血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用的制作方法

本发明属于眼病药物技术领域，具体涉及血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。

背景技术：

视网膜退行性疾病主要包括年龄相关性黄斑变性(amd)、糖尿病视网膜病变和视网膜色素变性等，是全球视力受损的主要原因之一。amd是视网膜退行性疾病最常见的一种疾病，其主要分为两种形式：非新生血管型amd(干型amd)和新生血管型amd(湿型amd)。干性amd与视网膜色素上皮细胞(rpe)的损伤和死亡以及光感受器的退化有关，而湿性amd通常归因于脉络膜新生血管(cnv)的形成，从而严重影响患者视力。

视网膜炎症是amd的一个重要发病的病理过程，rpe功能障碍在amd进展过程中的视网膜炎症和cnv形成中起着至关重要的作用。视网膜色素上皮细胞作为全身血液循环和神经视网膜之间的桥梁，负责通过视网膜和邻近组织之间的物质交换，维持视网膜下间隙炎症反应和血管生成反应之间的平衡，当rpe受到不利刺激(如蓝光)的损害时，免疫/血管会被破坏，从而导致视网膜出现病理性炎症和/或血管生成反应。

目前，针对amd等视网膜退行性疾病中视网膜炎症的主要治疗方法是玻璃体腔注射曲安奈德，虽其可以有效得抑制炎症引发的视网膜水肿和炎症细胞的浸润，然而，诸如激素性青光眼和急性眼内炎等并发症很常见。抗血管内皮生长因子(vegf)治疗被公认为新生血管型amd临床治疗的最首要的治疗方案。然而，有许多临床患者对抗vegf治疗没有反应，其比例高达45％。此外，在临床实践中通常需要联合使用抗炎(曲安奈德)和抗血管治疗以达到令人满意的针对amd的治疗效果。因此，一个有前景的辅助或替代疗法与当前的治疗策略并行是迫切需要的。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，能够同时实现有效抑制蓝光诱导的视网膜炎症反应、抑制病理性新生血管形成以及保护视网膜免受蓝光诱导的视网膜损伤。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。

优选的，所述血小板反应蛋白1的氨基酸序列如序列表seqidno:1所示。

优选的，所述年龄相关性黄斑变性包括非新生血管型年龄相关性黄斑变性和新生血管型年龄相关性黄斑变性。

优选的，所述血小板反应蛋白1的使用剂量每眼不低于1.2ng/g体重小鼠。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗视网膜炎症的药物中的应用。

优选的，所述视网膜炎症的预防和/或治疗方法包括降低视网膜中mcp-1和cd68的表达。

优选的，所述视网膜炎症由蓝光诱导所致。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备抑制病理性新生血管形成的药物中的应用。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗视网膜损伤的药物中的应用。

优选的，所述视网膜损伤包括视网膜色素上皮细胞损伤。

本发明提供了血小板反应蛋白1(thbs-1)在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。由于年龄相关性黄斑变性的发病的病理过程包括视网膜色素上皮细胞(rpe)的损伤和死亡、脉络膜新生血管(cnv)的形成和视网膜炎症，本发明从细胞水平和动物水平证实血小板反应蛋白1对上述三种病理过程均有调节作用。蓝光诱导的视网膜炎症反应的调节作用方面，在体内，蓝光诱导的小鼠视网膜中mcp-1(单核细胞趋化蛋白)和cd68(炎性单核细胞标志物)阳性率在用thbs-1治疗后明显减少。这表明thbs-1治疗能够显著抑制视网膜炎症反应，减少随后进入视网膜下间隙的巨噬细胞/单核细胞募集，并抑制蓝光照射后小胶质细胞的激活。thbs-1对病理性新生血管的抗血管生成作用方面，与pbs治疗组(阴性对照组)相比，sd-oct扫描显示thbs-1治疗组和抗vegf治疗组的激光诱导cnv损伤面积减小；荧光素血管造影(fa)显示，pbs处理小鼠出现新的病理血管并伴有持续性渗漏，而thbs-1和抗vegf治疗14天后，cnv诱导的新生血管渗漏面积分别减少了约85％和70％，thbs-1和抗vegf(阳性对照)治疗的疗效相当，thbs-1在减少新生血管渗漏方面比抗vegf抗体更有效。thbs-1保护视网膜免受蓝光诱导的视网膜损伤方面，在体外和体内对蓝光诱导的视网膜损伤的保护作用，结果表明，在体内，通过thbs-1治疗，蓝光照射的视网膜色素上皮细胞(rpe)损伤的增殖能力、存活率得到明显恢复，同时蓝光照射下rpe细胞中代表rpe细胞功能的紧密连接蛋白(occludin和zo-1)表达水平的降低通过thbs-1治疗得以恢复。这些结果证明thbs-1对蓝光诱导的rpe损伤具有保护作用。

附图说明

图1为蓝光照射诱导arpe-19细胞炎症因子水平异常，其中图1a表示qpcr结果显示，蓝光照射后促炎细胞因子mcp-1，tnf-α，il-1β，il-6和il-8的mrna表达水平显着上调，而免疫抑制细胞因子tgf-β1的表达水平被下调；图1b表示蛋白质表达水平的变化与mrna表达的变化一致，以β-actin作为内参蛋白；误差线：平均值±标准差；**p<0.01，student'st检验；bl：蓝光；

图2蓝光通过激活arpe-19细胞中的nf-κb途径诱导炎症因子的表达，其中图2a表示视网膜炎症通路中涉及的核心转录因子的蛋白表达水平中irak-1，c-jun，stat3和p38的磷酸化没有增加；图2b表示通过westernblot检测蓝光照射上调了iκbα的磷酸化水平，与对照组相比，bl组细胞核中nf-κbp65蛋白的表达水平增高，但胞浆nf-κbp65蛋白的表达水平却较低。核蛋白表达水平以组蛋白h3为内参蛋白，细胞质蛋白表达水平以β-actin为内参蛋白；图2c表示免疫染色显示，在蓝光照射后，nf-κbp65发生核转位(如红色箭头所示)；图2d表示westernblot结果表明，bay11-7082可显着降低mcp-1，tnf-α，il-1β，il-6和il-8的表达水平，而bay11-7082不能逆转tgf-β1的下调。误差线：平均值±标准差；**p<0.01，student'st检验；bl：蓝光；比例尺：50μm；

