一种生物活性肽眼部修复精华和凝胶的制作方法

2021-01-08 12:01:07|

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本发明涉及生物活性肽技术领域，尤其指一种生物活性肽眼部修复精华和凝胶。

背景技术：

生物活性肽(bioactivepeptides，bap)是蛋白质中20种天然氨基酸以不同组成和排列方式构成的从二肽到复杂的线性、环形结构的不同肽类的总称，是源于蛋白质的多功能化合物。[1]生物活性肽具有多种人体代谢和生理调节功能，易消化吸收，有促进免疫、激素调节、抗菌、抗病毒、降血压、降血脂等作用，是当前国际食品界最热门的研究课题和极具发展前景的功能因子。

生物活性肽的制备方法可分为直接提取法、人工合成法和蛋白质降解法三种。

直接提取法就是利用各种分离纯化技术，直接从自然界生物体中提取出各种生物活性肽。由于这些生物活性肽是生物体本身所含有的，并且在生物体中含量很低，如果要把这些活性肽从生物体中分离出来获得较高纯度的产物，成本很高。

人工合成生物活性肽的途径主要有三条：化学合成法、酶合成法和重组dna技术。化学合成途径主要是固相合成法和液相合成法，化学合成法的缺点：具有消旋化和副反应；需要对肽侧链中的基团进行保护；需要过量的链接试剂和酰基载体；链接试剂的毒性残留影响制品质量和环境。酶合成法相对有很多优点，如反应温和,酶催化位置有方向性等，但反应副产物多，产率过低。而使用dna重组技术只能合成大分子肽类和蛋白质，对人类主要需求的具有营养价值的小肽，这种方法也不适用。

蛋白质水解产生的活性肽主要是以化学法和酶法水解而来。化学法以酸或碱断开蛋白质肽键，由于反应环境较极端,不利于活性的保持。酶法水解蛋白质生产的活性肽安全性高、无副作用，能在温和的条件下进行定位水解分裂产生特定的肽，且水解过程易于控制。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种生物活性肽眼部修复精华,该精华保留了生物活性肽的活性、纯度高，具有非常好的修复功能，可以滴可以外敷，对于因为长期面对屏幕造成的蓝光伤害和其他强光照射、沙眼等造成的角膜等损失就有很好的恢复作用。

一种生物活性肽眼部修复精华，由以下步骤制成：

(1)将胎牛眼提取物2份、胎牛下额下腺活性肽提取物0.1份、牛肺提取物0.1份用90倍纯水溶解；

(2)取胎牛脑髓提取物2份与10份甘油混合分散；

(3)把步骤(1)所制备的水相混合物和步骤(2)所制备的油相混合物混合即为生物活性肽眼部修复精华。

其中，胎牛眼提取物采用如下工艺制成：取胎牛眼睛晶体，绞碎，往绞碎的胎牛眼睛晶体中加10～15倍的纯水，加热到50到58度；

将纯度为20％的naoh溶液加入绞碎的胎牛眼睛晶体混合溶液中，调节混合溶液ph值至8.5～9；向混合溶液中加入胎牛眼睛晶体重量2％的胰酶，酶解3～5小时；对混合溶液进行加热升温到85～90度；离心过滤，滤液中加2～3倍纯度90％以上酒精，沉淀12～24小时，倒出液体，收集沉淀物，将沉淀物冷冻干燥，即为胎牛眼提取物。

其中，胎牛下额下腺活性肽提取物采用如下步骤制成：采用均质机将胎牛下颚下腺在速度为12500-13500rpm下进行均质处理25-35min，再向均质处理后的胎牛下颚下腺加入缓冲溶液，3-5h后离心分离，收集上清液；获取的上清液加入硫酸铵饱和处理，温度为1-5℃下静置24h以上，收集沉淀，透析除盐，浓缩，冻干，得到胎牛下额腺活性肽。

优选的，均质机均质处理的温度为4-6℃，最好是5℃；所述缓冲溶液为nh4ac-hac，所述的缓冲溶液的ph值为3，浓度为0.04-0.06mol/l。

其中，胎牛下颚下腺与缓冲溶液的质量比为1:8-1:12，最佳质量比为1:10。

其中，所述透析除盐过程所采用的透析液用乙酸钠-乙酸调节ph至3，然后再采用阳离子交换树脂进行吸附，收集阳离子交换树脂，洗脱，收集洗脱液；洗脱液采用第一阴离子交换树脂吸附，收集第一阴离子交换树脂，洗脱，收集洗脱液，离心，收集上清液，纳滤除盐。

其中，所述透析除盐过程中阳离子交换树脂吸附的时间为5-7小时：收集的阳离子交换树脂采用浓度为0.04-0.06mol/l，ph＝7的乙酸氨-乙酸缓冲液洗脱1.8-2.2小时；所述洗脱液采用第一阴离子交换树脂进行吸附3.5-4.5小时；收集的所述阴离子交换树脂采用氯化钠和盐酸混合液调节ph＝2进行洗脱1.5-2.5小时。

