脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用的制作方法

本发明涉及生物制药领域，特别地，涉及一种脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用。

背景技术：

炎性肠病、1型糖尿病、系统红斑狼疮、风湿性关节炎等自身免疫疾病的发病率逐年增加，已成为全球关注的健康问题。自身免疫疾病的原因尚不清楚，但这些疾病有一个共同特征就是免疫系统出现紊乱，机体的免疫细胞将自身组织当作外源抗原，攻击并损伤自身组织，引起慢性炎症。然而，目前没有有效的治愈方法。目前常采用的免疫抑制药物、激素疗法等对自身免疫患者进行治疗，但是只能减少症状，并有严重长期的副反应。因此，急需安全有效的药物或方法治疗自身免疫性疾病。

技术实现要素：

本发明提供了一种脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用，以克服现有技术的不足，尤其是克服现有技术治疗自身免疫性疾病的药物效果不够好、副作用大的的不足，提供一种脐血血小板线粒体在制备治疗自身免疫疾病药物中的应用。

本发明要解决的另一个技术问题是，提供一种治疗自身免疫疾病的药物，其治疗效果好，副作用较小。

本发明采用的技术方案如下：

脐血血小板线粒体在制备治疗免疫性疾病药物中的应用，从脐血中分离出的血小板线粒体，用于制备治疗自身免疫疾病的药物。

进一步地，脐血血小板线粒体的使用浓度：10μg/ml～2000μg/ml。采用生理盐水溶解脐血血小板线粒体制备成液体状。给药途径采用注射。

进一步地，脐血血小板线粒体冻存于-80℃条件下。

进一步地，免疫性疾病包括炎性肠病、1型糖尿病、系统红斑狼疮、风湿性关节炎。

根据本发明的另一方面，还提供一种包括上述脐血血小板线粒体的分离方法，包括以下步骤：

s1、取脐血加至淋巴细胞分离液中，离心，离心结束后，脐血分层，吸取上清液；

s2、将步骤s1中的上清液进行离心处理，去除沉淀，收集上清液；

s3、将步骤s2中收集的上清液与生理盐水混匀，离心，去除上清液，收集沉淀的粗品血小板；

s4、采用血小板洗涤液重悬步骤s3中的血小板，混匀进行离心，再重复重悬、离心两次，去除上清液，获得脐血血小板；

s5、采用线粒体抽提试剂盒对脐血血小板进行抽提，获得脐血血小板线粒体。

进一步地，步骤s1中脐血加与淋巴细胞分离液的体积比为1∶1，离心条件为：20℃，400g～1610g，25min，开始加速度：0，结束时减速度：0。步骤s2中离心条件为：20℃，300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。

进一步地，步骤s3中上清液与生理盐水的体积相同，离心条件为：20℃，2000g～4000g，5min～20min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。步骤s4中血小板洗涤液为生理盐水，离心条件为：20℃，2000g～4000g，5min～20min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，重复洗涤2次。

本发明具有以下有益效果：

本发明之用脐血血小板线粒体制备的治疗自身免疫疾病的药物，其治疗效果好，副作用较小。脐血也有用于研究治疗自身免疫疾病，脐血中发挥作用的主要是脐血中的细胞，细胞的活性对治疗的效果影响很大，脐血细胞一般为液氮保存，使用前需要对细胞进行复苏，而细胞常规的冻存和复苏对细胞的活性影响较大。因此，脐血具有保存成本高，保存方法繁琐，且脐血对自身免疫疾病的治疗效果并不明显。而脐血血小板线粒体体积小，常规冻存管就能存储大量的线粒体。脐血血小板线粒体易于保存，并具备线粒体的功能稳定等特点，在-80℃条件下保存可保证稳定的性能。通过体内、体外实验测试，其结果表明脐血血小板线粒体对自身免疫疾病的治疗效果明显。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将参照附图，对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

构成本申请的一部分的附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1为未处理对照组的pbmc的克隆图；