图3为thbs-1通过抑制nf-κb信号通路抑制蓝光引起的视网膜炎症；其中图3a表示nf-κbp65和p-iκbα的蛋白表达水平；thbs-1处理抑制了蓝光诱导的rpe细胞中iκbα的磷酸化和核蛋白中nf-κbp65表达的上调。如图3b中qpcr结果和图3中cwesternblot分析所示，通过thbs-1处理，蓝光诱导的mcp-1，tnf-α，il-1β，il-6和il-8的表达水平显着降低，且thbs-1处理可挽救tgf-β1的表达降低；图3d为进行免疫染色以检测mcp-1(单核细胞趋化蛋白)的表达，其主要分布在rpe层中；thbs-1处理显着降低了蓝光诱导的mcp-1表达的增加；图3e为进行免疫染色以检测cd68(单核细胞的标志物)的表达；在bl组中观察到cd68阳性细胞，thbs-1处理可降低cd68阳性细胞的趋化；图3f为thbs-1通过抑制nf-κb信号通路抑制蓝光引起的视网膜炎症的示意图；误差线：平均值±标准差；**p<0.01，student'st检验；bl：蓝光；inl：内核层；onl：外核层；rpe：视网膜色素上皮层；比例尺：50μm；

图4为bl-cm激活hmec-1细胞的血管生成反应，用bl-cm处理人微血管内皮细胞(hmec-1)；观察到hmec-1细胞的增殖，迁移和成管能力的变化；其中图4a为edu结果，bl-cm处理后hmec-1细胞后，edu阳性的细胞比率增加；图4b所示划痕实验结果和图4c所示的transwell实验结果显示bl-cm组中hmec-1细胞的横向和纵向迁移能力增强；图4d为成管实验结果，bl-cm组的管腔形成数量以及分支和结节的数量明显高于对照组；bl：蓝光；bl-cm：蓝光照射的arpe-19细胞的条件培养基；比例尺：100μm(图4a，图4d)；200μm(图4b，图4c)；

图5为thbs-1抑制了hmec-1细胞中vegf介导的血管生成反应，其中图5a用thbs-1和vegf处理或未处理的hmec-1细胞的edu实验结果；图5b为定量分析表明thbs-1抑制了vegf对细胞增殖的促进作用；图5c为通过划痕实验评估hmec-1细胞48小时的横向迁移；图5d为划痕实验迁移率定量结果；图5e为通过transwell实验分析hmec-1细胞24小时的纵向迁移情况；图5f为通过细胞计数评估transwell实验迁移率(％)结果；两种迁移实验的结果均表明thbs-1抑制了vegf介导的迁移；图5g为成管实验分析结果；图5h～图5j表明定量每组五个随机视野中的成管结节，分支和管腔数目，结果显示thbs-1抑制了vegf对hmec-1细胞的成管能力的促进作用；误差线：平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，单因素方差分析，然后进行lsd事后检验；比例尺：100μm(图5a，图5g)；200μm(图5c，图5e)；

图6为thbs-1在体内抑制新生血管形成，其中图6a表示通过免疫染色评价vegf的表达水平；与对照小鼠相比，在暴露于蓝光的小鼠中，视网膜rpe层周围观察到了明显的vegf表达，而玻璃体内注射thbs-1则降低了vegf的表达水平。激光诱导的cnv模型用于评估thbs-1在体内抑制脉络膜新生血管形成的能力，图6b为在建立激光诱导的cnv模型后7天进行光谱域光学相干断层扫描(sd-oct)和图6c为荧光素血管造影(fa)，并在给药后7天和14天再次进行检测；红色箭头指向cnv区域；thbs-1在减少新生血管方面有效，与抗vegf相当；图6d表明荧光素渗漏的定量分析显示，用thbs-1处理与抗vegf处理对cnv血管渗漏面积的减少效果相当(n＝6)；误差线：平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，单因素方差分析，然后进行lsd事后检验；bl：蓝光；inl：内核层；onl：外核层；rpe：视网膜色素上皮层；比例尺：50μm；

图7为蓝光对arpe-19细胞紧密连接指标的影响，其中图7a为紧密连接蛋白(occludin和zo-1)在arpe-19细胞中的mrna表达水平在蓝光照射后显着下调结果；图7b表示免疫细胞化学分析显示，与对照细胞相比，蓝光照射后rpe细胞中occludin和zo-1的蛋白表达下调；误差线：平均值±标准差；**p<0.01，student'st检验；bl：蓝光；比例尺：50μm；

图8为thbs-1在体内外水平防止蓝光引起的视网膜损伤，其中图8a表示edu结果表明，thbs-1可以显着挽救由蓝光引起的rpe细胞抑制的增殖能力；图8b表示活/死染色结果表明，thbs-1挽救了蓝光诱导的rpe细胞活力的降低；calceinam(活细胞)；pi(死细胞)；图8c表示用针对occludin和zo-1的抗体进行免疫染色结果，结果表明，thbs-1处理能明显恢复蓝光诱导的occludin和zo-1的表达降低；图8d表示获取每组代表性的h&e染色的视网膜切片的图像，thbs-1处理可显着缓解光照射后rpe层的稀疏核分布和脱色素现象(如详细图像所示)；图8e表示在从视神经的下半部和上半部中选择的八个位置(n＝6)测量onl的厚度；thbs-1可明显挽救bl组onl厚度；图8f表示暗视野和明视野erg，通过thbs-1处理(n＝6)挽救了曝光后erg中a波和b波的振幅减小；误差线：平均值±标准差；*p<0.05，**p<0.01，单因素方差分析，然后进行lsd事后检验；bl：蓝光；inl：内核层；onl：外核层；rpe：视网膜色素上皮层；比例尺：100μm(图8a，图8b)；50μm(图8c，图8d)。

