一种黑果荚蒾提取物及其制备方法和应用与流程

本发明涉及一种黑果荚蒾提取物及其制备方法和应用，尤其涉及一种可制备为预防和/或缓解糖尿病并发症药物的黑果荚蒾提取物及其制备方法和应用。
背景技术：
：糖尿病是以血糖水平升高为特征的全身代谢疾病。据国际糖尿病联盟(internationaldiabetesfederation，idf)统计，2019年全球约有4.63亿糖尿病患者，而我国约有1.164亿，是糖尿病患者最多的国家。随着糖尿病病情的发展，持续高血糖所诱发的糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和糖尿病神经病变等慢性并发症是糖尿病致死、致残的主要原因。多元醇代谢通路(polyolpathway，pp)的激活与糖尿病并发症的发生、发展有着密切的联系。醛糖还原酶(aldosereductase，ar)是多元醇通路的关键限速酶。在高血糖浓度环境下，醛糖还原酶被激活，细胞内的葡萄糖被还原成山梨醇，大量的山梨醇不易通过细胞膜而在细胞内大量聚集，进而导致细胞处于高渗状态并引起一系列代谢混乱。该通路的活化正是糖尿病并发症产生的主要原因，所以以醛糖还原酶为靶点，寻找抑制其活性的物质可有效降低糖尿病并发症的发生概率。黑果荚蒾(viburnummelanocarpump.s.hsu)为忍冬科荚蒾属植物，落叶灌木，分布于江苏、安徽、浙江东、江西等地，其果实作为传统中药，可用于治疗炎症及创伤性出血。现代研究表明，部分荚蒾属植物果实中含有的多酚类物质，如欧洲荚蒾和地中海荚蒾，具有较强的防治慢性疾病的作用。目前尚未有关于黑果荚蒾果实化学成分及其生物活性的报道，这在很大程度上限制了黑果荚蒾果实的开发和利用。技术实现要素：发明目的：本发明第一目的是提供一种可制备为预防和/或缓解糖尿病并发症药物的黑果荚蒾提取物，第二目的是提供一种所述黑果荚蒾提取物的制备方法，第三目的是提供一种所述黑果荚蒾提取物在制备醛糖还原酶抑制剂药物中的应用。技术方案：本发明的黑果荚蒾提取物中的多酚类物质含量不低于50％。其中，所述黑果荚蒾提取物的提取原材料为成熟期的黑果荚蒾果实，该生长期的黑果荚蒾果实，果皮皮层松软易破碎，果实中多酚类物质丰富，可以提高提取物中多酚类物质的有效含量。本发明还公开了所述黑果荚蒾提取物的制备方法，该制备方法包含以下步骤：(1)粗提取物的制备；(2)浸膏一的制备：将步骤(1)所得粗提取物先用石油醚、环己烷或正己烷提取，再用甲醇或乙醇提取，然后浓缩；(3)浸膏二的制备：将步骤(2)所得浸膏一经树脂一处理，然后浓缩；(4)总多酚提取物的制备：将步骤(3)所得浸膏二经树脂二处理，然后浓缩。其中，步骤(1)中所述粗提取物的制备方法为将黑果荚蒾果实去核后，以体积分数50％～95％的乙醇-水提取2-4次，料液比为1g：4ml～1g：12ml，然后浓缩；步骤(2)中所述各次提取的提取次数分别为2-4次，所述粗提取物与各提取溶剂的用量比分别为1g：3ml～1g：15ml；步骤(3)中所述浸膏二的制备方法为将步骤(2)所得浸膏一经hpd-100、xda-1或lsa-7大孔树脂处理，以体积分数为5％～90％的乙醇-水进行梯度洗脱，然后收集体积分数20％～60％的乙醇-水洗脱物，最后浓缩；步骤(4)中所述总多酚提取物的制备方法为将步骤(3)所得浸膏二经100-200目聚酰胺树脂处理，以体积分数为10％～90％的甲醇-水进行梯度洗脱，然后收集体积分数30％～60％的甲醇-水洗脱物，最后浓缩，得到所述总多酚提取物。本发明的提取方法通过多步骤的提取与除杂，从黑果荚蒾果实的复杂天然产物类型中，快速准确地提取多酚类物质。将大孔树脂柱色谱法及聚酰胺柱色谱法的优势相结合，能够有效地富集黑果荚蒾果实中的多酚类物质，且获得最大收率。制备方法简便，且易于连续操作以及工艺放大，所用试剂低毒、环保，具有用于工业化提取黑果荚蒾果实中多酚类物质的潜力。本发明最后公开了所述黑果荚蒾提取物在制备醛糖还原酶抑制剂药物中的应用。