图2为脐血血小板线粒体对pbmc的克隆形成抑制作用图；

图3为未处理对照组的pbmc的克隆图；

图4是脐血血小板线粒体对pbmc增殖的抑制作用图；

图5为脐血血小板线粒体对pbmc分泌的促炎因子il-5表达的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图6为脐血血小板线粒体对pbmc分泌的促炎因子il-6表达的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图7为脐血血小板线粒体对pbmc分泌的促炎因子il-17f表达的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图8为脐血血小板线粒体对pbmc分泌的抑炎因子il-10表达的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图9为脐血血小板线粒体对pbmc分泌的抑炎因子il-4表达的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图10为脐血血小板线粒体对炎性肠病小鼠体重的影响图；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图11为脐血血小板线粒体对炎性肠病小鼠腹泻次数的影响图；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图12：脐血血小板线粒体对糖尿病小鼠血糖水平的影响；(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

图13：脐血血小板线粒体对糖尿病小鼠发病率的影响。(其中，对照组为未处理组，线粒体处理组为脐血血小板线粒体处理组)

具体实施方式

需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。

实施例

以下除特殊限定之外，其他试剂和仪器均为市售。

实施例1

脐血血小板线粒体的制备和保存

s1、取20ml脐血缓慢加至淋巴细胞分离液中(脐血体积∶淋巴细胞分离液体积＝1∶1)，离心，离心条件：20℃，400g～1610g，25min，开始加速度：0，结束时减速度：0。离心结束后，脐血分层，吸取外周血单个核细胞层(pbmc)上面的上清液，动作缓慢轻柔，尽可能不要吸到pbmc。上述离心的开始加速度：0，结束时减速度：0。只有在加速度0和减速度0时，才能将pbmc分离出来，又称作白膜层，如果有加速度或减速度白膜层细胞会被离心至试管底部，造成分离失败，而无法获得pbmc细胞，从而获得pbmc细胞又可以获得上清中的血小板。

s2、将步骤s1收集的上清液，离心，离心条件：20℃，300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，去除沉淀，收集上清液。

s3、将步骤s2收集的上清液转至新的50ml离心管中，加入与上清液等体积的生理盐水，混匀离心，离心条件：20℃，2000g～4000g，5min～20min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，去除上清液，收集沉淀的粗品血小板。

s4、采用生理盐水(或血小板洗涤液)重悬(即洗涤)粗品血小板，混匀离心，再重复重悬、离心两次，去除上清液，获得脐血血小板。

s5、采用线粒体抽提试剂盒(mitochondriaisolationkitforculturedcells，thermoscientific，rockford，usa，prod:89874)对血小板的线粒体进行抽提，线粒体抽提试剂盒包括线粒体分离试剂a、线粒体分离试剂b和线粒体分离试剂c，具体操作步骤如下所示：

(1)在2ml的离心管里，每25ml脐带血分离的血小板加入800μl线粒体分离试剂a，震荡5秒混匀血小板，冰上静置2min；

(2)离心管中加10μl线粒体分离试剂b，震荡5秒混匀，冰上静置5min的过程中，每隔1min高速震荡5秒；

(3)离心管中加入800μl线粒体分离试剂c，颠倒4次混匀溶液(不要剧烈震荡)；

(4)进行离心处理，离心条件：4℃，700g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9；

(5)将步骤(4)离心管中的上清液转至新的2ml离心管，离心，离心条件：4℃，3000g，15min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9；

(6)去除步骤(5)离心管中的上清液，加入500μl线粒体分离试剂c至管底的线粒体中，吹打混匀，离心，离心条件：4℃，12000g，5min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9；

(7)去除步骤(6)离心管中的上清液，管底的沉淀为纯化的脐血血小板线粒体；

(8)分离所得脐血血小板线粒体直接冻存于-80℃冰箱中备用。

实施例2

一、外周血单个核细胞的获取

1、采集外周血5ml于肝素抗凝管中，缓慢将血加至淋巴细胞分离液中(外周血体积∶淋巴细胞分离液体积＝1∶1)，离心，离心条件：20℃，400g～1610g，25min，开始加速度：0，结束时减速度：0。离心结束后，脐血分层，用吸管吸取外周血单个核细胞(简称pbmc)层，动作缓慢轻柔，尽可能少吸取淋巴细胞液。