具体实施方式

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。

在本发明中，所述血小板反应蛋白1的氨基酸序列优选如seqidno:1所示(mglawglgvlflmhvcgtnripesggdnsvfdifeltgaarkgsgrrlvkgpdpsspafriedanlippvpddkfqdlvdavraekgflllaslrqmkktrgtllalerkdhsgqvfsvvsngkagtldlsltvqgkqhvvsveeallatgqwksitlfvqedraqlyidcekmenaeldvpiqsvftrdlasiarlriakggvndnfqgvlqnvrfvfgttpedilrnkgcssstsvlltldnnvvngsspairtnyighktkdlqaicgiscdelssmvlelrglrtivttlqdsirkvteenkelanelrrpplcyhngvqyrnneewtvdsctechcqnsvtickkvscpimpcsnatvpdgeccprcwpsdsaddgwspwsewtscstscgngiqqrgrscdslnnrcegssvqtrtchiqecdkrfkqdggwshwspwsscsvtcgdgvitrirlcnspspqmngkpcegearetkackkdacpinggwgpwspwdicsvtcgggvqkrsrlcnnptpqfggkdcvgdvtenqicnkqdcpidgclsnpcfagvkctsypdgswkcgacppgysgngiqctdvdeckevpdacfnhngehrcentdpgynclpcpprftgsqpfgqgvehatankqvckprnpctdgthdcnknakcnylghysdpmyrceckpgyagngiicgedtdldgwpnenlvcvanatyhckkdncpnlpnsgqedydkdgigdacdddddndkipddrdncpfhynpaqydydrddvgdrcdncpynhnpdqadtdnngegdacaadidgdgilnerdncqyvynvdqrdtdmdgvgdqcdncplehnpdqldsdsdrigdtcdnnqdidedghqnnldncpyvpnanqadhdkdgkgdacdhdddndgipddkdncrlvpnpdqkdsdgdgrgdackddfdhdsvpdiddicpenvdisetdfrrfqmipldpkgtsqndpnwvvrhqgkelvqtvncdpglavgydefnavdfsgtffinterdddyagfvfgyqsssrfyvvmwkqvtqsywdtnptraqgysglsvkvvnsttgpgehlrnalwhtgntpgqvrtlwhdprhigwkdftayrwrlshrpktgfirvvmyegkkimadsgpiydktyaggrlglfvfsqemvffsdlkyecrdp)。

在本发明中，所述年龄相关性黄斑变性(amd)优选包括非新生血管型年龄相关性黄斑变性(干型amd)和新生血管型年龄相关性黄斑变性(湿型amd)。干性amd与视网膜色素上皮细胞(rpe)的损伤和死亡以及光感受器的退化有关，湿性amd通常归因于脉络膜新生血管(cnv)的形成，从而严重影响患者视力。结果表明，血小板反应蛋白1(thbs-1)比抗vegf治疗在抑制病理性血管生成中显示出更明显的功效，thbs-1具有成为当前治疗方案的辅助治疗或替代治疗的潜力。

在本发明中，amd的一个重要发病的病理过程还包括视网膜炎症，当视网膜色素上皮细胞受到损伤导致视网膜出现病理性炎症和/或血管生成反应。实验结果表明，thbs-1在体外和体内对蓝光诱导的视网膜损伤具有良好的保护作用。同时thbs-1的抗炎功能是抗vegf药物所没有的，其双重的抗炎抗血管功能可以避免患者不必要的负担。

在本发明中，所述血小板反应蛋白1的使用剂量每眼优选不低于1.2ng/g体重小鼠。在体外研究中，所述血小板反应蛋白1的使用浓度不低于4nm。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗视网膜炎症的药物中的应用。

在本发明中，所述视网膜炎症优选由蓝光诱导所致。所述视网膜炎症的预防和/或治疗方法优选包括降低视网膜中mcp-1和cd68的表达。在动物体内，蓝光诱导的小鼠视网膜中mcp-1(单核细胞趋化蛋白)和cd68(炎性单核细胞标志物)高表达，而在用thbs-1治疗后有明显减少。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备抑制病理性新生血管形成的药物中的应用。所述病理性新生血管优选包括脉络膜新生血管。

在本发明中，针对年龄相关性黄斑变性(amd)或其他新生血管型视网膜疾病，目前临床上最常用的治疗手段是玻璃体腔内注射抗血管内皮生长因子(vegf)的单克隆抗体。因此，以抗vegf治疗作为阳性对照用于病理性新生血管形成的治疗中，光谱域光学相干断层扫描(sd-oct)和(b)荧光素血管造影结果均显示血小板反应蛋白1(thbs-1)比抗vegf治疗在抑制病理性血管生成中显示出更明显的功效。

本发明提供了血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗视网膜损伤的药物中的应用。

在本发明中，所述视网膜损伤优选包括视网膜色素上皮细胞损伤。视网膜色素上皮细胞作为全身血液循环和神经视网膜之间的桥梁，负责通过视网膜和邻近组织之间的物质交换，维持视网膜下间隙炎症反应和血管生成反应之间的平衡，当rpe受到不利刺激(如蓝光)的损害时，易发生视网膜炎症和血管生产反应。采用形态学和视网膜电图分析双重方法评估视网膜视功能，结果表明，thbs-1对蓝光照射视网膜视功能的显著保护作用。本发明发现thbs-1起效的机制是其与受体cd36结合所诱导的，因此，选取其cd36结合的功能肽段也可以达到相同的效果。

下面结合实施例对本发明提供的血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

血小板反应蛋白1(thbs-1)可有效抑制蓝光诱导的视网膜炎症反应

1.细胞培养

arpe-19细胞(人视网膜色素上皮细胞细胞系)购于中国科学院上海细胞库。将细胞培养于含有10％的fbs和1％的青霉素-链霉素双抗的高葡萄糖dmem培养基中，放置于37℃和5％co2的培养箱中培养，约2～3天后进行1:3的细胞传代。

2.thbs-1给药处理

在体外实验中，将4nm重组人血小板反应蛋白-1(thbs-1)以血清饥饿状态添加到细胞中，并在蓝光照射前培养至少6小时。

3.细胞分组说明

thbs-1给药处理+蓝光照射组：以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，按照上述项2的方法处理细胞后，培养6h后进行蓝光照射24h时间(蓝光的波长为426nm)。

蓝光照射组：将上述培养的arpe-19细胞以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，蓝光照处理24h时间。

对照组：上述培养的arpe-19细胞以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，不经过蓝光照射。

3.cck-8实验

使用cck-8试剂评估上述三组arpe-19细胞的细胞活性，分别于处理的各个时间点时，于每孔中加入10μl的cck-8试剂，将arpe-19细胞与cck-8试剂于37℃孵育4小时。孵育完毕后，使用epoch2酶标仪在波长450nm处测量吸光度。以各组0h时的吸光度值作为100％，进行归一化处理。

4.活/死细胞染色实验

以每孔4×10⁴个细胞的密度将arpe-19细胞(包括thbs-1给药处理+蓝光照射组和不经蓝光照射组)接种于24孔板中，光照实验组的细胞接受蓝光照射处理24小时，利用活/死细胞染色实验评估蓝光照射后arpe-19细胞的细胞活性，采用活/死细胞染色试剂盒(invitrogen)对24孔培养板中培养的arpe-19细胞进行染色。将活细胞染色试剂钙黄绿素与死细胞染色试剂pi溶液加入培养液中孵育细胞15分钟，用荧光显微镜随机选取视野拍摄并记录。