以该黑果荚蒾提取物制备的醛糖还原酶抑制剂药物可预防和/或缓解糖尿病并发症，包括糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变、糖尿病神经系统病变等。有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：(1)黑果荚蒾提取物中多酚物质含量高达50％～56％，ic50值为0.0232～0.0255mg/ml，达到微克级别；当黑果荚蒾提取物浓度在0.03mg/ml附近时，其对醛糖还原酶抑制率大于60％，当黑果荚蒾提取物浓度接近0.09mg/ml时，其对醛糖还原酶抑制率大于80％，不同规模批次提取物的抑制作用稳定，具有较强的醛糖还原酶抑制剂活性，可制备为预防和/或缓解糖尿病并发症的药物；(2)制备方法可以对多酚物质进行有效提取，提取物中总多酚含量高达50％～56％，工艺稳定、简便易行，易于连续操作以及工艺放大，所用试剂低毒、环保。附图说明图1为本发明的黑果荚蒾提取物采用folin-ciocalteu法测定总多酚含量的标准曲线；图2为本发明的黑果荚蒾提取物的醛糖还原酶抑制活性曲线。具体实施方式下面结合实施例和附图对本发明的技术方案作进一步说明。实验设备：旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司，中国)，紫外分光光度计(varian，美国)；实验材料：聚酰胺(100-200目，中国医药集团有限公司，中国)，hpd-100、xda-1、lsa-7大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司和上海谱振生物科技有限公司，中国)；所用试剂和酶：d,l-甘油醛、nadph等均购自国药集团化学试剂有限公司；醛糖还原酶来自大鼠晶状体。实施例11、黑果荚蒾粗提取物的制备取9月下旬的去核后的黑果荚蒾果实50g，用体积分数50％的乙醇-水热回流提取3次，每次2小时，料液比(g：ml)为1：8；合并提取液，减压蒸馏浓缩得粗提取物。2、黑果荚蒾浸膏一的制备用质量体积比(g：ml)为1：7的石油醚对步骤1中的粗提取物分别进行回流提取，总共3次，再用质量体积比(g：ml)为1：7的甲醇回流提取，共3次，甲醇提取液经减压浓缩后得到浸膏一。3、黑果荚蒾总多酚提取物的制备将步骤2中的浸膏一分别用水溶解后，经过大孔树脂hpd-100色谱柱，用20％-60％的乙醇-水依次进行梯度洗脱，收集30％至50％的乙醇-水混合溶液洗脱物，减压蒸馏去除溶剂后得浸膏二。将水溶解后的浸膏二经过100-200目聚酰胺色谱柱，依次用10％-90％的甲醇-水溶剂进行梯度洗脱，收集30％至60％甲醇-水溶液混合洗脱物，减压浓缩后得到黑果荚蒾的总多酚提取物。实施例21、黑果荚蒾粗提取物的制备取10月上旬的去核后的黑果荚蒾果实100g，用体积分数70％的乙醇-水热回流提取4次，每次2小时，料液比(g：ml)为1：4；合并提取液，减压蒸馏浓缩得粗提取物。2、黑果荚蒾浸膏一的制备用质量体积比(g：ml)为1：3的环己烷对步骤1中的粗提取物分别进行回流提取，总共4次，再用质量体积比(g：ml)为1：3的乙醇回流提取，共4次，乙醇提取液经减压浓缩后得到浸膏一。3、黑果荚蒾总多酚提取物的制备将步骤2中的浸膏一分别用水溶解后，经过大孔树脂xda-1色谱柱，用5％-90％的乙醇-水依次进行梯度洗脱，收集20％至60％的乙醇-水混合溶液洗脱物，减压蒸馏去除溶剂后得浸膏二。将水溶解后的浸膏二经过100-200目聚酰胺色谱柱，依次用10％-90％的甲醇-水溶剂进行梯度洗脱，收集30％至60％甲醇-水溶液混合洗脱物，减压浓缩后得到黑果荚蒾的总多酚提取物。实施例31、黑果荚蒾粗提取物的制备取10月中旬的去核后的黑果荚蒾果实200g，用体积分数95％的乙醇-水热回流提取2次，每次2小时，料液比(g：ml)为1：12；合并提取液，减压蒸馏浓缩得粗提取物。