红景天苷在制备防治冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病的药物中的应用的制作方法

本发明属于生物医药领域，具体涉及红景天苷在制备防治冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病的药物中的应用。

背景技术：

冠状动脉硬化性心脏病，多发40岁以上的成人，男性发病早于女性，经济发达国家发病率较高；近年来发病呈年经化趋势,已成为威胁人类健康的主要疾病之一。持续而严重的缺血、缺氧可引起心脏坏死即为心肌梗死(myocardialinfarction，mi)。由于治疗费用高昂，对患者、家庭都带来沉重的经济负担，阻碍了社会的进步和发展。介入治疗及冠状动脉旁路移植术技术的普及，虽然能够缓解急性期的最初心肌损害，但是，冠状动脉的骤然开通与血流恢复，血管超微结构、内皮细胞功能异常,反而会加重了心脏的缺血损伤,使病情加重恶化,称缺血再灌注损伤(iri)。冠脉内皮在心肌缺血再灌注的过程中，也会因为遭受损伤而出现功能障碍，进一步恶化病情。因此，如何防治由缺血再灌注导致的冠脉内皮功能障碍具有非常重要的意义。

冠脉内皮细胞(coronaryarteryendothelialcells,caecs)对维持冠脉血管稳态起关键作用，caecs调节冠脉的舒缩功能有赖于一氧化氮(nitricmonoxide,no)信息系统。在生理条件下，内皮型一氧化氮合酶(endothelialnosynthase,enos)是血管系统的no主要来源。已有大量基础及临床资料表明，在病理状态下，enos出现功能障碍可导致no的生物利用度降低及氧化应激加重。在心肌缺血再灌注的过程中所产生过多的活性氧(reactiveoxygenspecies,ros)在体内或细胞内蓄积，ros能与no结合生成氧化性更强的过氧亚硝基阴离子(onoo^-)，从而促进enos解偶联。大量研究表明，no水平降低和ros水平升高是导致内皮依赖性血管舒张功能障碍的主要病理机制。另外，enos来源的no还具有保护内皮细胞抵抗凋亡的作用。因此，逆转enos解偶联是改善缺血再灌注所致冠脉内皮功能障碍的关键环节。

红景天苷是藏药红景天中的重要有效成分，研究表明红景天苷可能通过促进no合成、抗氧化、促进血管新生、降血脂等从而起到抗动脉粥样硬化作用。现有技术中提到红景天苷具有体内抗高血压作用(cn103463115a)，能够制备治疗糖尿病足的药物(cn105535001a)和雌激素受体抑制剂(cn106581018a)，且具有预防和/或治疗冠状动脉微血管病变功效(cn110613722a)，但至今尚未发现红景天及其有效成分用于制备防治冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病的药物的报道。

技术实现要素：

为解决上述现有技术中存在的问题，本发明提供红景天苷在制备防治冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病的医药制品中的应用，所述红景天苷可显著清除冠脉内皮细胞的氧自由基、上调抗氧化系统的活性、促进自噬及抑制细胞凋亡改善缺氧/复氧导致的冠脉内皮功能障碍，能够保护冠状动脉内皮细胞，减缓冠状动脉内皮损伤相关心血管疾病症状。

为实现上述目的，本发明提供红景天苷在制备防治心血管疾病的医药制品中的应用，所述的心血管疾病是冠状动脉内皮细胞损伤所致。

优选的，所述心血管疾病是动脉粥样硬化、冠心病、心肌病、心律失常和心力衰竭中的一种或多种。

优选的，所述的冠状动脉内皮细胞损伤为缺氧复氧所致损伤。

优选的，所述的冠状动脉内皮细胞为人冠状动脉内皮细胞。

优选的，所述的医药制品包括药物、保健品、功能食品、特殊医疗用途食品、医疗器械或其他生物制品。

优选的，所述的药物为红景天苷加入一种或多种载体制成。

优选的，将所述药物制成医药领域中所接受的任一种剂型。

优选的，所述载体选自稀释剂、赋形剂、填充剂、崩解剂、湿润剂、粘合剂、表面活性剂、吸收促进剂、润滑剂、球囊、支架中的至少一种。

优选的，所述剂型包括注射液、注射用冻干粉针剂、气雾剂、大输液、涂层、丸剂、颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、口服液或乳剂。