2、将pbmc层继续离心，离心条件：20℃，580g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。取5ml～10ml10×红细胞裂解液及45ml灭菌用水配置1×红裂液。在离心完成后，去除上清液，加入1×红裂液裂解2min～10min后，加入0.9％生理盐水至35ml定容终止红裂。离心，去除上清液，离心条件：20℃，300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。重复加入0.9％生理盐水定容、离心、去除上清液的步骤2～3次。

3、步骤2中离心完成后，去上清液，弹散细胞，加入0.9％的生理盐水，取10μl进行计数，剩余的加0.9％生理盐水至40ml定容再次离心，离心条件：20℃，300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。其中计数步骤具体为：将所取细胞液置于ep管内，取90μl台盼蓝加于ep管内混匀。取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×10⁴个/ml×稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右。

4、取外周血单个核细胞(pbmc)，1×10⁶个细胞。

5、无血清培养基1ml重悬细胞(1×10⁶个细胞)，无血清培养基lonza公司的x-vivo15w/ogentorphenolred。

6、每1ml中加入1μl的cfse工作液(celltracestocksolution)，celltrace^tmcfse细胞增殖试剂盒(celltrace^tmcfsecellproliferationkit)thermofisherscientific公司的c34554，试剂盒包含十份一次性瓶装的celltrace^tmcfse(componenta)、cfse(羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯)和1份瓶装的dmso(componentb)，dmso(二甲基亚砜)，celltracestocksolution是指按照试剂盒说明书配置的混合液，用于对细胞进行cfse染色。详见https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/c34554。

7、37℃避光孵育20min。

8、加入5ml无血清培养液。(血清培养液为lonza公司的x-vivo15w/ogentorphenolred)

9、37℃避光孵育5min。

10、离心处理，离心条件：离心20℃，300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9。

11、37℃预热的无血清培养液重悬细胞，获得cfse标记的pbmc。

二、免疫调节实验

分离的pbmc(1×10⁵)/200μlx-vivo15培养液在cd3/cd28磁珠(thermofisherscientific，磁珠数目与pbmc数目为1∶1)刺激条件下培养，获得pbmc上清液，取新鲜或者冻存的脐血血小板线粒体，配置成10μg/ml～2000μg/ml的脐血血小板线粒体溶液处理pbmc上清液，以未处理为对照组。

在37℃、5％co2条件下培养3天，显微镜下观察pbmc的克隆形成情况，采用流式检测脐血血小板的抑制功能。

检测脐血血小板线粒体处理的pbmc上清液和未处理的pbmc上清液的细胞因子表达水平，操作步骤按照试剂盒说明书进行操作(biolegend，legendplex^tmhumanthpanel(13-plex))，上述pbmc上清制备方法

流式检测结果显示，如图3和图4所示，未处理对照组的pbmc正常增殖，脐血血小板线粒体处理组的pbmc的向左移的细胞比例降低(cfse阴性细胞减少)，说明pbmc增殖能力明显减少说明脐血血小板线粒体明显抑制pbmc的增殖能力。显微镜下观察结果显示，如图1和图2所示，脐血血小板线粒体明显抑制pbmc的克隆行形成。

细胞因子表达水平检测结果显示，如图5、6和图7所示，脐血血小板线粒体处理的pbmc使得il-5、il-6和il-17f炎症因子表达明显下调，如图8和图9所示，而抑炎因子il-4和il-10抑炎因子表达明显上调。因此，说明本申请分离的脐血血小板线粒体使炎症因子下调，使抑炎因子表达上调，其抑炎效果好，而对其他区因子未见影响，说明其副作用小。

实施例3

一、分离供者小鼠脾脏细胞

1、安乐死在二氧化碳室的供体小鼠，然后进行颈脱位；用70％的乙醇喷洒腹部；

2、在腹部水平切口，剥去皮肤以暴露腹膜，用镊子将腹膜远离内脏器官，并在左腹腹膜上切开切口以暴露并切除脾脏；

3、将脾脏放入10ml培养皿中的无血清培养液(lonza公司的x-vivo15w/ogentorphenolred)，取出并丢弃脾脏中多余的组织；

4、使用2个无菌玻璃载玻片压碎脾脏，制成单细胞悬浮液；通过70μm过滤器将细胞悬浮液过滤到50ml无菌离心中，并用5ml无血清培养液冲洗过滤器；

5、将细胞进行离心，离心条件：300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，弃去上清液；

6、取2ml～15ml红细胞裂解液(lonza公司的ack红细胞裂解液)室温下避光裂红细胞2min～15min，向试管中加入等体积的无血清培养液至10ml～15ml；

