垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用与流程

本发明属于医药领域，具体涉及垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。
背景技术：
：肝癌是发病率和死亡率高、预后极差的恶性肿瘤之一，主要包括原发性肝癌和继发性肝癌，肝细胞癌(hcc)约占原发性肝癌的90％。恶性肿瘤中肝癌发病率和死亡病例均较高，男性的肝癌发病率位居恶性肿瘤的第三位，死亡率高居恶性肿瘤的第二位；女性肝癌发病率和死亡率分别位居于恶性肿瘤的第七位和第三位。随着科学技术的不断发展，目前在肝癌预防和诊断方面取得了进展。在肝癌早期，化疗、手术切除、肝移植、局部消融等治疗方法可以提高患者的生存率；但5年复发率很高，即使肝癌患者接受了潜在的治疗，复发率也可能高达80％～90％，且80％hcc患者被诊断为晚期肝癌，中位生存期仅6～8个月，缺乏有效的治疗方案。小分子靶向治疗药物索拉非尼和瑞格拉非尼是目前fda批准的标准治疗晚期肝癌方法，索拉非尼是目前唯一可用于晚期肝癌的标准一线系统治疗药物，但中位生存期仅为12.3个月；瑞格拉非尼是一种二线系统治疗药物，中位生存期仅为10.6个月；尽管索拉非尼和瑞格拉非尼能提高肝癌患者的整体生存率，但时效短，易产生耐药性，预后仍然很差，患者抗肿瘤免疫无能或低下，易复发。晚期肝癌患者对于化疗药物的不敏感、肿瘤细胞易对化疗产生耐受成为亟待解决的问题，因此寻找安全、高效低毒且逆转耐药的新型肝癌治疗或辅助型药物迫在眉睫。技术实现要素：为了解决上述问题，本发明提供了垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明的垂枝藓醇提物的制备方法得到的醇提物可显著抑制肝癌细胞的生长、诱导肝癌细胞的凋亡和坏死，同时还可以增强机体免疫力，抗肝癌细胞效果显著，且为纯天然成分，安全无毒，为新型抗肝癌药物的研发奠定基础。为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：本发明提供了一种垂枝藓醇提物的制备方法，包括如下步骤：采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物；所述垂枝藓的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)。优选的，所述提取的温度为50～60℃，所述提取的时间为2～3h。本发明提供了上述技术方案中所述制备方法得到的垂枝藓醇提物，所述垂枝藓醇提物包括多糖和黄酮，所述多糖的质量百分含量为25％～35％，所述黄酮的质量百分含量为3％～5％。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌细胞h22、bel-7404和hepg2药物中的应用。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备阻滞肝癌细胞周期于g0/g1期药物中的应用。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备诱导肝癌细胞凋亡和坏死药物中的应用。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备降低肝癌细胞线粒体膜电位药物中的应用。本发明还提供了一种垂枝藓醇提物在制备提高机体免疫力药物中的应用。本发明提供了一种抗肝癌药物，包括垂枝藓醇提物和辅料。有益效果：本发明提供了垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。本发明的垂枝藓醇提物的制备方法通过无水乙醇对垂枝藓进行提取，得到垂枝藓醇提物。实施例结果表明，垂枝藓醇提物呈剂量依赖性地抑制肝癌细胞h22、bel-7404和hepg2的生长，并且对小鼠脾脏细胞无毒性作用；可通过阻滞h22细胞周期于g0/g1期，从而抑制h22细胞的增殖；另外，垂枝藓醇提物还能够显著诱导肝癌细胞的凋亡和坏死，垂枝藓醇提物可显著降低线粒体膜电位，提高肝癌细胞的活性氧的水平，提高促凋亡蛋白bax和细胞色素c的蛋白水平，降低抗凋亡蛋白bcl-2的蛋白水平，通过线粒体途径及死亡受体途径激活caspase信号通路，诱导肝癌细胞凋亡；垂枝藓醇提物还能够显著增加小鼠脾脏指数和免疫细胞的数量，从而提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。垂枝藓醇提物抗肿瘤效果显著，且为纯天然成分，安全无毒，为新型抗肝癌药物的研发奠定基础。