本发明还提供一种药物组合物在制备预防和/或治疗冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病的药物中的应用，所述药物组合物的有效成分包括红景天苷，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。

本发明具有以下技术效果：本发明所述红景天苷在浓度为60μm时可显著清除冠脉内皮细胞的氧自由基、上调抗氧化系统的活性、促进自噬及抑制细胞凋亡改善缺氧/复氧导致的冠脉内皮功能障，说明了红景天苷能够保护冠状动脉内皮细胞，降低冠状动脉内皮损伤相关心血管疾病。本发明提供了红景天苷的一种新的应用途径，为冠状动脉内皮细胞损伤所致心血管疾病提供一种新的药物选择。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为红景天苷对冠状动脉内皮细胞缺氧复氧损伤干预的结果示意图；

图2为红景天苷降低冠状动脉内皮细胞死亡率结果示意图；

图3为红景天苷上调缺氧复氧损伤冠状动脉内皮细胞抗氧化系统的活性结果示意图；图中a为不同组丙二醛含量，b为不同组总谷胱甘肽含量，c为不同组水溶性维生素e等效抗氧化能力，d为不同组过氧化氢酶活力，e为不同组超氧化物歧化酶活力；

图4为红景天苷减弱对缺氧复氧损伤诱导的冠状动脉内皮细胞凋亡结果示意图；图中a为不同组中细胞凋亡率，b为不同组中tunel阳性率。c为不同组中p53/β-actin比值(单位，％)，d为不同组中cyt-c/α-tubulin比值(单位，％)，e为不同组中c-caspase-9/α-tubulin，f为不同组中c-caspase-3/β-tubulin，g为不同组中caspase-9/αtubulin，h为不同组中caspase-3/α-tubulin。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。对于本发明中的数值范围，应理解为公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

以下实施例采用单因素方差分析统计方法对实验数据进行评价。选择p值0.05作为统计显著性水平，数据分别用(*)表示p<0.05，(**)表示p<0.01，(***)表示p<0.001。

实施例1

红景天苷对冠状动脉内皮细胞缺氧复氧损伤干预作用

一、实验材料

1.实验动物：人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)购买于美国sciencell公司。

2.主要试剂：红景天苷(sal，美国sigma公司)。

3.主要实验仪器：生物安全柜(美国赛默飞世尔科技有限公司)，三气细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)，olympus激光扫描共聚焦显微镜(日本olympus公司)，epoch酶标仪(德国基因有限公司)，高速低温台式离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，电子天平(中国赛多利斯科学仪器有限公司)。

二、实验方法

1.hcaecs细胞的培养

(1)用ecm培养基进行培养，待细胞生长至融合度达80％-90％，进行传代。

(2)沿一侧倒掉培养瓶中的旧培养基，加入3ml无菌pbs，轻晃瓶身冲洗细胞,倒掉洗液,重复1次；

(3)加入3ml0.25％的胰酶(提前于37℃水浴箱中预热)，显微镜下观察，待80％细胞形态变圆时，加入6ml新鲜ecm完全培养基以终止消化；

(4)用巴氏吸管轻柔吹打培养瓶底，使细胞脱壁，将吹打后的悬液收集到15mlep管中，置离心机1000g离心5min，去上清，加入新鲜的ecm完全培养基将细胞重悬，按1：5比例进行传代，置于37℃，5％co2培养箱中培养，次日更换ecm培养基，以后每3日更换ecm培养基；

(5)选取长势良好的p3～p5代hcaecs细胞用于后续实验。

2.hcaecs缺氧/复氧(h/r)损伤模型构建

(1)实验分为10组：nc组，h/r组，sal5μm+h/r组，sal10μm+h/r组，sal20μm+h/r组，sal40μm+h/r组，sal60μm+h/r组，sal80μm+h/r组，sal100μm+h/r组，sal200μm+h/r组，每组6个复孔；

(2)选取长势良好的p3～p5代hcaecs细胞，按上述分组接种于细胞培养皿内置于37℃，5％co2的培养箱中；

(3)当细胞融合度达80％～90％时，吸掉旧培养基，每皿用pbs洗1遍，用低糖dmem同步化12小时～16小时后，用pbs洗掉dmem，换成无糖dmem，除nc组常氧孵育外，其余各组置于1％低氧箱孵育2小时，从低氧箱中取出96孔板，在sal+h/r组中分别加入上述相应浓度的红景天苷，置于21％常氧箱复氧4小时。