5.rna提取，逆转录和实时定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)

1)细胞总rna的抽提

将待提取rna的细胞(包括thbs-1给药处理+蓝光照射组和蓝光照射组)用pbs轻柔地润洗一遍，之后每个样本中加入1ml的trizol，用移液枪充分吹打均匀，冰上裂解10分钟后，将裂解的细胞液全部转移至干净的1.5ml的无核酶ep管中。在每个ep管中加入500μl的氯仿，在涡旋仪上剧烈涡旋30秒，于冰上静置5分钟。预冷4℃离心机，在4℃下，12,000rpm，离心20分钟。小心吸取上清500μl至新的ep管中，小心不要吸到下面的成分，以免影响核酸的纯度。加入等体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，-20℃下静置2小时。之后再12,000rpm，4℃离心15分钟，之后弃掉上清液后，每管中加入1ml的75％冰乙醇(depc水+无水乙醇配制)，洗涤沉淀。12,000rpm，4℃离心15分钟，弃上清，将ep管中的液体风干，之后加入适量的depc水重溶沉淀。用nanodrop分光光度计检测od260/od280，检测抽提纯度以及核酸浓度。

2.)逆转录

使用takara的primescripttm反转录试剂盒进行rna的逆转录，每个样本rna的提取总量为1μg，加入4μl5×primescripttm缓冲液，1μlprimescripttm酶，1μlrandom6mers，加入rna体积为1000/rna浓度，加depc水补充至20μl的体系。逆转录pcr仪循环参数：37℃15分钟，85℃5秒，降温至4℃，将逆转录后的样品放入-20℃保存。

3)qpcr反应

qpcr反应体系为1μl稀释10倍的cdna、5μlpowersybrgreenpcrmastermix酶、1μl稀释10倍的目的基因引物(见表1)、3μl的depc水。qpcr循环反应条件如表2所示。取384孔板上加样，封膜，384孔板以2000rpm离心2分钟。放置384板入qpcr反应仪器，将反应体系设定为10μl，扩增40个循环，最终以△△ct分析结果。

表1qpcr引物信息

表2qpcr反应条件

6.蛋白质印迹(westernblot)实验

配制含有ripa、100×的蛋白酶抑制剂和100×的磷酸酶抑制剂的裂解液，用pbs润洗一遍细胞，当检测vegfr2磷酸化及下游通路磷酸化的实验中，20ng/ml的vegf加入细胞孵育30分钟后进行蛋白提取。加入配制好的蛋白裂解液后，置于冰上裂解半小时。收集蛋白裂解液于干净的1.5ml规格的ep管中，在冰上超声6次，每次保持10秒后再停顿10秒。预冷4℃离心机，以12000rpm转速离心20min。取上清于新的1.5mlep管中，准备进行蛋白定量分析。取bca蛋白定量试剂盒(thermofisher)，按a液：b液＝50：1的比例配制bca定量试剂。取蛋白标准品设置不同的浓度梯度，以绘制标准曲线。96孔板中每孔加入不同含量的蛋白标准品和相同体积的蛋白样品。每孔中再加入150μl的bca定量试剂，于37℃中孵育30分钟，用酶标仪在539nm波长下测定吸光度。用excel表格分析数据并绘制蛋白浓度的标准曲线，分别以吸光度和浓度作为坐标轴，拟合公式，将测得的吸光度代入公式中，得到蛋白样品浓度，以确定最终蛋白上样量。

在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳之前先配制sds-page凝胶，根据定量的结果决定每个样本的上样量，80v电压30分钟，120v电压40分钟。待蛋白条带分离开后，停止sds-page凝胶电泳，进行蛋白质转运，转膜前预先将pvdf膜在甲醇中激活，转膜液预先放入冰中预冷。在4℃中以200～300ma的恒流转膜一定时间，具体时间根据蛋白分子量决定。转膜后用5％的bsa或5％的脱脂奶粉室温封闭1小时，之后用特定的抗体孵育pvdf膜于4℃过夜。孵育一抗完毕后，用tbst洗膜三次，每次10分钟。之后孵育与一抗对应种属的带hrp结合位点的二抗，室温孵育1小时。孵育二抗后，用tbst洗膜3次，每次10分钟。配制hrp显影液，利用扫描仪进行扫膜记录。

7.免疫细胞化学实验

将arpe-19细胞(包括thbs-1给药处理+蓝光照射组和蓝光照射组)接种于铺有细胞爬片的12孔板或24孔板上，蓝光处理后，将细胞用pbs漂洗一遍，然后用4％的多聚甲醛固定30分钟。pbs漂洗三遍后用含有0.3％tritonx-100和10％山羊血清的封闭液封闭细胞1小时。封闭后，使用不同的一抗于4℃孵育细胞过夜。一抗孵育完毕后，用pbs漂洗细胞三次，每次5分钟，使用带有荧光探针的二抗孵育细胞，避光孵育1小时，接着用dapi复染细胞核15分钟。细胞爬片倒置在载玻片上，利用荧光显微镜随机选取三个视野拍摄细胞。

实验结果

1.蓝光照射诱导arpe-19细胞炎症因子水平异常

炎症被认为是年龄相关性黄斑变性(amd)等视网膜退行性疾病的重要病理过程之一，rpe中的炎症反应在很大程度上促进了视网膜退行性疾病的发展。与对照组(不经蓝光照的arpe-19细胞)相比，与视网膜炎症相关的促炎细胞因子(包括mcp-1，tnf-α，il-1β，il-6和il-8)的基因(图1a)和蛋白(图1b)表达水平显着增加，而免疫抑制细胞因子tgf-β1的表达却下降，暗示了蓝光诱导了rpe细胞的炎症反应。