附图说明图1为实施例4垂枝藓醇提物对肝癌细胞h22生长的影响图；图2为实施例5垂枝藓醇提物对h22细胞周期的影响图；图3为实施例6垂枝藓醇提物对肝癌细胞凋亡影响图；图4为实施例7垂枝藓醇提物对线粒体膜电位的影响图；图5为实施例7垂枝藓醇提物对h22细胞活性氧水平的影响图；图6为实施例7垂枝藓醇提物对凋亡相关蛋白(bax、bcl-2)及细胞色素c蛋白水平的影响图；图7为实施例7垂枝藓醇提物对h22细胞caspase信号通路相关蛋白(caspase9、cleavedcaspase9、caspase8、cleavedcaspase8、parp、cleavedparp)的影响图；图8为在caspase3抑制剂z-vad-cho预处理后垂枝藓醇提物对h22细胞凋亡的影响图；图9为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠体重的影响图；图10为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠器官指数(肝脏指数、心脏指数、肾脏指数、肺脏指数、脾脏指数及胸腺指数)的影响图；图11为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠脾脏中t细胞、b细胞、nk细胞及活化的cd4+及cd8+t细胞数量的影响图。图12为实施例8垂枝藓醇提物对小鼠脾脏中巨噬细胞、树突状细胞数量及其成熟的影响图。具体实施方式本发明提供了一种垂枝藓醇提物的制备方法，包括如下步骤：采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物；所述垂枝藓的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)。本发明采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，得垂枝藓醇提物。在本发明中，所述垂枝藓优选为垂枝藓粉末，以垂枝藓粉末作为提取的原料可以使垂枝藓中的有效成分更加充分的释放，提高垂枝藓醇提物有效成分的含量，提高垂枝藓醇提物抗肝癌细胞的效果。本发明采用无水乙醇对垂枝藓进行提取，所述垂枝藓的质量与无水乙醇的体积比为1g：(10～20ml)，进一步优选为50～60℃，更进一步优选为60℃。在本发明中，所述垂枝藓优选以粉末的形式进行提取，有利于活性物质的溶出。在本发明中，所述提取的温度优选为50～65℃，进一步优选为50～60℃，更进一步优选为60℃；所述提取的时间优选为2～3h，进一步优选为2h。提取后，本发明优选将提取液进行离心，所述离心的转速优选为6000～8000rpm，进一步优选为8000rpm；所述离心的时间优选为10～20min，进一步优选为15min。离心后，将沉淀继续提取2～4次，将多次提取、离心后的上清液合并。得到合并后的上清液后，本发明优选将合并后的上清液进行过滤，得到滤液。本发明优选将得到的滤液进行浓缩，得到垂枝藓醇提物。本发明通过无水乙醇对垂枝藓进行提取，可有效提取垂枝藓中的活性物质，使得到的垂枝藓醇提物具有显著的抗肝癌细胞的效果，同时，还能够增强机体免疫力，提高抗癌效果，且为纯然天提取物，对机体无毒副作用，安全性能高。进一步的，本发明控制提取过程中垂枝藓和提取剂的相对用量、提取温度和提取时间，可以使有效成分更加充分的溶出，提高醇提物有效成分的含量，进而提高醇提物抗肝癌细胞的效果。本发明提供了上述技术方案中所述制备方法得到的垂枝藓醇提物，所述垂枝藓醇提物包括多糖和黄酮。在本发明中所述垂枝藓醇提物中多糖的质量百分含量为25％～35％，进一步优选为30％；所述黄酮的质量百分含量为3％～5％，进一步优选为4％。本发明提供的垂枝藓醇提物对肝癌细胞具有良好的抑制作用，垂枝藓醇提物通过线粒体途径及死亡受体途径激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡；同时，垂枝藓醇提物能够提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用。在本发明中，所述垂枝藓醇提物优选本发明所述制备方法得到的垂枝藓醇提物。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备抗肝癌细胞h22、bel-7404和hepg2药物中的应用。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备阻滞肝癌细胞周期于g0/g1期药物中的应用。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备诱导肝癌细胞凋亡和坏死药物中的应用。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备降低肝癌细胞线粒体膜电位药物中的应用。本发明提供了一种垂枝藓醇提物在制备提高机体免疫力药物中的应用。在上述应用中，所述垂枝藓醇提物制备方式与前述垂枝藓醇提物制备方法的技术方案一致，在此不再赘述。本发明提供了一种抗肝癌药物，包括垂枝藓醇提物和辅料。在本发明中，所述抗肝癌药物中的垂枝藓醇提物优选为前述垂枝藓醇提物制备方法得到的垂枝藓醇提物。本发明对药物的剂型、药物的敷料和药物的制备方法无特殊要求，采用本领域技术人员熟知的即可。为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的垂枝藓醇提物及其制备方法和垂枝藓醇提物在制备抗肝癌药物中的应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1垂枝藓醇提物的制备垂枝藓采集于新疆木垒林场和乌鲁木齐南山小渠子林场，取干燥垂枝藓植物体，粉碎得到粉末；将垂枝藓粉末与无水乙醇按质量体积比为1g：20ml在60℃水浴回流提取2h；然后将提取液在8000rpm条件下离心15min，取上清，沉淀继续回流提取3次。