2、黑果荚蒾浸膏一的制备用质量体积比(g：ml)为1：15的正己烷对步骤1中的粗提取物分别进行回流提取，总共2次，再用质量体积比(g：ml)为1：15的乙醇回流提取，共2次，乙醇提取液经减压浓缩后得到浸膏一。3、黑果荚蒾总多酚提取物的制备将步骤2中的浸膏一分别用水溶解后，经过大孔树脂lsa-7色谱柱，用5％-90％的乙醇-水依次进行梯度洗脱，收集20％至60％的乙醇-水混合溶液洗脱物，减压蒸馏去除溶剂后得浸膏二。将水溶解后的浸膏二经过100-200目聚酰胺色谱柱，依次用10％-90％的甲醇-水溶剂进行梯度洗脱，收集30％至60％甲醇-水溶液混合洗脱物，减压浓缩后得到黑果荚蒾的总多酚提取物。对比例1与实施例1的区别在于：将黑果荚蒾粗提取物直接经100-200目聚酰胺色谱柱处理。对比例21、黑果荚蒾粗提取物的制备取10月上旬的去核后的黑果荚蒾果实100g，用体积分数30％的乙醇-水热回流提取6次，每次2小时，料液比(g：ml)为1：20；合并提取液，减压蒸馏浓缩得粗提取物。2、黑果荚蒾浸膏一的制备用质量体积比(g：ml)为1：30的环己烷对步骤1中的粗提取物分别进行回流提取，总共6次，再用质量体积比(g：ml)为1：30的乙醇回流提取，共6次，乙醇提取液经减压浓缩后得到浸膏一。3、黑果荚蒾总多酚提取物的制备将步骤2中的浸膏一分别用水溶解后，经过大孔树脂xda-1色谱柱，用5％-95％的乙醇-水依次进行梯度洗脱，收集10％至70％的乙醇-水混合溶液洗脱物，减压蒸馏去除溶剂后得浸膏二。将水溶解后的浸膏二经过100-200目聚酰胺色谱柱，依次用5％-95％的甲醇-水溶剂进行梯度洗脱，收集20％至70％甲醇-水溶液混合洗脱物，减压浓缩后得到黑果荚蒾的总多酚提取物。对比例31、黑果荚蒾粗提取物的制备取10月中旬的去核后的黑果荚蒾果实200g，用无水乙醇热回流提取1次，每次2小时，料液比(g：ml)为1：2；合并提取液，减压蒸馏浓缩得粗提取物。2、黑果荚蒾浸膏一的制备用质量体积比(g：ml)为1：1的正己烷对步骤1中的粗提取物分别进行回流提取，总共1次，再用质量体积比(g：ml)为1：1的乙醇回流提取，共1次，乙醇提取液经减压浓缩后得到浸膏一。3、黑果荚蒾总多酚提取物的制备将步骤2中的浸膏一分别用水溶解后，经过大孔树脂lsa-7色谱柱，用0％-100％的乙醇-水依次进行梯度洗脱，收集5％至80％的乙醇-水混合溶液洗脱物，减压蒸馏去除溶剂后得浸膏二。将水溶解后的浸膏二经过100-200目聚酰胺色谱柱，依次用0％-100％的甲醇-水溶剂进行梯度洗脱，收集10％至80％甲醇-水溶液混合洗脱物，减压浓缩后得到黑果荚蒾的总多酚提取物。实施例4：folin-ciocalteu法测定黑果荚蒾提取物的总多酚含量标准溶液的配制：精密称取对照品没食子酸5mg于100ml量瓶中，加水溶解，得0.05mg/ml的标准溶液。folin-ciocalteu试剂的配制：称取钨酸钠10g，钼酸钠215g，加蒸馏水70ml，磷酸5ml和浓盐酸10ml，置于250ml圆底烧瓶中，混匀，加热回流2h，加入硫酸锂15g，蒸馏水5ml和溴滴定液1滴，加热煮沸至溴水挥发尽，冷却，定容至100ml，过滤，置于棕色瓶中保存备用。临用前取储备液2ml，加水稀释至10ml，摇匀，即得。标准曲线的绘制：分别量取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml标准溶液于10ml量瓶中，加入福林酚试剂0.5ml，20％na2co3溶液1.5ml，加水定容至刻度线，摇匀，在75℃水浴放置10分钟，冷却至室温，于波长765nm处测定吸光值。以没食子酸浓度为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。通过线性回归分析，得回归方程y＝14.631x-0.0086，r2＝0.9991。