的选择性治疗对消费者来说至关重要。随着年龄的增长和长期暴露于不利的环境因素中，皮肤的视觉外观、物理特性和生理功能会发生不受欢迎的变化。最显著的变化包括细纹和皱纹的发展、失去弹性、增加下垂、失去坚实度、失去颜色均匀度、粗糙的表面纹理和斑驳的色素沉着。不太明显但可测量的变化包括细胞和组织活力普遍减少、细胞复制率降低、皮肤血流量减少、水分含量减少、结构和功能上的误差累积，减少了皮肤自我重塑和修复的能力。上述外观和功能上的许多变化是由皮肤外表皮层的变化引起的，而其他变化则是由下部真皮的变化引起的。不管皮肤损伤的刺激因素是什么，当损伤发生时，许多自然的和复杂的生化机制被启动，试图修复损伤。当表皮受到损伤时，表皮基底细胞会对损伤作出反应，以更频繁的速度分裂。这种复制速度的增加导致受损的表皮更迅速地被新的表皮和角质层取代，这一过程被称为“表皮细胞更新”。增加表皮细胞更新率的常见损伤包括磨损、化学损伤、过度曝晒、过敏或非过敏接触刺激。在分子水平上，这些老化的变化与真皮主要细胞所在的细胞外基质的含量和结构的生化变化有关。胶原蛋白高度交联、无弹性，弹性蛋白数量减少、分布不正确，透明质酸数量减少，这些均导致细胞间水减少。由于这种变化，金属离子、生长因子、激素和细胞因子的数量和分布发生了变化，导致成纤维细胞代谢活性降低或停止活动。尽管这些细胞有修复自身和基质的自然机制，但随着年龄的增长和损伤的加剧，它们修复损伤的能力越来越弱，病情也在不断恶化。如果静止的成纤维细胞能够被代谢激活和刺激分裂，它们将合成新的细胞外基质，旧的受损基质将被酶降解和取代。这种平衡的合成和降解过程被称为“真皮重塑”。激活过程可以通过许多不同的方式完成，包括选择的激素、生长因子、细胞因子、维生素、植物提取物和类维生素a进行化学刺激，或者通过增加营养供应到组织。导致皮肤老化的因素有两类:内源性和外源性。内源性衰老是人体自然衰老的过程。表皮干细胞随着年龄的增长而减少，这可能导致基底层细胞功能紊乱、透明质酸和保湿因子减少。此外，激素(如皮脂腺)分泌的减少可能会减缓皮肤的新陈代谢，从而导致皮肤失去张力和弹性。真皮成纤维细胞功能的恶化也可能使胶原蛋白和弹性蛋白的生成缓慢减少，从而导致真皮结缔组织退化，导致皮肤松弛甚至起皱。真皮结缔组织变性可降低皮肤的储水功能，导致皮肤干燥缺水。最后，表皮和真皮的萎缩可能会降低皮肤的保护能力，或导致血管弹性的丧失，导致皮下出血。外源性衰老是由于皮肤与环境的直接接触而引起的，皮肤暴露在阳光、污染、自由基、吸烟等外部因素的影响下。皮肤的外源性老化包括抑制细胞更新和修复，降低保护能力，以及黑色素的积累。导致皮肤老化的主要因素是来自太阳的紫外线(uv)造成的损害，它可能会加速皮肤老化5到10倍。长波紫外线(uva)和中波紫外线(uvb)是日常生活中最常见的紫外线。长期暴露于uvb可刺激真皮成纤维细胞表达胶原酶降解胶原，导致胶原密度降低，胶原变性，皮肤失去弹性。此外，黑色素细胞会开始退化，导致皮肤颜色不均。因此，自由基在皮肤中过度产生，导致皮肤暗沉和黑斑的形成，甚至各种皮肤癌。迄今为止，预防和修复皮肤老化的方法有很多，包括细胞外基质(ecm)补充治疗、肉毒杆菌注射和脱落性物理治疗。ecm补充疗法包括在皮肤表面涂上胶原蛋白、弹力蛋白、透明质酸或维生素e。然而，这些分子的结构太大，不能被皮肤有效吸收，进入皮肤。肉毒杆菌注射虽能改善皮肤松弛，但效果只能维持3～6个月，可能会引起上睑下垂、面部表情僵硬、注射部位肌肉无力等副作用。虽然去角质理疗可以去除老化角质，刺激皮肤增殖，但也有很多副作用，包括皮肤变弱，修复缓慢，术后并发症多。细胞疗法是治疗皮肤老化的另一种选择，包括使用干细胞来改善受损的皮肤组织。例如，脂肪来源的干细胞(adsc)是从脂肪组织中分离出来的多功能干细胞，adscs具有高度的可塑性，可分化为多种组织细胞，如神经细胞、血管内皮细胞、心肌细胞、肝细胞、软骨细胞和肌细胞。以前，大部分从抽脂手术中获得的脂肪组织被当作废物扔掉。然而，研究发现脂肪组织富含间充质干细胞，具有体外增殖和多种分化潜能。这些细胞具有低侵袭性，对人体危害小的优点。此外，这些细胞可以在体外培养，并可广泛用于各种类型的身体组织。