离心、合并上清；将合并后的上清过滤，滤液经旋蒸浓缩至无乙醇味，干燥，得垂枝藓醇提物(rhytidiumrugosumethanolextract，rree)。将rree用二甲基亚砜(dmso)溶解，浓度为30mg/ml，采用苯酚-硫酸法测定多糖含量，其多糖质量百分含量为28.9％；采用碱性法测定黄酮含量，其黄酮的质量百分含量为4.6％。苯酚-硫酸法的参考文献为：duboism,gilleska,hamiltonjk,etal.colorimetricmethodfordeterminationofsugarsandrelatedsubstances[j].analyticalchemistry,1956,28(3):350-356.碱性法测定黄酮的参考文献为：swamymk,sinniahur,akhtarm.invitropharmacologicalactivitiesandgc-msanalysisofdifferentsolventextractsoflantanacamaraleavescollectedfromtropicalregionofmalaysia[j].evidence-basedcomplementaryandalternativemedicine,2015,2015:506413.实施例2垂枝藓醇提物的制备制备过程同实施例1，不同之处在于：垂枝藓粉末与无水乙醇按质量体积比为1g：10ml在60℃水浴回流提取3h；然后将提取液在6000rpm条件下离心20min，取上清，沉淀继续回流提取4次。得到的垂枝藓醇提物经dmso溶解后，浓度为30mg/ml；多糖质量百分含量为25.4％；黄酮的质量百分含量为4.1％。实施例3垂枝藓醇提物的制备制备过程同实施例1，不同之处在于：垂枝藓粉末与无水乙醇按质量体积比为1g：20ml在50℃水浴回流提取3h；然后将提取液在8000rpm条件下离心20min，取上清，沉淀继续回流提取3次。得到的垂枝藓醇提物经dmso溶解后，浓度为30mg/ml；多糖质量百分含量为32.5％；黄酮的质量百分含量为3.2％。实施例4垂枝藓醇提物体对肝癌细胞生长的影响1垂枝藓醇提物体对肝癌细胞h22生长的影响将肝癌细胞培养至对数生长期，以实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(rree)在体外处理h22细胞(购自americantypeculturecollection)，其中rree的浓度分别为50、100、200、400μg/ml。以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以dmso处理的细胞作为空白对照2，以顺铂(cisplatin，临床上的一种常用化疗药物)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，在显微镜下观察细胞数量，结果见图1；采用mtt法(sigma-aldrich，美国)检测h22细胞的增殖活性，结果见表1。表1垂枝藓醇提物对h22细胞活细胞比例(％)的影响时间untreateddmsocisplatin50ug/ml100ug/ml200ug/ml400ug/ml24h100±0.0091.11±8.1738.56±3.2664.96±5.7550.07±4.2434.33±2.5712.60±1.2148h100±0.00109.82±12.134.87±0.5756.98±5.1631.04±3.5819.41±6.145.842±0.53由图1可知，rree呈剂量依赖性的减少了h22细胞的数量，抗肝癌细胞h22的效果显著；由表1可知，rree显著抑制了h22细胞的增殖活性(p<0.001)，并呈现剂量和时间依赖性，rree在24h的ic50值为95.51μg/ml；当rree的浓度为400μg/ml时，24h抑制h22细胞的效果显著高于cisplatin(阳性对照)，48h的抑制效果与cisplatin相当，说明rree对h22细胞的抑制作用见效更快，效果优于cisplatin。2垂枝藓醇提物对肝癌细胞bel-7404和hepg2生长的影响处理方法同h22细胞，采用mtt法(sigma-aldrich，美国)检测bel-7404及hepg2细胞的增殖活性，结果见表2和表3。表2垂枝藓醇提物对bel-7404细胞24h活细胞比例(％)的影响表3垂枝藓醇提物对hepg2细胞24h活细胞比例(％)的影响untreateddmsocisplatin50ug/ml100ug/ml400ug/ml重复1100.0097.4639.5867.9155.9844.19重复2100.00112.6442.9769.6760.4550.02重复3100.00118.7439.0467.3762.8952.59重复4100.0094.2739.7267.0555.0843.82重复5100.00115.6243.1067.9060.5249.02重复6100.00118.9846.2270.0163.7354.00平均值100.00109.6241.7768.3259.7848.94标准差0.0010.952.811.233.544.22由表2和表3的结果可知，rree显著抑制了bel-7404及hepg2细胞的增殖活性(p<0.001)，并呈现剂量依赖性，rree在24h的ic50值分别为282.7μg/ml及328μg/ml。