7、离心处理，离心条件：300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，弃去上清液；

8、将细胞轻轻重悬于10ml的无血清培养液中；

9、计数细胞，步骤具体为：将所取细胞液置于ep管内，取50μl细胞悬液与50μl台盼蓝加于ep管内混匀，取10μl在计数板上，快速操作和计数：(四角数目之和/4)×10⁴个/ml×稀释倍数，线上细胞记上不记下，记左不计右；

10、将细胞在10ml的无血清培养液中进行离心，离心条件：300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，弃去上清液，得分离的小鼠脾脏细胞。

二、分选t细胞

1、将分离的小鼠脾脏细胞重悬至macs缓冲液(购自美天旎公司)，形成20×10⁶细胞/ml的单细胞悬浮液；

2、每1×10⁷细胞重悬于40μlmacs缓冲液中，添加10μl生物素化的标记抗体，混匀，冰上孵育5min；

3、向细胞中加30μlmacs缓冲液，加入20μl抗生物素磁珠，混匀，冰上孵育10min；

4、将500μlmacs缓冲液润ls柱2次，每1×10⁸个细胞加入1mlmacs缓冲液，ls柱过柱分离，用15ml离心管收集流出液，加1mlmacs缓冲液冲洗离心管得细胞悬液，加入ls柱，重复该步骤一次，此步骤中流出液内的细胞为cd4⁺t细胞。

三、分选cd4⁺cd45rb⁺t细胞

1、向cd4⁺t细胞添加macs缓冲液润至10ml，进行离心处理，离心条件：300g，10min，开始加速度：+8，结束时减速度：-9，弃去上清液。

2、将细胞重悬于1mlmacs缓冲液中，进行计数并评估细胞活力，细胞终浓度调至10×10⁶细胞/ml；

3、加入5μg/mlcd4-fitc和1μg/mlcd45rb-pe，混匀，避光的冰上孵育30min；

4、重悬在macs缓冲液中至10×10⁶细胞/ml，使细胞通过70μm滤网进入流式管，保持冰层避光，采用流式细胞仪分选出cd4⁺cd45rb⁺t细胞。

四、注射细胞

1、使用了12～14周龄的cb6f1雌性小鼠供者和年龄为8～10周雌性免疫缺陷的c.b.17scid/scid小鼠为受体，所有小鼠均按照动物护理和使用委员会的标准方案进行护理；

2、将分选的cd4⁺cd45rb⁺t细胞重悬至生理盐水中4×10⁶细胞/ml；

3、取100μlcd4⁺cd45rb⁺t细胞转移至新的无菌试管中，向每个试管中添加100μl～200μl生理盐水，每个接受小鼠的细胞总数为4×10⁵个cd4⁺cd45rb⁺t细胞；腹膜内注入每个接受小鼠腹腔的左右两侧，以将10μg/ml～20000μg/ml脐血血小板线粒体与4×10⁵个cd4⁺cd45rb⁺t细胞联合处理组为线粒体处理组，以未加入脐血血小板线粒体的为对照组。

五、评估动物临床状况

1、每天评估动物健康状况，每周对小鼠称重3次，仅针对所有小鼠均存活的组计算体重数据；

2、通过将动物放在干净的容器中来确定粪便的质量进行评分，0：无，1：小肛周大便，2：明显的大便稀疏，3：完整的肛周大便。

试验结果如图10和图11所示，经过脐血血小板线粒体与cd4⁺cd45rb⁺t细胞联合处理的小鼠的体重下降不明显，说明小鼠病情交轻，大便分数维持较低水平，反应小鼠肠道炎症较轻。

实施例4

将10μg～200μg脐血血小板线粒体溶解于100μl～200μl生理盐水中，尾静脉注射10周龄nod/shiltj雌性小鼠，1周治疗1～5次，连续治疗2～10周。

研究结果表明，如图11和图13所示，检测血糖水平变化和糖尿病发病情况，脐血血小板线粒体处理组的小鼠血糖水平明显降低并逆转糖尿病发病，而对照组小鼠均发病。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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