这些细胞可以自发地移动到受伤的区域并修复伤口。目前，皮肤细胞治疗必须通过将细胞注射到受试者体内来进行。最常见的注射一定量干细胞的方法是皮下注射。然而，这种疗法是侵入性的，有一定的风险，会造成许多创伤，可能会影响皮肤的外观。此外，这种传统细胞疗法的应用有很多限制，因为在这种疗法中使用活细胞，在注射前应严格评估活细胞的安全性。鉴于上述ecm补充治疗和肉毒杆菌注射的疗效和副作用有限，以及细胞治疗的潜在风险和局限性，开发基因修饰的间充质干细胞提取物、提取方法及在皮肤紧致和抗衰老方面的应用，不但具有迫切的研究价值，也具有良好的经济效益和大规模医疗应用潜力，这正是本发明得以完成的动力所在和基础。技术实现要素：为了克服上述所指出的现有技术的缺陷，本发明人对此进行了深入研究，在付出了大量创造性劳动后，从而完成了本发明。具体而言，本发明所要解决的技术问题是：提供基因修饰的间充质干细胞提取物、提取方法及在皮肤紧致和抗衰老方面的应用，促进透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白或网状蛋白在皮肤中的表达。第一方面，提供基因修饰的间充质干细胞提取物，所述提取物中至少含有sdf-1,vegf,cxcr4,klotho里面的一种。本发明中，作为一种优选的技术方案，所述基因修饰的间充质干细胞是指利用分泌型klotho基因修饰的间充质干细胞的。本发明中，作为一种优选的技术方案，所述分泌型klotho基因的核酸序列如seqidno.1。本发明中，作为一种优选的技术方案，所述基因修饰的间充质干细胞采用包括如下步骤的制备方法得到：利用质粒制备技术获得pav-ef1α-klotho质粒；利用质粒转染状态良好的293t细胞；制备脐带间充质干细胞；利用腺病毒感染脐带间充质干细胞。第二方面，本发明提供了基因修饰的间充质干细胞提取物的提取方法，包括如下步骤的制备方法得到：将基因修饰的间充质干细胞消化裂解，得到基因修饰间充质干细胞的提取物。第三方面，本发明提供了基因修饰的间充质干细胞提取物在皮肤紧致和抗衰老方面的应用。本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，本发明的基因修饰的间充质干细胞提取物的使用形式包括化妆品或药物。本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，所述化妆品或药物包括其他添加剂，如用于增强的调味剂、香水、爽肤水或着色剂。本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，所述化妆品或药物还可加入适量的防腐剂、保守剂、抗真菌剂。此外，皮肤护理产品，化妆品或药剂可以添加一个或多个其他活性成分，进一步提高护肤产品，化妆品或药剂的功效，或增加配方的灵活性，只要其他活性成分对间充质干细胞提取物预期的效果没有不利影响。本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，所述化妆品包括面膜、颈膜、乳剂、喷雾、精华液。本发明中，作为一种优选的技术方案，在应用中，本发明的基因修饰的间充质干细胞提取物的使用形式采用化妆品面膜。由于采用以上技术方案，本发明具有如下有益效果：本发明提供的产品当应用于皮肤表面时，可以很容易地穿透皮肤，促进透明质酸、弹性蛋白、胶原蛋白或网状蛋白在皮肤中的表达，刺激管理区域的细胞增殖，刺激管理区域的细胞分泌营养因子，或刺激内源性造血祖细胞在管理区域聚集和增殖。本发明的组合物含有对面部提拉紧致、减少“双下巴”、颈部细瘦的成分，同时还具有抗衰老和抗皱的功效。一种面膜和颈膜产品，可应用于面部、下巴和颈部区域，提供特定于人体部位的减脂、瘦身、紧肤、抗老化和抗皱成分，达到最佳效果。此外，面膜被认为具有吸附作用，可以去除角质层中不需要的油脂、污染物、杂质和死细胞。去除面膜可以确保深层清洁皮肤，尤其是表皮角质层。它还提供了一种表皮的超水合状态，从而改善肤色和质地。本发明通过加入基因修饰的间充质干细胞提取物，可增强皮肤美白、祛痘、祛除老花斑、减脂的功效。