其中，氯化钠的浓度为0.13-0.17mol/l，盐酸的浓度为0.03-0.07mol/l。

其中，阳离子交换树脂为罗门哈斯amberlitetmfpc3500阳离子交换树脂、第一阴离子交换树脂为罗门哈斯amberliteira67阴离子交换树脂。

其中，所述胎牛脑髓提取物采用如下步骤制成：取胎牛脑髓，绞碎，打进反应釜，加3～5倍的纯水，蒸汽加热48～52度，用质量百分比20％的naoh调节混合溶液ph值至8～8.5，加入混合液体质量3％的胰酶，50℃保温酶解5小时，再向混合溶液中加入2～3倍含90％以上酒精，密封搅拌2～3小时，静置5小时，抽出混合酶解液的上清液进行减压蒸馏，除去上清液中的酒精和水份，获得浓缩液，冷冻干燥，即为胎牛脑髓提取物。

其中，所述牛肺提取物采用如下步骤制成：取胎牛牛肺粉碎，用泵抽到酶解罐里，搅拌，加烧碱调ph至9；导入蒸汽升温至55℃，加入复合蛋白酶保温酶解6小时，再加入工业盐，盐与酶解液比例为3:100；继续保温55℃搅拌2小时后，升温至85度，停止搅拌，保温30分钟，过滤，过滤液用泵抽到吸附罐，水浴降温酶解液冷却至60℃，加入第二阴离子交换树脂，第二阴离子交换树脂加入量为酶解液的1％；而后保温搅拌吸附8小时后，过滤，收集离子交换树脂，用温水洗净第二阴离子交换树脂，倒进洗脱罐，用20％的精盐水洗脱，盐水和离子交换树脂为1:1；60℃保温搅拌洗脱2小时；收集洗脱液，加85℃以上酒精沉淀，酒精为洗脱液的1倍，静置过夜，收集沉淀，即为胎牛牛肺一次提取物；所述牛肺一次提取物用2％的盐水溶解，用烧碱调ph至9，加入高锰酸钾浓液，使含牛肺一次提取物盐水不再退色为止，50℃氧化4小时，冷却至室温，慢慢加入双氧水，使液体的双氧水的含量达3％，再氧化24小时，离心过滤，收集滤液，加热至60度，搅拌慢慢加85度以上酒精，使液体的酒精度为38为止，静止1小时，收集沉淀物，60度烤干，为牛肺提取物精品；取浓硫酸二份，氯磺酸一份，混合成混合酸；小心加到陶瓷反应釜中，加入混合酸质量10％的牛肺提取物精品，在0℃环境中反应2小时，通风换气；再在25℃环境中反应1小时，用质量分数20％烧碱液调ph至7，加入6倍液体的乙醚，收集沉淀，用质量分数2％盐水溶解，加酒精至60℃沉淀，沉淀用无水酒精脱水，冷冻干燥，即为牛肺提取物。

优选的，本发明中所用第二阴离子交换树脂为罗门哈斯fpa98型号。

本发明的另一个目的还在于提供一种生物活性肽眼部修复凝胶，该凝胶通过在前述任一生物活性肽眼部修复精华加入微量的乙基纤维素乳化成凝胶状，即为生物活性肽眼部修复凝胶。

本发明的有益效果在于：本发明的生物活性肽眼部精华及凝胶可滴于眼睛晶体部位、眼角、眼脸等部位，无刺激，无不良反应；长期使用能预防儿童青少年近视。对于长期使用手机、电脑、电子产品办公人员，使用生物活性肽眼部凝胶，能减少光辐射对眼睛的伤害，消除眼睛疲劳，头晕眼花等症状，同时本发明对老年眼睛干涩，老花眼有很好的治疗作用。另一方面，本生物活性肽眼部凝胶涂抹于眼脸上，对于消除眼部浮肿、眼袋有一定作用。

具体实施方式

为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。

需要提前说明的是，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“相连”、“连接”、“固定”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或一体地连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通。对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

此外，在本发明中，除非另有明确的规定和限定，第一特征在第二特征“上”或“下”可以包括第一和第二特征直接接触，也可以包括第一和第二特征不是直接接触而是通过它们之间的另外的特征接触。而且，第一特征在第二特征“之上”、“上方”和“上面”包括第一特征在第二特征正上方和斜上方，或仅仅表示第一特征水平高度高于第二特征。第一特征在第二特征“之下”、“下方”和“下面”包括第一特征在第二特征正下方和斜下方，或仅仅表示第一特征水平高度小于第二特征。术语“上”、“下”、“前”、“后”、“左”、“右”、“竖直”、“水平”、“顶”、“底”、“内”、“外”等指示的方位或位置关系，仅是为了便于描述本发明和简化描述，而不是指示或暗示所指的装置或元件必须具有特定的方位、以特定的方位构造和操作，因此不能理解为对本发明的限制。

实施例

本发明所提供的生物活性肽眼部修复精华，采用胎牛组织提取物作为原料，采用现代工艺，保留了胎牛组织活性肽中具备组织修复能力的重要活性肽成分，效果非常好，其制备工艺过程如下：