2.蓝光通过激活nf-κb途径诱导arpe-19细胞的炎症活性

通过检测了多种炎症相关信号通路的核心转录因子，包括iκbα(nf-κb信号通路)，irak-1(toll样受体4信号通路)，c-jun(c-jun/ap1信号通路)，stat3(jak/stat3信号通路)和p38(p38/mapk信号通路)，在调节这些信号通路的核心转录因子中，irak-1、c-jun、stat3和p38均未表现出明显的磷酸化激活(图2a)，而iκbα在蓝光暴露的arpe-19细胞中表现出明显的磷酸化激活作用，此外，nf-κbp65(iκbα的下游)在细胞质中的蛋白表达下调，而在细胞核中的蛋白表达增加(图2b)，在暴露于蓝光的arpe-19细胞中，通过免疫细胞化学实验观察到nf-κbp65的核转位显着增加(图2c)，这暗示着促炎细胞因子的上调主要是由蓝光中的nf-κb信号通路介导引起rpe炎症。在p-iκbα抑制剂bay11-7082处理后，促炎细胞因子升高的蛋白水平被显着逆转(图2d)，进一步证实了在蓝光诱导的炎症中nf-κb炎症通路激活。数据表明，蓝光通过刺激rpe细胞中iκbα的磷酸化并进一步增加nf-κbp65的核转位，从而激活了nf-κb炎症通路，最终激活了多种下游促炎性细胞因子的转录。

3.thbs-1通过抑制nf-κb通路来抑制蓝光引起的视网膜炎症

基于前面的研究，已经知晓蓝光通过激活nf-κb信号通路介导了视网膜的炎症因子的表达异常，为了探究thbs-1在蓝光诱导的炎症中是否发挥作用，首先探究了thbs-1对蓝光照射的arpe-19细胞中nf-κb信号通路相关蛋白表达水平的影响。westernblot结果表明，thbs-1处理后，蓝光介导的iκbα的磷酸化激活和nf-κbp65的核转位受到抑制(图3a)，表明thbs-1能够抑制由蓝光诱导激活的nf-κb炎性信号通路。qpcr(图3b)和westernblot(图3c)结果表明，蓝光可诱导arpe-19细胞中nf-κb下游炎症因子水平升高，包括mcp-1，tnf-α，il-1β，il-6和il-8，而免疫抑制细胞因子tgf-β1的表达水平在蓝光照射后降低，而thbs-1可显著降低蓝光诱导的促炎因子的表达以及增加tgf-β1的表达。同样，通过thbs-1处理，蓝光诱导的小鼠视网膜中mcp-1和cd68(炎性单核细胞的标志物)阳性细胞的数量也显着降低(图3d～图3e)，这表明thbs-1能够显着抑制炎症反应以及蓝光暴露后随后的巨噬细胞/单核细胞募集进入免疫豁免的视网膜下区域。综上，结果表明thbs-1通过抑制nf-κb信号通路在抑制蓝光诱导的视网膜炎症中发挥关键作用(图3f)。

实施例2

血小板反应蛋白1(thbs-1)可有效抑制病理性新生血管形成

一、hmec-1细胞水平实验

1.细胞培养

hmec-1细胞(人微血管内皮细胞细胞系)购于美国atcc细胞库。将细胞培养于含有5％的fbs，1％的青霉素-链霉素双抗和1％的内皮细胞生长补充剂(ecgs)的ecm(内皮细胞培养基)中，置于37℃、5％co2的培养箱中培养，每天半换液，约2～3天后进行1:2的细胞传代。

2.thbs-1给药处理

在检测hmec-1细胞磷酸化蛋白表达时，用4μm的thbs-1溶液在血清饥饿状态下预处理细胞6h，在不加ecgs的培养基中加入20ng/ml的vegf30min。

3.细胞分组

thbs-1给药处理+vegf处理组：以密度8×10³细胞/孔的细胞接种在96孔板中，按照上述项2的方法用thbs-1处理细胞后，培养6h后添加20ng/ml的vegf处理30min。

vegf处理组：将密度8×10³细胞/孔的细胞接种在96孔板中，20ng/ml的vegf30min。

对照组：密度8×10³细胞/孔的细胞接种在96孔板中，不经过任何处理。

4.edu细胞增殖检测

当细胞融合达到60％～80％时，将细胞在低血清培养基(1％fbs)中饥饿12小时，以使细胞在随后的处理之前保持相同的增殖周期。在相应的时间点之后，通过使用edu试剂盒(锐博生物，中国)进行edu分析以评估细胞的增殖活性。具体步骤如下：配制甘氨酸溶液，以及含有0.5％的tritonx-100的pbs渗透液，用细胞培养液稀释edu试剂，制备edu培养基，用edu培养基孵育细胞2小时，pbs漂洗一到两次。然后，使用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，每孔加入2mg/ml的甘氨酸溶液，孵育5分钟后pbs漂洗，然后每孔加入0.5％tritonx-100的pbs孵育10分钟，接着pbs漂洗一次。然后用apollo染料重新着色，孵育30分钟，再加入渗透剂清洗10分钟。之后，将细胞与dapi一起温育30分钟。然后，使用荧光显微镜(nikon)随机选择视野拍摄。用imagej软件定量，以增殖率＝(edu阳性细胞/dapi染色细胞)×100％测定细胞增殖率。

5.细胞划痕实验

当hmec-1细胞融合度达到100％后，使用200μl移液管尖端在单层细胞上制造一个粗细均匀的划痕，用pbs将刮下的细胞碎片冲洗掉。用含1％fbs的新鲜培养基再次孵育细胞，使细胞处于血清饥饿状态，以排除增殖效应。接着在光学显微镜下拍摄并记录0小时时刻的划痕图像。在48小时后，拍摄并记录0小时记录的相同划痕位置的图像。最后的划痕融合面积由imagej定量计算，以评估细胞的横向迁移能力。

6.transwell实验

用孔径为8.0μm的transwell小室进行hmec-1细胞的纵向迁移能力检测。将200μl的细胞(4×10⁴个)接种到24孔板中transwell小室中，thbs-1处理组的细胞在上室培养液中加入4nm的4nmthbs-1，同时将800μl有或没有20ng/ml的vegf的ecm培养液添加到下室中。培养24小时后取出transwell小室，用pbs小心地润洗一遍后，用4％多聚甲醛固定30分钟。之后用蘸湿的棉签小心地将未迁移过去的细胞从transwell的上表面擦去。接着，经过迁移的细胞用1％的结晶紫溶液染色15分钟，染色完成后将小室风干，在显微镜下采集图像，用imagej软件定量迁移的细胞数量。

7.细胞成管实验

预先将保存于-20℃凝固的matrix胶(美国康宁)于4℃化开，置于冰上，24孔板置于冰上预冷，200μl的吸头置于-20℃中预冷。用预冷的吸头吸取matrix胶200μl均匀涂到24孔板上并在37℃温箱中孵育1小时，使matrix胶凝固成固态。然后，将4×10⁴个/孔的hmec-1细胞接种于铺有matrix胶的24孔板中，vegf组及vegf+thbs-1组中加入20ng/ml的vegf，thbs-1组中加入4nm的thbs-1。将细胞继续孵育5～8h之后，用光学显微镜(nikon)进行拍摄，随机选取视野。重复三次实验，通过imagej软件计算节点数、分支数和管腔数，进行定量，确定并比较各组hmec-1细胞的成管能力。