还可以促进皮肤中胶原蛋白和弹性蛋白的形成，同时具有抗氧化和抗炎作用。本发明中基因修饰间充质干细胞提取物被认为是修复皮肤老化的有效方法，包括但不限于，促进伤口愈合、改善皮肤质量和皮肤松弛、减少皮肤皱纹和条纹、改善皮肤紧致性、美白肌肤、减少皮肤暗沉和皮肤斑点、祛痘。本发明中有各种各样的化妆品输送方式，比如面膜、颈膜、喷雾、精华液等，这些都被用来为面部区域提供有益的成分和成分。化妆品面膜提供了一种最理想的输送系统，为面部皮肤输送有益的皮肤成分和组合物。附图说明图1为本发明中基因修饰间充质干细胞sdf-1、vegf、cxcr4、klotho的表达量。具体实施方式下面结合具体的实施例对本发明进一步说明。但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。实施例1修饰间充质干细胞的分泌型klotho基因，其核酸序列如seqidno.1。利用质粒制备技术获得pav-ef1α-klotho质粒，经上海生工生物工程股份有限公司测序正确后，大量提取备用。实施例2脐带间充质干细胞的制备取医院捐献的新生儿脐带，在超净工作台中先用75％酒精消毒两次，放在培养皿中，用镊子剥离出其中的华氏胶组织，用剪刀剪碎至0.5mm2大小的小块。将剪碎的华氏胶组织转移到培养瓶中，加入含有血浆替代物的ultraculture培养基培养，每天用显微镜观察。爬出的干细胞铺满瓶底的80％时，进行传代，传代后细胞生长速度加快，每2-3天传一代，传至p4代用于实验。实施例3用常规技术方法进行293t细胞的复苏，培养状态良好时用于转染实验。将pav-ef1α-klotho和包装质粒、辅助质粒三种质粒以1:1:1的比例混匀，转染状态良好的293t细胞，37℃，5％co2培养箱中培养48h，收集上清，4℃，2000g离心10min，转移至新的ep管中，4.5μm滤器过滤后-80℃保存。进行病毒滴度测定，本发明中获得的病毒滴度为3.3×107tu/ml。实施例4腺病毒感染脐带间充质干细胞1、将生长状态良好的间充质干细胞消化计数后稀释至1×105/ml，加入六孔板中，补加培养基至3ml。放入37℃，5％co2培养箱中培养24h。2、从-80℃拿出2ml病毒液，加入终浓度为8μg/ml的聚凝胺(购自sigma公司)。3、从培养箱中拿出六孔板，去掉六孔板中的培养基，加入准备好的病毒液，放入培养箱中继续培养24h。4、24h后，去掉六孔板中的病毒液，添加完全培养基进行培养，同时加入3ug/ml的嘌呤霉素进行筛选，放在37℃，5％co2培养箱中培养，每两天换液一次，培养5天，成活的细胞即为腺病毒感染的干细胞。实施例5(一)细胞总rna的提取1、分别取1×107个正常的干细胞和klotho基因修饰的干细胞，300g，离心5min。2、弃上清，加入600μlbufferrlt(1ml加入10μlβ-巯基乙醇)，颠倒混匀，涡旋，充分裂解细胞。3、加600μl的70％无水乙醇，迅速吹打混匀。4、将样品转移至带有2ml回收管的粉色rneasyspincolumn中，8000g离心15s,将滤出物丢弃。5、加入700μlbufferrw1至column，8000g离心15s，丢弃滤出物和收集管。6、转移column至新的收集管，加入500μlbufferrpe，8000g离心15s，丢弃滤出物。7、再加入500μlbufferrpe，8000g离心2分钟，弃收集管和滤出物。8、取新收集管8000g离心1min，晾干。9、转移rneasyspincolumn至1.5ml收集管，加入30-50μl无rna酶的水于滤膜上，静置5min，8000g离心1分钟，洗脱rna。10、用分光光度计测定滤液在260nm波长下的吸光度，来测定rna的浓度。(二)cdna的合成去除基因组dna：在rna的专区操作，使用depc水处理过的ep管，移液枪。按照如下成分于冰上配置反应混合液，在分装到每个反应管中，最后加入rna样品。5×gdnaeraserbuffer2.0μlgdnaeraser1.0μltotalrna1.0μlrnasefreewater6.0μl总体积10.0μl混匀，42℃2min，4℃，彻底除去rna中的gdna。