3垂枝藓醇提物对小鼠脾脏细胞生长的影响处理方法同h22细胞，采用mtt法(sigma-aldrich，美国)检测小鼠脾脏细胞(从c57bl/6小鼠分离得到)的增殖活性，结果见表4。表4垂枝藓醇提物对小鼠脾脏活细胞比例(％)的影响时间untreateddmsocisplatin50ug/ml100ug/ml200ug/ml400ug/ml24h100±0.0098.22±11.5398.73±6.31109.67±8.55118.32±12.51126.21±7.70135.62±10.2448h100±0.00101.42±7.9898.82±6.14112.56±2.90121.80±7.12123.93±7.91130.10±6.89由表4的结果可知，rree促进了脾脏细胞的增殖，对脾脏细胞的没有毒性作用。综上所述，rree呈剂量依赖性地抑制h22、bel-7404及hepg2肝癌细胞的生长，并且对小鼠脾脏细胞无毒性作用。实施例5垂枝藓醇提物体对肝癌细胞周期的影响采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(rree)处理h22细胞，rree的浓度分别为25、50、100μg/ml。以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以dmso处理的细胞作为空白对照2，以顺铂(cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，h22细胞经pi染色(sigma-aldrich，美国)后用流式细胞仪进行分析，结果见图2。由图2可知，100μg/mlrree显著增加了g0/g1细胞比例(p<0.001)。这些结果说明，rree通过阻滞h22细胞周期于g0/g1期，从而抑制h22细胞的增殖。实施例6垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡和坏死的影响采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(rree)处理h22、bel-7404及hepg2细胞，rree的浓度分别为50、100、200μg/ml。以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以dmso处理的细胞作为空白对照2，以地钱提取物(mpee)或顺铂(cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，地钱提取物的浓度为25μg/ml，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，用pi和annexinv(翊圣，中国)对bel-7404及hepg2细胞染色并采用流式细胞仪进行分析，考察垂枝藓醇提取对肝癌细胞凋亡(pi-annexin+和pi+annexin+)和坏死(pi+annexin-)的影响，具体结果见图3。由图3可知，rree显著诱导了h22、bel-7404及hepg2细胞的凋亡及坏死(p<0.001)，但是高浓度rree主要诱导了h22和bel-7404细胞坏死及hepg2细胞的凋亡。这些结果显示，rree诱导肝癌细胞的凋亡及坏死，不同肝癌细胞的坏死及凋亡比例不同。实施例7垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡和坏死机理的研究1垂枝藓醇提物体对肝癌细胞线粒体膜电位及活性氧的影响采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(rree)处理h22细胞、bel-7404及hepg2细胞，rree的浓度分别为50、100、200μg/ml。以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以顺铂(cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，检测如下项目：用jc-1(碧云天，中国)对细胞进行染色，通过流式细胞仪检测，考察对线粒体膜电位的影响，当线粒体膜电位降低，jc-1多聚体(红色荧光)会分解成单体(绿色荧光)，检测结果见图4。用dcfh-da探针(碧云天，中国)对细胞进行染色，dcfh-da本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，在细胞内被水解成dcfh，dcfh不能穿过细胞膜，在活性氧存在的情况下，dcfh被氧化成荧光物质dcf，绿色荧光强度与活性氧水平成正比，然后，通过流式细胞仪检测细胞荧光强度即可反应细胞内的活性氧的水平，结果见图5。