实验结果

1.蓝光照射后的arpe-19细胞条件培养基诱导hmec-1细胞的血管生成活性

在生理条件下，视网膜下区域是一个无血管的区域。考虑到视网膜下区域的病理性新生血管形成是amd等视网膜退行性疾病中除炎症之外的另一个关键病理过程，接下来探讨蓝光是否会导致异常的血管活性激活。将来自暴露于蓝光的arpe-19细胞的条件培养基(bl-cm)与hmec-1细胞(人微血管内皮细胞系)共培养模拟rpe细胞对血管生成平衡的调节作用。血管内皮细胞的增殖、迁移和成管能力是评估血管内皮细胞血管生成活性的重要指标，在这里，通过bl-cm或来自未处理的rpe细胞的培养基处理hmec-1细胞，通过评估其增殖，迁移和成管能力来评估其血管生成反应的激活情况。edu实验的结果表明，用bl-cm处理后，edu阳性细胞的比例明显增加，表明hmec-1细胞的增殖活性升高(图4a)。此外，分别通过划痕实验(图4b)和transwell实验(图4c)表明，相对于对照组细胞，bl-cm处理的hmec-1细胞的横向和纵向迁移能力显着增强。成管实验是检测血管生成反应最重要的参数之一，成管实验结果分析表明，与对照组细胞相比，bl-cm处理的细胞成管的分支、结节和管腔数量明显增，证明bl-cm组中hmec-1细胞的成管能力显着增强(图4d)。这些数据表明，通过用bl-cm处理，hmec-1细胞的血管生成反应被显着激活，模拟了rpe细胞对血管生成平衡的调节作用受到外界蓝光暴露而损伤。

2.thbs-1抑制了hmec-1细胞中vegf介导的血管活性反应

基于以上机制，接下来探讨了thbs-1在体外hmec-1细胞中调节血管生成反应中的作用。edu实验的结果表明，thbs-1显着抑制vegf诱导的内皮细胞增殖(图5a-图5b)。通过划痕实验(图5c-图5d)和transwell实验(图5e-图5f)显示，与未处理的对照细胞相比，vegf显着促进了hmec-1细胞的横向迁移和纵向迁移，而这种促进作用受到thbs-1的显著抑制。此外，通过成管试验评估了thbs-1对hmec-1成管能力的影响(图5g)，通过成管结果中结节数、分支数和管腔数的定量结果表明thbs-1显着抑制了vegf诱导hmec-1的成管能力(图5h～图5j)。这些结果表明了thbs-1在体外对血管生成的有效抑制作用。

二、动物模型水平实验

1.动物材料介绍

以8周龄雄性c57bl/6j小鼠为实验对象，将其置于特定的无病原体(spf)环境中，12小时的日夜循环。所有实验均按照视觉和眼科研究协会(arvo)的动物实验标准进行，同时获得上海交通大学医学院附属第九人民医院动物伦理专业委员会的批准实施。

2.视网膜蓝光损伤模型构建

所有小鼠分为两组：(1)未经任何处理的小鼠(对照组)；(2)蓝光照射组(bl组)，蓝光照射组小鼠暴露于led蓝光下7天，随后保持12小时蓝光-黑暗循环(光周期比：12h/12h)。每3小时用含托品酰胺(0.5％)和苯肾上腺素(0.5％)的滴眼液进行一次瞳孔扩张。一周后，处死部分小鼠，采集眼球进行后续分析。

3.视网膜蓝光损伤模型分组

所有小鼠分为三组：(1)未经任何处理的小鼠(对照组)(2)蓝光照射前1天玻璃体腔注射pbs的小鼠(bl组)；(3)蓝光照射前1天玻璃体腔注射10μg/mlthbs-1的小鼠(bl+thbs-1组)。给药后1天，bl组和bl+thbs-1组小鼠暴露于led蓝光下7天，随后保持12小时蓝光-黑暗循环。每3小时用含托品酰胺(0.5％)和苯肾上腺素(0.5％)的滴眼液进行一次瞳孔扩张。一周后，处死所有小鼠，采集眼球进行后续分析。

4.免疫组织化学实验

小鼠的眼球被取出并立即储存在fas眼球固定剂(servicebio)中。将石蜡包埋的组织块切成约5μm的厚度，用抗vegf的抗体染色。用荧光二抗(alexafluor488/594，invitrogen，1:500)结合一抗。在显微镜下进行摄片，所有的图像都是从每个切片的至少三个区域随机拍摄的。使用imagej程序对整个视网膜的onl厚度进行量化。

5.激光诱导cnv模型及给药处理

小鼠深度麻醉后，用美多丽散瞳剂扩散小鼠的瞳孔，将自制的小鼠角膜接触镜置于小鼠的角膜上以便于放大并观察眼底。设置调节氩激光光凝仪器参数：波长为532nm，功率为575mw，曝光时间为50ms，光斑大小为50μm。将小鼠置于裂隙灯平台，通过裂隙灯观察小鼠眼底，进行激光光凝，打4到5个激光斑在视盘周围避开血管的地方，不要离视盘距离太远，以免眼底照相无法拍摄到整体。光凝术后7天，新生血管逐渐形成，此时将所有小鼠随机分为3组，分别为：(1)激光处理1周后玻璃体腔注射3μlpbs(pbs组)；(2)激光处理1周后玻璃体腔注射3μl10μg/mlthbs-1(thbs-1组)；(3)玻璃体腔注射3μl10mg/ml抗vegf(lucentis，novartis)(anti-vegf组)。

6.视网膜光学相干断层扫描(sd-oct)和荧光素血管造影(fa)

cnv造模后7天、14天和21天分别进行sd-oct和fa检测。激光光凝7天后，脉络膜新生血管基本形成，此时根据分组分别于玻璃体腔内注射pbs(作为阴性对照组)、thbs-1或anti-vegf(作为阳性对照组)。用水合氯醛将小鼠麻醉后，托吡卡胺苯肾上腺素滴眼液用于扩散瞳孔。然后将小鼠置于sd-oct系统(德国海德堡工程公司)的平台上，获得sd-oct的结果。腹腔注射50μl10％荧光素钠(alcon)溶液，采用sd-oct系统(德国海德堡工程公司)对眼底荧光素血管造影(fa)进行成像。用imagej软件定量荧光强度，测量荧光素渗漏水平。