3.细胞活性检测

(1)实验分为10组：nc组，h/r组，sal5μm+h/r组，sal10μm+h/r组，sal20μm+h/r组，sal40μm+h/r组，sal60μm+h/r组，sal80μm+h/r组，sal100μm+h/r组，sal200μm+h/r组，每组6个复孔；

(2)选取长势良好的p3～p5代hcaecs，消化后均匀接种于96孔板内，将96孔板置于37℃，5％co2的培养箱中孵育24h；

(3)待细胞贴壁后，分组按建的缺氧复氧模型处理细胞；

(4)取出处理好的细胞，用移液枪吸掉旧培养基，每孔用巴氏管pbs洗3次(每孔2～3滴)，每孔加入100μl配制好的cck-8溶液(低糖dmem：cck-8＝1:9)，注意避光操作，将细胞置于培养箱中37℃孵育2h；

(5)用酶标仪在450nm测定吸光度。

三、实验结果

在hcaecs缺氧复氧损伤过程中，在复氧时使用的不同浓度的红景天苷与hcaecs干预2h，cck-8结果显示(图1)，缺氧复氧能使hcaecs活细胞数明显减少，与h/r组相比，经红景天苷干预5μm组、10μm组、20μm组、40μm组及200μm组细胞活性(7.35％±0.66，n＝4)vs(6.73％±1.22，n＝4)vs(7.03％±0.81，n＝4)vs(8.125％±0.46，n＝4)vs(6.90％±1.20，n＝4)，均不具统计学意义，60μm和100μmsal组细胞活力显著上调(11.08％±0.95，n＝4)vs(9.60％±1.24，n＝4)，且60μm和100μm(p<0.05)之间具有显著差异，细胞活力最高，因此以60μm终浓度实验效果最显著。

四、结论：

红景天苷可显著降低冠状动脉内皮细胞的缺氧/复氧损伤，改善细胞活性等指标，说明红景天苷对冠状动脉内皮结构具有重要的保护作用，从而对其所致心血管病变具有防治作用。

实施例2

红景天苷降低冠状动脉内皮细胞死亡率

一、实验材料

1.实验动物：人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)购买于美国sciencell公司。

2.主要试剂：红景天苷(sal，美国sigma公司)。

3.主要实验仪器：生物安全柜(美国赛默飞世尔科技有限公司)，三气细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)，olympus激光扫描共聚焦显微镜(日本olympus公司)，epoch酶标仪(德国基因有限公司)，高速低温台式离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，电子天平(中国赛多利斯科学仪器有限公司)。

二、实验方法

1.乳酸脱氢酶(ldh)细胞毒性检测

(1)预先按需要配好ldh检测工作液和1×ldh释放试剂；

(2)选择sal最适浓度为60μm，按实施例一所述的损伤模型构建方法处理细胞，从培养箱取出处理好细胞，吸取120μl上清液到一个新的96孔板中，各孔加入60μlldh检测工作液，混匀，室温避光孵育30min，然后在490nm处测定吸光度；

(3)将原96孔板用多孔板离心机400g,4℃离心5min，弃上清，每孔加pbs200μl洗涤细胞后，再次用多孔板离心机400g，4℃离心5min，弃洗液；

(4)每孔加入1×ldh释放试剂200μl，适当摇晃培养板混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育1小时，分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，同样在各孔分别加入60μlldh配好的检测工作液，混匀，室温孵育30min(注意避光)，于490nm处测定吸光度；

(5)计算细胞死亡率(％)＝(处理样品的吸光度－样品对照的孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔的吸光度)×100。

三、实验结果

ldh结果(图2)显示：经h/r处理后，细胞死亡率明显升高，(24.60％±2.68，n＝4)vs(44.64％±6.51，n＝4)，红景天苷干预明显降低其死亡率，(44.64％±6.51，n＝4)vs(21.53％±8.08，n＝4)，具有统计学意义。

四、实验结论

红景天苷可显著降低缺氧/复氧所致的冠状动脉内皮细胞死亡率，表明红景天苷能有效保护冠状动脉内皮细胞，提高细胞活性，对冠状动脉细胞坏死相关心血管疾病具有潜在的药理功效。

