一种桑黄抗肺癌细胞增殖的有效成分制备方法与流程

本发明涉及桑黄制备技术领域，特别涉及一种桑黄抗肺癌细胞增殖的有效成分制备方法。

背景技术：

桑黄作为我国传统真菌类中药，是目前国际公认的生物治癌领域中有效率排在第一位的药用菌。其包含多种结构类型的化学成分，包括多糖、黄酮、三萜类、芳香酸、氨基酸等，其中多糖类成分是含量最多的成分；现代药理学实验也表明，桑黄具抗癌、免疫调节、抗肥胖、抗氧化和抗炎等多种药理学活性。研究表明,桑黄菌子实体的热水提取物对小白鼠肉瘤180的抑制率为87％,子实体的水浸液对小白鼠艾氏癌的抑制率为80％。临床研究显示，桑黄多糖可明显改善癌症术后患者的免疫水平,抵抗放、化疗的副作用,协同放、化疗杀死癌细胞,增强疗效。如果桑黄和抗肿瘤药物或放疗并用，更可以减轻诸如丧失食欲、高热、呕吐、脱发副作用。对经过手术后进行放疗和化疗的患者，服用桑黄则可恢复并强化免疫系统，从而达到防止肿瘤复发或抑制残余肿瘤细胞转移的目的，且无毒无害，长期大剂量服用亦无毒副作用。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种桑黄抗肺癌细胞增殖的有效成分制备方法，桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对肺癌细胞具有抑制增殖效果，不同浓度的桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对肺癌细胞增殖效果，为桑黄抗肺癌进行更加深入的开发提供重要参考依据。

为了解决上述技术问题，本发明的技术方案为：

一种桑黄抗肺癌细胞增殖的有效成分制备方法，包括以下步骤：

以桑黄细粉、桑黄菌丝体为原料，将桑黄细粉体制成桑黄细粉浓缩液，将桑黄菌丝体制成桑黄菌丝体浓缩液，体外培养人肺癌a549细胞，根据桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液作用下的ic50值得到桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对人肺癌a549细胞的增殖抑制效果。

优选的，所述桑黄细粉浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入50-60倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提3-4h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/5～1/10备用。

优选的，所述桑黄菌丝体浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入50-60倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提3-4h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/5～1/10备用。

优选的，所述桑黄细粉浓缩液或桑黄菌丝体浓缩液经0.2-0.3μm滤膜过滤除菌后，用不完全培养基稀释后使用。

优选的，所述人肺癌细胞a549采用含10％fbs的rpmi1640培养基培养，于37℃、5％co2条件下传代培养。

采用上述技术方案，提供一种桑黄抗肺癌细胞增殖的有效成分制备方法，该方法得出了桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对肺癌细胞增殖效果，不同浓度的桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对肺癌细胞增殖效果，为桑黄抗肺癌进行更加深入的开发提供重要参考依据。

附图说明

图1为桑黄细粉和桑黄菌丝体24h和48h时对人肺癌细胞的增殖作用对比图；

图2为本发明桑黄细粉作用24h人肺癌细胞a549显微镜采图；

图3为本发明桑黄细粉作用48h人肺癌细胞a549显微镜采图；

图4为本发明桑黄菌丝体作用24h人肺癌细胞a549显微镜采图；

图5为本发明桑黄菌丝体作用48h人肺癌细胞a549显微镜采图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。

实施例1

以桑黄细粉、桑黄菌丝体为原料，将桑黄细粉体制成桑黄细粉浓缩液，将桑黄菌丝体制成桑黄菌丝体浓缩液，体外培养人肺癌a549细胞，根据桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液作用下的ic50值得到桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对人肺癌a549细胞的增殖抑制效果。

桑黄细粉浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入50倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提3h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/5备用。

桑黄菌丝体浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入50倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提3h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/5备用。

桑黄细粉浓缩液或桑黄菌丝体浓缩液经0.2μm滤膜过滤除菌后，用不完全培养基稀释后使用；

人肺癌细胞a549采用含10％fbs的rpmi1640培养基培养，于37℃、5％co2条件下传代培养；

实施例2

以桑黄细粉、桑黄菌丝体为原料，将桑黄细粉体制成桑黄细粉浓缩液，将桑黄菌丝体制成桑黄菌丝体浓缩液，体外培养人肺癌a549细胞，根据桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液作用下的ic50值得到桑黄细粉浓缩液和桑黄菌丝体浓缩液对人肺癌a549细胞的增殖抑制效果；