7.统计分析

所有当前统计数据均为至少三次独立重复试验的结果，并以平均值±标准差表示。在两个独立组之间，数据通过student’st检验进行分析，在三组及三组以上实验组之间的统计分析，使用单因素方差分析进行统计，然后在多个组之间进行lsd事后t检验。在时间相关数据分析中，对不同实验组的每个时间点分别进行统计分析。以p<0.05认为具有统计学意义。图中分别用*和**标注p<0.05和p<0.01。

实验结果

1.thbs-1抑制c57bl/6小鼠的脉络膜新生血管形成

基于thbs-1对体外血管生成反应的抑制活性，进一步研究了thbs-1在动物实验中体内抗血管生成方面的潜力。在暴露于蓝光的c57bl/6小鼠中，观察到了视网膜rpe周围中vegf的大量表达，vegf是视网膜新生血管疾病中促进血管形成的最主要的因子，而thbs-1处理显着降低了视网膜下间隙中vegf的水平(图6a)。为了更好得评估thbs-1在视网膜中的抗血管能力，因此建立了激光诱导的脉络膜新生血管(cnv)的小鼠模型，该模型作为cnv的金标准模型广泛用于研究新生血管型视网膜退行性疾病中。抗vegf治疗是目前治疗amd等新生血管型视网膜退行性疾病的主要方法，因此，将抗vegf处理组作为阳性对照组，pbs处理组作为阴性对照组。在成功建立新生血管模型(激光损伤后7天)后，按照分组分别将3μl的pbs、thbs-1和anti-vegf注入不同组别的小鼠玻璃体腔内。sd-oct扫描获得激光损伤图像显示，与pbs治疗组相比，thbs-1治疗组和抗vegf治疗组(图6b)激光诱导的cnv损伤(如红色箭头所示)的厚度减少。如荧光素血管造影(fa)所示，pbs处理的小鼠脉络膜病理性新生血管呈连续性渗漏。与给药前造模的区域相比，thbs-1治疗和anti-vegf治疗在给药后第14天分别显著降低了新血管渗漏面积约85％和70％(图6c～图6d)。值得注意的是，thbs-1与抗vegf治疗效果相当，thbs-1在减少新生血管渗漏方面的疗效甚至优于抗vegf抗体。综上，这些数据表明thbs-1通过cd36抑制vegf介导的vegfr2信号通路，在体内外均能有效抑制血管生成。

实施例3

血小板反应蛋白1(thbs-1)可显著保护视网膜免受蓝光诱导的视网膜损伤

一、arpe-19细胞水平实验

1.细胞培养

arpe-19细胞(人视网膜色素上皮细胞细胞系)购于中国科学院上海细胞库。将细胞培养于含有10％的fbs和1％的青霉素-链霉素双抗的高葡萄糖dmem培养基中，放置于37℃和5％co2的培养箱中培养，约2～3天后进行1:3的细胞传代。

2.thbs-1给药处理

在体外实验中，将4nm重组人血小板反应蛋白-1(thbs-1)以血清饥饿状态添加到细胞中，并在蓝光照射前培养至少6小时。

3.细胞分组

thbs-1给药处理+蓝光照射组：以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，按照上述项2的方法处理细胞后，培养6h后进行蓝光照射24h时间(蓝光的波长为426nm)。

蓝光照射组：将上述培养的arpe-19细胞以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，蓝光照处理24h时间。

对照组：上述培养的arpe-19细胞以8×10³细胞/孔的密度接种在96孔板中，不经过蓝光照射。

4.rna提取、逆转录和实时定量聚合酶链式反应(rt-qpcr)

按照实施例1的方法检测arpe-19细胞中紧密连接蛋白occludin和zo-1的基因的表达水平，occludin和zo-1的基因的扩增引物如表3所示。qpcr循环反应条件如上述表2所示。取384孔板上加样，封膜，384孔板以2000rpm离心2分钟。放置384板入qpcr反应仪器，将反应体系设定为10μl，扩增40个循环，最终以△△ct分析结果。

表3qpcr引物信息

4.免疫细胞化学分析

按照实施例1中记载的方法对细胞进行免疫细胞化学分析。

5.edu细胞增殖检测

当细胞融合达到60％-80％时，将细胞在低血清培养基(1％fbs)中饥饿12小时，以使细胞在随后的处理之前保持相同的增殖周期。在相应的时间点之后，通过使用edu试剂盒(锐博生物，中国)进行edu分析以评估细胞的增殖活性。具体步骤如下：配制甘氨酸溶液，以及含有0.5％的tritonx-100的pbs渗透液，用细胞培养液稀释edu试剂，制备edu培养基，用edu培养基孵育细胞2小时，pbs漂洗一到两次。然后，使用4％多聚甲醛固定细胞30分钟，每孔加入2mg/ml的甘氨酸溶液，孵育5分钟后pbs漂洗，然后每孔加入0.5％tritonx-100的pbs孵育10分钟，接着pbs漂洗一次。然后用apollo染料重新着色，孵育30分钟，再加入渗透剂清洗10分钟。之后，将细胞与dapi一起温育30分钟。然后，使用荧光显微镜(nikon)随机选择视野拍摄。用imagej软件定量，以增殖率＝(edu阳性细胞/dapi染色细胞)×100％测定细胞增殖率。

6.活/死细胞染色实验

以每孔4×10⁴个细胞的密度将arpe-19细胞(包括thbs-1给药处理+蓝光照射组和蓝光照射组)接种于24孔板中，光照实验组的细胞接受蓝光照射处理24小时，利用活/死细胞染色实验评估蓝光照射后arpe-19细胞的细胞活性，采用活/死细胞染色试剂盒(invitrogen)对24孔培养板中培养的arpe-19细胞进行染色。将活细胞染色试剂钙黄绿素与死细胞染色试剂pi溶液加入培养液中孵育细胞15分钟，用荧光显微镜随机选取视野拍摄并记录。

7.蛋白质印迹(westernblot)实验

按照实施例1记载的蛋白质印迹(westernblot)实验方法检测紧密连接蛋白(occludin和zo-1)的表达水平。

二、动物模型水平实验

1.视网膜蓝光损伤模型构建

所有小鼠分为两组：(1)未经任何处理的小鼠(对照组)；(2)蓝光照射组(bl组)，蓝光照射组小鼠暴露于led蓝光下7天，随后保持12小时蓝光-黑暗循环(光暗周期比12h:12h)。每3小时用含托品酰胺(0.5％)和苯肾上腺素(0.5％)的滴眼液进行一次瞳孔扩张。一周后，处死部分小鼠，采集眼球进行后续分析。