实施例3

红景天苷上调缺氧复氧损伤冠状动脉内皮细胞抗氧化系统的活性

一、实验材料

1.实验动物：人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)购买于美国sciencell公司。

2.主要试剂：红景天苷(sal，美国sigma公司)。

3.主要实验仪器：生物安全柜(美国赛默飞世尔科技有限公司)，三气细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)，olympus激光扫描共聚焦显微镜(日本olympus公司)，epoch酶标仪(德国基因有限公司)，高速低温台式离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，电子天平(中国赛多利斯科学仪器有限公司)。

二、实验方法

1.ros与o²·^-水平检测

(1)选择sal最适浓度为60μm，按实施例一所述的损伤模型构建方法处理细胞，处理后加入浓度为10μm的ros或o²·^-探针100μl；

(2)于37℃孵育细胞或组织切片30min，pbs漂洗3次；

(3)用荧光酶标仪或荧光显微镜检测样品的荧光强度。

2.h2o2、gsh浓度，sod、gpx、cat、teac活性检测：

(1)将处理好的细胞，每组收集约100万个细胞至离心管，并用超声波破碎裂解细胞，

(2)将裂解好的细胞于4℃，12,000g离心5min，取上清至新的离心管中；

(3)按照碧云天检测试剂盒所提供的步骤分别检测h2o2、gsh、sod、gpx、teac和cat浓度或活性。

三、实验结果

1.红景天苷上调h/r后hcaecs的抗氧化系统的活性

为证明红景天苷具有抑制hcaecs氧化应激的作用，用比色法检测细胞的h2o2含量，抗氧化系统包括超氧化物歧化酶(sod)、总谷胱甘肽(gsh)、谷胱甘肽过氧化物酶(gpx)和过氧化氢酶(cat)的活性。结果显示(图3)，h/r组与sal组相比，sod(73.50±3.58，n＝3)vs(121.41±12.25，n＝3)，明显增加；cat(1.51±1.33，n＝4)vs(5.08±0.69，n＝4)，明显增加；gsh(0.57±0.31，n＝3)vs(1.55±0.33，n＝3)，明显增加；teac(29.19±3.45，n＝3)vs(47.50±8.00，n＝3)明显增加。mda(7.88±1.47，n＝3)vs(3.28±1.27，n＝3)，明显降低。

四、实验结论

红景天苷可清除缺氧/复氧导致的冠状动脉细胞氧自由基损伤，上调其抗氧化系统的活性，表明红景天苷对冠状动脉内皮细胞氧化损伤相关心血管疾病具有潜在作用。

实施例4

一、实验材料

1.实验动物：人冠状动脉内皮细胞(hcaecs)购买于美国sciencell公司。

2.主要试剂：红景天苷(sal，美国sigma公司)。

3.主要实验仪器：生物安全柜(美国赛默飞世尔科技有限公司)，三气细胞培养箱(美国赛默飞世尔科技有限公司)，olympus激光扫描共聚焦显微镜(日本olympus公司)，epoch酶标仪(德国基因有限公司)，高速低温台式离心机(美国赛默飞世尔科技有限公司)，电子天平(中国赛多利斯科学仪器有限公司)。

二、实验方法

1.tunel检测细胞凋亡

(1)固定：选择sal最适浓度为60μm，按实施例一所述的损伤模型构建方法处理细胞，取出处理好的细胞，倒掉培养基，用巴氏管每皿加入1mlpbs洗涤细胞2次，弃洗液，每皿加入免疫荧光固定液300μl，室温固定30min，弃固定液，用pbs于摇床中缓慢摇洗3次，5min/次，以去除固定液；

(2)通透：弃洗液，每皿加入0.1％triton-100-x200μl，于室温静置通透30min，弃通透液，用pbs于摇床中缓慢摇洗3次，5min/次，以去除通透液；

(3)孵育：弃通透液，预先将荧光素标记的dutp及末端转移酶按9：1比例配置混合，每皿加入50μltunel混合液，置于湿盒中，在37℃条件下避光孵育1h，弃tunel混合液，用pbs于摇床中避光缓慢摇洗3次；

(4)dapi染色：弃洗液，每皿加入1μg/ml的dapi100μl，室温避光孵育10min，弃dapi，加入pbs(1ml/皿)于脱色摇床中洗3次，每次5min；

(5)弃洗液，加入适量抗荧光淬灭剂，于共聚焦显微镜上机，每皿细胞在20倍镜下随机选取6个视野进行计数。

2.蛋白免疫印迹(wb)