黑果荚蒾提取物多酚含量的测定：分别量取实施例1-3和对比例1-3制备的黑果荚蒾多酚提取物1ml于100ml量瓶中，定容至刻度；移取1ml稀释的黑果荚蒾多酚提取液于10ml量瓶中，加入福林酚试剂0.5ml，20％na2co3溶液1.5ml，加水定容至刻度线，摇匀，在75℃水浴放置10分钟，冷却至室温，于波长765nm处测定吸光值。重复测定三次，根据标准曲线，计算黑果荚蒾提取物中总多酚的含量，结果见表1。表1黑果荚蒾提取物多酚含量组别多酚含量(％)组别多酚含量(％)实施例150.46％±1.23％对比例135.71％±1.04％实施例255.27％±0.91％对比例240.25％±1.25％实施例352.98％±1.08％对比例342.91％±1.13％由表1可见，与对比例1-3制备的黑果荚蒾提取物相比，采用本申请的制备方法制得黑果荚蒾提取物中多酚含量为50.46％～55.27％，不同规模批次提取物之间多酚含量稳定，说明本申请的制备方法可以对多酚物质进行有效提取，产物收率高，工艺稳定、简便易行。实施例5：黑果荚蒾总多酚的醛糖还原酶抑制活性测试醛糖还原酶的制备：大鼠脱臼处死后立即摘除晶状体(冰上操作)，以3倍体积0-4℃的去离子水匀浆，12000rpm低温离心30min，取上清，即为醛糖还原酶的水溶液。磷酸盐缓冲液(pbs)的制备：准确称量na2hpo4·12h2o3.58g，蒸馏水溶解后在100ml量瓶中定容得a液；准确称量na2hpo4·2h2o1.56g，蒸馏水溶解后在100ml的量瓶中定容得b液；将a、b液混合，调节ph至6.2，于4℃保存备用。nadph溶液的制备：准确称量nadph4.5mg，加入20mlpbs缓冲液，充分溶解，配成0.3mmnadph溶液，现配现用；d,l-甘油醛溶液的制备：准确称量d,l-甘油醛粉末2mg，加入2.2mlpbs缓冲液，充分溶解，配成10mmd,l-甘油醛溶液，避光保存备用；硫酸锂-β-巯基乙醇溶液的制备：称取306mg硫酸锂与4.9μlβ-巯基乙醇混合，溶于7mlpbs中，充分振荡，摇匀，即得0.4m硫酸锂-0.1mβ-巯基乙醇溶液。酶反应体系：反应总体积为200μl，将醛糖还原酶溶液30μl，1.25mmd,l-甘油醛溶液30μl，0.4m硫酸锂和0.1mβ-巯基乙醇溶液20μl，黑果荚蒾总多酚提取液30μl，0.1mph＝6.2磷酸缓冲液40μl充分混合，置酶标仪中37℃孵育10min，再加入0.3mmnadph溶液50μl，震荡10s后于340nm波长处测定od值；间隔30s记录一次，连续记录6min。实验设空白对照组、阳性对照组(槲皮素)，样品均平行测定三次。根据酶反应实验结果，以黑果荚蒾总多酚提取物浓度为横坐标，抑制率为纵坐标，绘制抑制曲线，求出其ic50值。抑制率计算公式：inhibition％＝[1-(od2-od0)/(od1-od0)]×100％，其中，od0为空白对照组；od1为不加样品的对照溶液吸光值；od2为加有不同浓度待测样品溶液的吸光值，结果见表2及图2。表2黑果荚蒾总多酚的醛糖还原酶抑制活性组别ic50(mg/ml)实施例10.0255±0.0013实施例20.0232±0.0011实施例30.0249±0.0007由表2可见，本申请的黑果荚蒾提取物ic50值为0.0232～0.0255mg/ml，达到微克级别；由图2可见，当黑果荚蒾提取物浓度在0.03mg/ml附近时，其对醛糖还原酶抑制率大于60％，当黑果荚蒾提取物浓度接近0.09mg/ml时，其对醛糖还原酶抑制率大于80％，不同规模批次提取物的抑制作用稳定，说明本申请的黑果荚蒾提取物可以有效抑制醛糖还原酶活性，可制备为预防和/或缓解糖尿病并发症的药物。当前第1页1 2 3 

起点商标作为专业知识产权交易平台，可以帮助大家解决很多问题，如果大家想要了解更多知产交易信息请点击 【在线咨询】或添加微信 【19522093243】与客服一对一沟通，为大家解决相关问题。

此文章来源于网络,如有侵权,请联系删除