一种生物活性肽眼部修复精华，由以下步骤制成：

(1)将胎牛眼提取物2份、胎牛下额下腺活性肽提取物0.1份、牛肺提取物0.1份用90倍纯水溶解；

(2)取胎牛脑髓提取物2份与10份甘油混合分散；

(3)把步骤(1)所制备的水相混合物和步骤(2)所制备的油相混合物混合即为生物活性肽眼部修复精华。

以上是本生物活性肽眼部修复精华在已经完成了胎牛眼提取物、胎牛下额下腺活性肽提取物、牛肺提取物以及胎牛脑髓提取物之后采取的操作，而在进行上述步骤前，核心就是对胎牛不同组织进行提取，以获取其组织中对于眼部修复最为有益的提取物，特别是活性生物肽。

例如，针对胎牛眼提取物我们是采用如下工艺提取：首先，取胎牛眼睛晶体，绞碎，往绞碎的胎牛眼睛晶体中加10～15倍的纯水，加热到50到58度；将纯度为20％的naoh溶液加入绞碎的胎牛眼睛晶体混合溶液中，调节混合溶液ph值至8.5～9；向混合溶液中加入胎牛眼睛晶体重量2％的胰酶，酶解3～5小时；对混合溶液进行加热升温到85～90度；离心过滤，滤液中加2～3倍纯度90％以上酒精，沉淀12～24小时，倒出液体，收集沉淀物，将沉淀物冷冻干燥，即为胎牛眼提取物。

又如，胎牛下额下腺活性肽提取物我们是采用如下步骤提取：采用均质机将胎牛下颚下腺在速度为12500-13500rpm下进行均质处理25-35min，再向均质处理后的胎牛下颚下腺加入缓冲溶液，3-5h后离心分离，收集上清液；获取的上清液加入硫酸铵饱和处理，温度为1-5℃下静置24h以上，收集沉淀，透析除盐，浓缩，冻干，得到胎牛下额腺活性肽。

优选的，均质机均质处理的温度为4-6℃，最好是5℃；所述缓冲溶液为nh4ac-hac，所述的缓冲溶液的ph值为3，浓度为0.04-0.06mol/l。

其中，胎牛下颚下腺与缓冲溶液的质量比为1:8-1:12，最佳质量比为1:10。

其中，氯化钠的浓度为0.13-0.17mol/l，盐酸的浓度为0.03-0.07mol/l。

其中，阳离子交换树脂为罗门哈斯amberlitetmfpc3500阳离子交换树脂、第一阴离子交换树脂为罗门哈斯amberliteira67阴离子交换树脂。

优选的，本发明中所用第二阴离子交换树脂为罗门哈斯fpa98型号。

严格按照以上方法，我们一共设计了4组实施例和1组对比例用于检测本发明所提取的生物活性肽眼部修复精华及凝胶的功效。测定数据包括：铁还原能力、dpph自由基清除能力、羟基自由基清除能力(oh清除能力)。

其中，对照组采用无菌净化水，实施例1-4均采用本发明发明所提取的精华液。

其中，铁还原能力测试按照如下方法进行：取250ul待测样品加入到4mltptz(2,4,6-三吡啶基三嗪)工作液中(工作液由25ml的0.3m、ph＝3.6醋酸盐缓冲液，2.5ml的10mm的tptz溶液，2.5ml的20mm的fecl3均匀混合而成)，于37°反应10min，在593nm处测定其吸光度。

样品铁还原能力以每毫克样品相当于ugvc的铁还原能力表示。

其中，dpph自由基清除能力按照如下方法测定：配制待测溶液，取1ml待测样品+1ml，0.1mmdpph(2,2-联苯基-1-苦基肼基,溶于95％乙醇)振荡混匀，室温放置30min，于517nm检测吸光度变化。

清除率％＝(acontrol-asample-as)/acontrol×100％；

acontrol:1ml的乙醇溶液加1ml的，0.1mmdpph按照上述反应后的吸光度值；

asample：1ml的样品溶液加1ml的，0.1mmdpph按照上述反应后的的吸光度值；

ab:1ml样品溶液加1ml水的吸光度值；

其中，羟基自由基清除能力(oh清除能力)按照如下方法测定：

配置待测溶液，取1ml的0.2m，ph7.8磷酸盐缓冲液+0.75ml的7.5mm的邻二氮菲溶液+0.5ml的7.5mm的feso4溶液+0.5ml待测样品+0.5ml，30mmh2o2+1.75ml水，配好溶液于37°放置60min，再于510nm检测吸光度。

清除率％＝(as-a损伤)/(a未损-a损)×100％；

as：样品溶液的吸光度值；

上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本技术方案构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。

为了让本领域普通技术人员更方便地理解本发明相对于现有技术的改进之处，本发明的描述已经被简化，并且为了清楚起见，本申请文件还省略了一些其它元素，本领域普通技术人员应该意识到这些省略的元素也可构成本发明的内容。