反转录反应：反应液配置均在冰上进行。为了保证反应液配置的准确性，进行各项反应时，应先按反应数+2的量配置mastermix，然后再分装10μl到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。上述步骤的反应液10.0μlprimescriptrtenzymemixi1.0μlrtprimermix1.0μl5×primescriptbuffer24.0μlrnasefreewater4.0μl总体积20μl混匀，37℃15min，85℃5sec，4℃，长期保存时放于-20℃。(三)rt-qpcr检测sdf-1、vegf、cxcr4、klotho含量按下列组份配置pcr反应液，全程均在冰上进行。pcr引物为合成的相应基因的引物，并标识清楚。sybrpremixextaqⅱ2×10μlpcrforwardprimer(10μm)0.8μlpcrreverseprimer(10μm)0.8μlroxreferencedyeⅱ50×0.4μlrt反应液(cdna溶液)2.0μlddh2o6μl总体积20μl混匀反应液，将其放入荧光定量pcr仪中。realtimepcr反应用两步法运行，反应条件如下：反应结束后确认realtimepcr的扩增曲线和溶解曲线，对pcr定量进行分析，结果如图1所示。基因修饰的间充质干细胞中sdf-1、vegf、cxcr4三个基因的表达量要比正常的干细胞表达量高5倍左右，而klotho基因的表达量高10倍左右。实施例6用胰酶消化液将基因修饰的间充质干细胞消化下来，转移到50ml离心管里，室温下，400g离心5min，弃上清。加入1％的np40裂解液、1％的pmsf、1％的β甘油磷酸盐、1％的na3vo4，重悬细胞。4℃下，摇床上摇动20min，充分裂解细胞，12000rpm离心10min。收集上清液，即为本发明中基因修饰间充质干细胞的提取物。实施例7本发明的护肤产品、化妆品和药物可以以任何合适的形式呈现，没有特定的限制。例如，护肤品、化妆品和药物可以乳剂、喷雾、面膜或颈膜的形式外用，但并不局限。本发明的基因修饰间充质干细胞提取物制造的护肤品、化妆品或药物还可以包括其他添加剂，如用于增强的调味剂、香水、爽肤水或着色剂。还可加入适量的防腐剂、保守剂、抗真菌剂等，以提高护肤品、化妆品或药剂的贮存性。此外，皮肤护理产品，化妆品或药剂可以添加一个或多个其他活性成分，进一步提高护肤产品，化妆品或药剂的功效，或增加配方的灵活性，只要其他活性成分对间充质干细胞提取物预期的效果没有不利影响。实施例8本发明的间充质干细胞提取物所制造的护肤品、化妆品或药物，可根据受试者的要求，以不同的给药频率使用。如一天一次、一天几次或几天一次等。例如，当用于涂抹在皮肤表面以修复老化皮肤时，皮肤护理产品、化妆品或药物的剂量范围从0.01-1ml/cm2，最好是0.05-0.5ml/cm2。但对于皮肤老化较严重的受试者，可根据实际需要将剂量增加几倍或几十倍。选取受试者使用本发明中基因修饰的间充质干细胞提取物和正常的间充质干细胞提取物，每组受试者早晚各使用一次，早上使用喷雾，晚上使用面膜，测定4周内的皮肤角质层含水量以及皮肤弹性、皱纹深度、毛孔、色素沉积。测定方法如下：使用韩国恩盛的a-onesmart面部诊断系统测量左右脸颊部位皮肤。测定结果为：受试者使用产品4周后，均出现了不同程度的毛孔缩小、皮肤含水量增加、皱纹减少、色斑变淡、皮肤有弹性。而且使用基因修饰的间充质干细胞要比使用间充质干细胞的效果更明显。应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。