桑黄细粉浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入60倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提4h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/10备用；

桑黄菌丝体浓缩液的制备包括以下步骤：向桑黄细粉中加入60倍体积的蒸馏水，置于90℃的水浴锅内浸提4h，抽滤得提取液，重复上述操作2次，合并所得桑黄细粉提取液，并将桑黄细粉提取液浓缩至原体积的1/10备用；

桑黄细粉浓缩液或桑黄菌丝体浓缩液经0.3μm滤膜过滤除菌后，用不完全培养基稀释后使用；

人肺癌细胞a549采用含10％fbs的rpmi1640培养基培养，于37℃、5％co2条件下传代培养。

桑黄对人肺癌a549细胞增殖抑制作用研究实验

人肺癌细胞a549采用含10％fbs的rpmi1640培养基培养，于37℃、5％co2条件下传代培养，细胞形成细胞融合度约为80％致密单层时，即进行细胞传代，实验时取对数生长期细胞，采用mtt法检测细胞的存活率，调整细胞为5×10⁴个/ml，100μl/孔接种于96孔板中，设立空白组、正常对照组、系列不同浓度桑黄细粉及桑黄菌丝体提取液组，每孔加入药物100μl，于37℃、5％co2培养箱中分别培养24h和48h后，每孔加入mtt(5g/l)20μl，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入150μldmso，室温置于摇床10min，于酶标仪490nm处测定od值，计算细胞存活率和半数抑制浓度(ic50)，存活率(％)＝(od样品-od空白)/(od正常-od空白)*100，倒置显微镜观察细胞形态，细胞处理同上，在药物作用24h和48h后，采用倒置显微镜观察，物镜20倍，拍照记录各组细胞形态，

如表1所示为桑黄细粉和桑黄菌丝体24h和48h时对人肺癌细胞a549存活率的影响(n＝3,x±sd)，如图1-5所示，图1为桑黄细粉和桑黄菌丝体24h和48h时对人肺癌细胞的增殖作用对比图，图2为桑黄细粉作用24h人肺癌细胞a549显微镜采图，图中a-h为桑黄细粉提取液浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4mg/ml作用24h下人肺癌细胞a549显微镜采图，图3为桑黄细粉作用48h人肺癌细胞a549显微镜采图，图中a-h为桑黄细粉提取液浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4mg/ml作用48h下人肺癌细胞a549显微镜采图，图4为桑黄菌丝体作用24h人肺癌细胞a549显微镜采图，图中a-h为桑黄菌丝体提取液浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4mg/ml作用24h下人肺癌细胞a549显微镜采图，图5为桑黄菌丝体作用48h人肺癌细胞a549显微镜采图，图中a-h为桑黄菌丝体提取液浓度为0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.4、3.2、6.4mg/ml作用48h下人肺癌细胞a549显微镜采图，随着桑黄细粉和桑黄菌丝体药物浓度增加和作用时间延长，mtt结果显示细胞存活率下降，光镜下观察细胞数量减少，皱缩，体积变小，贴壁不紧密，部分脱落，形态损伤程度逐渐加深。作用时间24h时，桑黄细粉浓度达到2.4mg/ml，对a549细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)；作用时间48h时，桑黄细粉浓度达到1.2mg/ml，桑黄菌丝体浓度达到6.4mg/ml，对a549细胞呈现明显细胞增殖抑制作用(p＜0.05)；

桑黄细粉作用于人肺癌细胞a549细胞24h和48h的ic50分别为2.731和1.750mg/ml，95％置信区间分别为2.563～2.910mg/ml和1.346～2.276mg/ml；桑黄菌丝体24h时由于给予最高浓度细胞存活率较高，ic50无法通过计算获得，48h的ic50为6.874mg/ml，95％置信区间分别为4.736～9.976mg/ml和2.546～3.377mg/ml；

表1

注：*p<0.05，**p<0.01与空白对照组(0.0mg/ml)比

因此，桑黄对人肺癌a549细胞增殖具有一定抑制作用，桑黄细粉提取液作用24h和48h的ic50分别为2.731和1.750mg/ml，桑黄菌丝体提取液作用48h的ic50为6.874mg/ml，在相同作用时间和相同浓度下，桑黄细粉提取液对人肺癌细胞增殖的抑制作用明显优于桑黄菌丝体提取液。

以上结合附图对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

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