(1)配制sds-page胶：分别配制10％分离胶及5％浓缩胶，分离胶的浓度配制可随目的蛋白分子量范围调整。

(2)灌注分离胶：将配制好的分离胶用巴氏管沿玻璃板壁边缘匀速加入长短玻璃板夹层中，高度至少大于插入梳子的长度，再蒸馏水至玻璃板上缘用于压胶。室温静置20min～30min，待分离胶与蒸馏水交界处可以看见明显折光线处后，沿一侧倾倒上层的蒸馏水，用滤纸沿一侧吸干,放平玻璃板架，加入配制好的浓缩胶，将梳子缓缓插入浓缩胶中，静置30min，待分离胶与纯水交界处线出现后，小心沿一侧倾倒上层的纯水，放平玻璃板架，用移液枪加入配制好的浓缩胶，并小心插入梳子插入其中，注意尽量避免梳孔进入气泡,静置30min后，确认浓缩胶凝固。将带配好胶的玻璃板装入电泳架，再将电泳架放入电泳槽中，小心拔出梳子，在电泳架内外均倒满新配制的1×电泳缓冲液(先内后外)。取出准备好的蛋白样品，用移液枪依次在泳道孔底部加样，根据实验需要上样量10ug～20μg，蛋白marker上样量3μl～5μl。

(3)蛋白电泳：开始以60v电压进行恒压电泳，待样品跑过浓缩胶，且marker分离出多色条带时，再转恒压至90v，待目的蛋白充分电泳至分离胶底部时即可停止电泳。

(4)转膜：将pvdf膜剪裁成与电泳完成的分离胶块相仿大小，使用前约1min用甲醇浸泡活化。将分离胶、滤纸、pvdf膜、海绵和转膜夹浸入预冷的1x转膜缓冲液中，分离胶与pvdf膜在中间,中转膜夹由内而外依次是3层滤纸，1层海绵的顺序，分离胶与转膜夹黑色的同一侧，pvdf膜与转膜夹透明的同一侧，注意将膜与胶之间的气泡排除，合上转膜夹放入转膜槽内。将足量转膜缓冲液加入转膜槽内，冰浴条件恒压90v转膜120min。

(5)封闭：转膜结束后，将pvdf膜夹出，用tbst轻轻冲掉转膜液，将pvdf膜放入5％封闭液中，于摇床室温慢摇1h，然用再用tbst冲掉表面封闭液。

(6)一抗孵育：根据目的蛋白分子量裁剪好条带,分别置入已准备好一抗的孵育槽中，于4℃冰箱的摇床中慢摇16小时，然后回收一抗，向孵育槽加入tbst，用摇床摇洗5min×5次。

(7)二抗孵育：将洗好的条带移至已配制好的二抗孵育盒中，将孵育盒置于摇床上室温慢摇1h，随后用tbst在摇床摇洗5min×5次。

(8)曝光：按a液：b液＝1：1的比例配置ecl化学发光液，于c600上机进行曝光处理。使用imagej软件检测目的条带灰度值/内参条带灰度值，将所得灰度值用于统计分析。

三、实验结果

1.红景天苷减弱对h/r诱导的hcaecs凋亡

我们采用wb以及tunel等四种方法以验证h/r的hcaecs经红景天苷干预是否具有抗凋亡的作用。结果显示(图4)，与h/r组比较，h/r+sal组hcaecs的流式细胞早期凋亡率(6.6％±0.2566，n＝3)和凋亡相关蛋白(cleaved-caspase-3(0.63±0.0316，n＝3)、cleaved-caspase-9(0.33±0.0566，n＝3)、caspase3(0.53±0.0226，n＝3)、caspase9(0.36±0.0326，n＝3)、cyt-c(0.58±0.0336，n＝3))的表达水平下调；凋亡抑制蛋白bcl-2/bax(0.98±0.0226，n＝3)值上升、p53(0.98±0.0596，n＝3)表达上调，细胞tunel阳性率(13.25±0.3675％)则有所下降。

四、实验结论

红景天苷可显著降低缺氧/复氧所致的冠状动脉内皮细胞凋亡，表明红景天苷能有效保护冠状动脉内皮细胞，促进细胞增殖，对冠状动脉细胞坏死相关心血管疾病具有重要意义。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

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