2.视网膜蓝光损伤模型分组

所有小鼠分为三组：(1)未经任何处理的小鼠(对照组)(2)蓝光照射前1天玻璃体腔注射pbs的小鼠(bl组)；(3)蓝光照射前1天玻璃体腔注射10μg/mlthbs-1的小鼠(bl+thbs-1组)。给药后1天，bl组和bl+thbs-1组小鼠暴露于led蓝光下7天，随后保持12小时蓝光-黑暗循环。每3小时用含托品酰胺(0.5％)和苯肾上腺素(0.5％)的滴眼液进行一次瞳孔扩张。一周后用于后续分析。

3.视网膜电图(erg)

将小鼠在黑暗环境中暗适应24小时后进行erg分析。将这些小鼠置于昏暗的红光下进行麻醉和扩瞳。在整个试验过程中，小鼠置于一暖垫上，以排除干扰刺激。接地电极连接在尾部，参考电极连接在前额。在小鼠角膜上放置两个金环电极，并使用espione3仪器(diagnosys，boxborough，ma)记录视网膜对光刺激的反应。首次用10cd*s/m²的单次闪光刺激诱发暗视erg。在30cd*s/m²的闪光强度下进行erg，然后进行5分钟的明亮适应。a波振幅测量从基线到最低负电压的电压值，b波振幅测量从a波的波谷到b波的波峰。

实验结果

1.蓝光照射影响arpe-19细胞的紧密连接

视网膜色素上皮细胞(rpe)的紧密连接功能是rpe作为血视网膜屏障的保障，对于维持视网膜稳态至关重要。通过检测了rpe细胞紧密连接蛋白occludin和zo-1的基因和蛋白表达水平，qpcr结果表明，短波蓝光照射24小时后occludin和zo-1的mrna表达水平降低(图7a)，免疫细胞化学结果显示，正常rpe细胞中，occludin和zo-1完整表达在细胞与细胞之间的连接处，而短波蓝光照射24小时后，occludin和zo-1表达明显降低(图7b)，进一步支持了蓝光可以诱导rpe细胞紧密连接蛋白的损伤，导致rpe细胞紧密连接功能损害，模拟了视网膜退行性疾病的视网膜损伤改变。

2.thbs-1对视网膜(rpe)蓝光损伤的保护作用

基于thbs-1抗炎和抗血管生成作用机制研究，进一步探讨了thbs-1是否在保护视网膜(rpe)免受蓝光诱导的损伤中发挥一定的作用。根据edu实验(图8a)，活/死细胞染色(图8b)结果表明，thbs-1显着恢复了经蓝光照射降低的arpe-19细胞的增殖能力以及细胞活力。为了从分子角度表征thbs-1治疗的有效性，通过免疫细胞化学分析了rpe特异性紧密连接蛋白occludin和zo-1的蛋白质表达水平，thbs-1可显着挽救暴露于蓝光的arpe-19细胞中紧密连接蛋白表达降低(图8c)。这些结果表明，thbs-1可保护体外rpe细胞蓝光诱导的损伤。

综上所述，thbs-1可以通过抑制nf-κb和vegfr2信号通路达到抗炎抗血管的双重作用，抑制蓝光诱导的视网膜炎症和新生血管形成，缓解视网膜结构与功能的紊乱，体现出thbs-1对视网膜退行性疾病视网膜损伤优良的保护作用。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属第九人民医院

<120>血小板反应蛋白1在制备预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用

<160>17

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>1170

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metglyleualatrpglyleuglyvalleupheleumethisvalcys

151015

glythrasnargileprogluserglyglyaspasnservalpheasp

202530

ilephegluleuthrglyalaalaarglysglyserglyargargleu

354045

vallysglyproaspproserserproalapheargilegluaspala

505560

asnleuileproprovalproaspasplyspheglnaspleuvalasp

65707580

alavalargalaglulysglypheleuleuleualaserleuarggln

859095

metlyslysthrargglythrleuleualaleugluarglysasphis

100105110

serglyglnvalpheservalvalserasnglylysalaglythrleu

115120125

aspleuserleuthrvalglnglylysglnhisvalvalservalglu

130135140

glualaleuleualathrglyglntrplysserilethrleupheval

145150155160

glngluaspargalaglnleutyrileaspcysglulysmetgluasn

165170175

alagluleuaspvalproileglnservalphethrargaspleuala

180185190

serilealaargleuargilealalysglyglyvalasnaspasnphe

195200205

glnglyvalleuglnasnvalargphevalpheglythrthrproglu

210215220

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225230235240

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245250255

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260265270

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275280285

thrilevalthrthrleuglnaspserilearglysvalthrgluglu

290295300

asnlysgluleualaasngluleuargargproproleucystyrhis

305310315320

asnglyvalglntyrargasnasngluglutrpthrvalaspsercys

325330335

thrglucyshiscysglnasnservalthrilecyslyslysvalser

340345350

cysproilemetprocysserasnalathrvalproaspglyglucys

355360365

cysproargcystrpproseraspseralaaspaspglytrpserpro

370375380

trpserglutrpthrsercysserthrsercysglyasnglyilegln

385390395400

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405410415

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420425430

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435440445

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450455460

proserproglnmetasnglylysprocysgluglyglualaargglu

465470475480

thrlysalacyslyslysaspalacysproileasnglyglytrpgly

485490495

protrpserprotrpaspilecysservalthrcysglyglyglyval

500505510

glnlysargserargleucysasnasnprothrproglnpheglygly

515520525

lysaspcysvalglyaspvalthrgluasnglnilecysasnlysgln

530535540

aspcysproileaspglycysleuserasnprocysphealaglyval

545550555560

lyscysthrsertyrproaspglysertrplyscysglyalacyspro

565570575

proglytyrserglyasnglyileglncysthraspvalaspglucys

580585590

lysgluvalproaspalacyspheasnhisasnglygluhisargcys

595600605

gluasnthraspproglytyrasncysleuprocysproproargphe

610615620

thrglyserglnpropheglyglnglyvalgluhisalathralaasn

625630635640

lysglnvalcyslysproargasnprocysthraspglythrhisasp

645650655

cysasnlysasnalalyscysasntyrleuglyhistyrserasppro

660665670

mettyrargcysglucyslysproglytyralaglyasnglyileile

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