将处理后的细胞采用ripa裂解液(北京康为世纪生物科技有限公司)提取总蛋白，用westernblot检测凋亡相关蛋白bcl-2(抗凋亡蛋白，cellsignalingtechnology，usa)和bax(促凋亡蛋白，cellsignalingtechnology，usa)及细胞色素c(碧云天，中国)的蛋白水平的变化，结果见图6。由图4可知，rree显著增加了绿色荧光强度(p<0.001)，说明rree显著降低了线粒体膜电位。由图5可知，rree显著增加了绿色荧光强度(p<0.001)，说明rree显著提高了肝癌细胞的活性氧的水平，而活性氧水平增高能够促进细胞凋亡。由图6可知，rree提高了促凋亡蛋白bax和细胞色素c的蛋白水平，降低了抗凋亡蛋白bcl-2的蛋白水平，抗凋亡蛋白bcl-2和促凋亡蛋白bax均参与调控线粒体膜的完整性，线粒体膜电位降低导致细胞色素c释放，细胞色素c释放可诱导细胞凋亡。2垂枝藓醇提物体对肝癌细胞凋亡途径的影响采用实施例1制备得到的垂枝藓醇提物(rree)处理h22细胞，rree的浓度分别为50、100、200μg/ml。以未做任何处理的细胞作为空白对照1，以顺铂(cisplatin)处理的细胞作为阳性对照，顺铂的浓度为30μg/ml。各实验组处理24h后，将处理后的细胞提取总蛋白，用westernblot检测caspase信号通路相关蛋白caspase-9(cellsignalingtechnology，usa)、parp(cellsignalingtechnology，usa)和caspase-8(cellsignalingtechnology，usa)的蛋白水平的变化，结果见图7。本发明还通过caspase-3抑制剂(z-vad-cho)(碧云天，中国)对h22细胞进行预处理，然后再对细胞进行上述处理，考察caspase-3抑制剂对各处理组细胞凋亡情况的影响，结果如图8。由图7可知，rree激活了caspase-9和caspase-8，促进了parp的切割，说明rree激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡。由图8可知，z-vad-cho能够部分逆转rree诱导的h22细胞的凋亡，说明rree通过caspase信号通路诱导了h22细胞凋亡。综上所述，rree通过线粒体途径及死亡受体途径激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡。实施例8垂枝藓醇提物体对体内免疫作用的影响为了评估rree的免疫调节作用，将实施例1制备的rree通过腹腔注射(i.p.)或灌胃(i.g.)的方式对昆明白小鼠进行给药，检测rree对小鼠的体重、各脏器指数及脾脏中免疫细胞的比例及数量的影响。昆明白小鼠随机分为6组，分别为腹腔注射50mg/kg(小鼠体重)、100mg/kgrree，灌胃给药50mg/kg、100mg/kgrree，腹腔注射dmso(二甲基亚砜，rree溶剂)及未给药组(对照)，每组4只小鼠，药物每隔1天给药1次，共5次。体重每隔1天称重1次，待给药完毕，次日处死小鼠，取小鼠心、胸腺、脾、肝、肺、肾等器官，称重并计算脏器指数；免疫器官指数计算公式如下：免疫器官重量(mg)/小鼠体重(g)。对小鼠脾脏细胞进行染色，共3组，cd3/cd19/cd49b、cd11c/cd11b/cd40、cd4/cd8/cd44(bdbiosciences，usa)，采用流式细胞仪法进行检测。检测结果见图9～12。由图9可知，与对照组相比，rree对小鼠体重没有影响。由图10可知，rree对小鼠肝脏指数、心脏指数、肾脏指数、肺脏指数及胸腺指数均没有影响，说明所选剂量的rree具有较好的安全性，但显著增加小鼠脾脏指数(p<0.05)。由图11～12可知，50mg/kgrree灌胃组显著增加小鼠脾脏中cd19+b细胞，腹腔注射组显著增加了cd49+nk细胞数量，腹腔注射及灌胃组显著增加了cd8+cd44+t细胞的数量(p<0.05)，灌胃组显著增加了cd11c+树突状细胞、cd11c+cd40+树突状细胞、cd11b+cd40+巨噬细胞的数量(p<0.05)。以上结果表明，rree能增加小鼠脾脏指数和免疫细胞的数量，从而提高小鼠免疫力。对实施例2和3制备得到的垂枝藓醇提物对肝癌细胞生长和对体内免疫作用进行检测，结果实施例2和3的垂枝藓醇提物对肝癌细胞具有良好的抑制作用，且可以提高机体的免疫力，同实施例1制备得到的垂枝藓醇提物得到的结果一致。由上述实施例的结果可知，垂枝藓醇提物对肝癌细胞具有良好的抑制作用，垂枝藓醇提物通过线粒体途径及死亡受体途径激活了caspase信号通路，诱导了肝癌细胞凋亡；同时，垂枝藓醇提物能够提高机体免疫力，能够进一步提高抗肿瘤效果。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其它实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。当前第1页1 2 3 

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