序列表<110>山东兴瑞生物科技有限公司<120>基因修饰的间充质干细胞提取物、提取方法及在皮肤紧致和抗衰老方面的应用<130>2019<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1647<212>dna<213>人种(homosapiens)<400>1atgcccgccagcgccccgccgcgccgcccgcggccgccgccgccgtcgctgtcgctgctg60ctggtgctgctgggcctgggcggccgccgcctgcgtgcggagccgggcgacggcgcgcag120acctgggcccgtttctcgcggcctcctgcccccgaggccgcgggcctcttccagggcacc180ttccccgacggcttcctctgggccgtgggcagcgccgcctaccagaccgagggcggctgg240cagcagcacggcaagggtgcgtccatctgggatacgttcacccaccaccccctggcaccc300ccgggagactcccggaacgccagtctgccgttgggcgccccgtcgccgctgcagcccgcc360accggggacgtagccagcgacagctacaacaacgtcttccgcgacacggaggcgctgcgc420gagctcggggtcactcactaccgcttctccatctcgtgggcgcgagtgctccccaatggc480agcgcgggcgtccccaaccgcgaggggctgcgctactaccggcgcctgctggagcggctg540cgggagctgggcgtgcagcccgtggtcaccctgtaccactgggacctgccccagcgcctg600caggacgcctacggcggctgggccaaccgcgccctggccgaccacttcagggattacgcg660gagctctgcttccgccacttcggcggtcaggtcaagtactggatcaccatcgacaacccc720tacgtggtggcctggcacggctacgccaccgggcgcctggcccccggcatccggggcagc780ccgcggctcgggtacctggtggcgcacaacctcctcctggctcatgccaaagtctggcat840ctctacaatacttctttccgtcccactcagggaggtcaggtgtccattgccctaagctct900cactggatcaatcctcgaagaatgaccgaccacagcatcaaagaatgtcaaaaatctctg960gactttgtactaggttggtttgccaaacccgtatttattgatggtgactatcccgagagc1020atgaagaataacctttcatctattctgcctgattttactgaatctgagaaaaagttcatc1080aaaggaactgctgacttttttgctctttgctttggacccaccttgagttttcaacttttg1140gaccctcacatgaagttccgccaattggaatctcccaacctgaggcaactgctttcctgg1200attgaccttgaatttaaccatcctcaaatatttattgtggaaaatggctggtttgtctca1260gggaccaccaagagagatgatgccaaatatatgtattacctcaaaaagttcatcatggaa1320accttaaaagccatcaagctggatggggtggatgtcatcgggtataccgcatggtccctc1380atggatggtttcgagtggcacagaggttacagcatcaggcgtggactcttctatgttgac1440tttctaagccaggacaagatgttgttgccaaagtcttcagccttgttctaccaaaagctg1500atagagaaaaatggcttccctcctttacctgaaaatcagcccctagaagggacatttccc1560tgtgactttgcttggggagttgttgacaactacattcaagtatctcaacttactaagcct1620atttcttctcttactaagccttatcat1647当前第1页1 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